Name: MR Imaging Molecolare del cancro alla prostata con un piccolo Molecular CLT1 Peptide mirato di contrasto agente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-03T12:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 54 s
Description: Scopri l'imaging molecolare del cancro alla prostata nei topi utilizzando un agente di contrasto MRI mirato al peptide CLT1. Questo metodo consente la rilevazione specifica dei tumori con alta risoluzione.

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Questo lavoro è sostenuto in parte dalla American Heart Association GRA Primavera 09 Postdoctoral Fellowship (09POST2250268) e il NIH R01 CA097465. Apprezziamo il dottor Wen Li e il dottor Vikas Gulani per la prova di protocollo MRI e la configurazione, e la signora Yvonne Parker per la sua assistenza su impianto del tumore.

Protocollo adattato da uno studio preliminare 11. 1. Coniugazione del Gd-DOTA per CLT1 Peptide <ol><li> Utilizzando lo standard di sintesi peptidica in fase solida, sintesi CLT1 peptide (CGLIIQKNEC) da amminoacidi Fmoc-protetti su una resina di cloruro di 2-chlorotrityl (1,0 mmol). </li><li> Dopo l&#39;aggiunta di amminoacidi finale, ciclizzare il peptide lineare in resina con tallio (III) trifluoroacetato (1.09 g, 2.0 mmol, 2 equivalenti) in DMF (20 ml) a 0 ° C per 2 h. </li><li> Successivamente, coniugato PEG e lisina sequenzialmente al N-terminale del peptide CLT1 (1,0 mmol) di resina facendo reagire in sequenza con Fmoc-NH-PEG-COOH (3.0 mmol), Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (3.0 mmol), e un secondo lotto di Fmoc-Lys (Fmoc)-OH (6 mmoli). </li><li> Rimuovere Fmoc con piperidina. Aggiungere DOTA-tris (t-Bu) (4.58 g, 8.0 mmol, 2 equivalenti a ciascun gruppo amminico) per reagire con i quattro ammine libere dal dendrimero lisina sulla resina per 2 h. </li><li> Infine, fendere e deproteggere il prodottodalla resina mediante trattamento con un cocktail di acido trifluoroacetico, acqua, e triisobutylsilane (TIS) (20 ml, 95/2.5/2.5) per 8 ore a temperatura ambiente. Rimuovere la resina mediante filtrazione seguita da lavaggio con acido trifluoroacetico (TFA). Aggiungere filtrati associati a gocce alla etere etilico freddo (200 ml), centrifuga, e lavare con 4x etere etilico. Essiccare sotto vuoto a dare un solido incolore (1,99 g, 61% resa). </li><li> Purificare il prodotto grezzo con HPLC preparativa utilizzando un gradiente di 0-40% di solvente B (0.1% TFA in acetonitrile) in solvente A (0,1% soluzione acquosa TFA) per 20 min e 40-90% di solvente B in solvente A per 10 min . </li><li> Sciogliere CLT1-DL-(DOTA) 4 (250 mg, 0,077 mmol) in acqua deionizzata (15 ml) e portare il pH a 6 con 1 M NaOH. Aggiungere Gd (OAc) 3 .4 H 2 O (472 mg, 0,462 mmol, 1,5 equivalenti a DOTA monoammide) in porzioni alla soluzione, mantenendo il pH a 6 con 1 M NaOH. Mescolare la soluzione di reazione a temperatura ambiente per 48 ore. </li><li> Complesso il residuo Gd (III) con eacido thylenediaminetetraacetic (EDTA) (90 mg, 0,31 mmol), e purificare il prodotto grezzo con una colonna di esclusione dimensionale per dare il prodotto finale CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 (169 mg, 57%). </li></ol> 2. Caratterizzazione di mezzi di contrasto <ol><li> Misurare Gd (III) contenuto con la spettroscopia di emissione al plasma accoppiato induttivamente ottica. </li><li> Acquisire matrix-assisted laser desorbimento / ionizzazione spettri di massa a tempo di volo (MALDI-TOF) in modo lineare con l&#39;acido 2,5-diidrossibenzoico (2,5-DHB) come matrice. </li><li> Misurare tempi di rilassamento della soluzione acquosa dei mezzi di contrasto di CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 e un agente di controllo nontargeted sCLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 con differenti concentrazioni a 60 MHz (1,5 T) con un rilassometro a 37 ° C. Utilizzare una sequenza di impulsi di inversione di recupero per misurare T 1 e una sequenza di Carr-Purcell-Meiboom-Gill con 500 echi per misurare T 2. Calcola T 1 e T 2 relassività di secoloe agenti alle pendici delle trame di 1 / T 1 e 1 / T 2 e le concentrazioni Gd. </li></ol> 3. Cella Cultura e Sviluppo di modello animale con tumore alla prostata PC3 ortotopico <ol><li> Cultura PC3 prostata cellule tumorali con l&#39;espressione costitutiva di proteina fluorescente verde (GFP) in mezzo RPMI supplementato con 5% di siero fetale bovino e penicillina / streptomicina / fungizone, raccolto mediante tripsinizzazione e risospendere alla densità di 2,5 x 10 4 cellule / l di PBS. </li><li> Mantenere maschi NIH topi nudi atimici (4-5 settimane) presso l&#39;impianto di atimico animale core, Case Western Reserve University (CWRU) secondo un protocollo animali approvato dalla Institutional Animal Care ed uso commissione CWRU. </li><li> Le superfici chirurgici sono stati spruzzati con soluzione di clorexidina 2% e poi coperte con teli assorbenti. Guanti chirurgici sterili sono stati indossati durante la procedura. Prima dell&#39;intervento degli animali, ip iniettare Avertin (250 mg / kg) per anesthetizposta i topi. In alternativa, ketamina / xilazina / Acepromazina può essere utilizzato ad una concentrazione di 50/5/1 mg / kg. Pomata oftalmica è stata applicata al mouse per mantenere un&#39;adeguata umidità durante l&#39;anestesia. </li><li> Avviare la chirurgia tagliando una piccola incisione attraverso la pelle e peritoneo lungo la linea mediana inferiore ad una lunghezza di circa 1 cm con un bisturi sterile. Un telo chirurgico sterile era coperto intorno al sito di incisione durante interventi chirurgici di sopravvivenza. </li><li> Esteriorizzare delicatamente e stabilizzare i lobi dorsali prostata per esporre la prostata. Iniettare la sospensione di cellule PC3-GFP in PBS (20 microlitri) nella prostata con un ago da 30 gauge. Infine chiudere l&#39;incisione con ferita AutoClip 12. </li><li> Per il monitoraggio post-procedura, di monitorare gli animali due volte al giorno per 1 settimana. I segni della malattia comprendono la mancanza di cibo, urina raccolta buio intorno all&#39;uretra, e andatura instabile che potrebbe indicare infezione o occlusione della vescica nei punti metallici. </li><li> Dopo 10 giorni, rimuovere tegli graffette con un fiocco di rimozione. Monitorare gli animali ogni giorno per valutare le dimensioni del tumore e le prove di dolore, come la perdita di peso, deviazioni comportamentali, e difetti del motore. Euthanize gli animali che hanno mostrato una dimensione del tumore superiore al limite eticamente consentito o evidenza di dolore durante la crescita del tumore. </li></ol> 4. Conferma della Tumore Legatura specificità dei peptidi con imaging di fluorescenza e Istologia <ol><li> Dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali, permettere circa 4 settimane di crescita tumorale prima di iniziare l&#39;imaging. Prima dell&#39;iniezione delle sonde peptidiche, acquisire immagini di fluorescenza GFP con topi diretta su un imager fluorescenza per verificare la presenza di tumore. </li><li> Iv iniettare Texas Red etichettato peptidi al tumore cuscinetto topi alla dose di 10 nmol / mouse. </li><li> Sacrifica i topi 2 ore più tardi da dislocazione cervicale, raccogliere il tumore e gli organi più importanti, e l&#39;immagine immediatamente su un imager fluorescenza. Utilizzare i filtri di luce verde per GFP (eccitazione: 444-490 nm, emissione: 515 nm filtro passa lungo; impostazioni di acquisizione: 500-720 a passi di 10 nm) e filtri di luce rossa per Texas Red (eccitazione: 576-621 nm, emissione: 635 nm filtro passa lungo; acquisizione Impostazioni: 630-800 a passi di 10 nm). 10 msec tempo di esposizione per la GFP e 150 msec per Texas Red. </li><li> Subito dopo la misura di tutta la fluorescenza dei tessuti, raccoglie tessuti tumorali, fissare con la formalina, e cryosection a fette di 5 micron. </li><li> Dopo il risciacquo con PBS, montare con 1 goccia di soluzione di montaggio contenente 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI), l&#39;immagine immediatamente su un microscopio confocale a scansione laser. </li></ol> 5. Magnetic Resonance Imaging (MRI) <ol><li> Circa 4 settimane dopo l&#39;inoculazione delle cellule tumorali, consentono ai tumori di crescere fino a 0,3-0,6 cm di diametro. Utilizzare uno scanner MRI 7 T con un volume di radio frequenza (RF) bobina per lo studio MRI. </li><li> Anestetizzare il mouse con una miscela ossigeno-isoflurano 2% in una camera di induzione isoflurano. Ophthalmic unguento è stato applicato al mouse per mantenere un&#39;adeguata umidità durante l&#39;anestesia. </li><li> Inserire un ago da 30 gauge in un 1,0 m di lunghezza tubo riempito con soluzione salina eparinizzata. Posizionare il catetere self-made nella vena della coda del mouse. </li><li> Posizionare il mouse nel magnete e tenere sotto anestesia inalatoria con il 1,5% isoflurano-ossigeno attraverso un cono di naso. </li><li> Posizionare un sensore respiratorio collegato ad un sistema di monitoraggio sull&#39;addome per monitorare la frequenza e la profondità della respirazione. Mantenere la temperatura corporea a 37 ° C mediante insufflazione di aria calda all&#39;interno del magnete attraverso un sistema di controllo in retroazione. </li><li> Iniziare con le immagini di sezione sagittale utilizzando una sequenza localizzante per identificare la posizione del tumore (TR / TE = 200/3.7 msec, FOV = 3,0 centimetri, spessore di strato = 2,2 millimetri, numero di slice = 16, media = 2, flip angle = 45 °, matrix = 128 x 128). </li><li> Utilizzare un gradiente sequenza di soppressione del grasso 2D T1-pesate per acquisire immagini assiali 2D per CE-MRI (TR / TE = 151.2/1.9 msec, FOV = 3,0 centimetri x 3,0 centimetri, sSpessore pidocchi = 1,2 mm, numero di slice = 12, media = 1, flip angle = 80 °, matrice = 128 x 128). </li><li> Dopo la pre-iniezione acquisizione delle immagini MR basale, iniziare a iniettare l&#39;agente mirata o agente di controllo ad una dose di 0,03 mmol / kg di Gd mediante flussaggio con 200 ml di soluzione salina. </li><li> Continuare ad acquisire immagini CE-MRI in diversi momenti fino a 30 min. </li></ol> 6. Image Processing and Analysis <ol><li> Utilizzare il software di imaging per l&#39;analisi delle immagini. </li><li> Disegnare le regioni di interesse (ROI) sull&#39;intero tumore ei reni nel piano dell&#39;immagine bidimensionale e misurare l&#39;intensità media del segnale. </li><li> Per quantificare i dati CE-MRI, misurare tumore o enhancement rene (ΔSNR) dal calcolo della maggiorazione in post-contrasto SNR SNR over pre-contrasto utilizzando la seguente equazione: ΔSNR = (S t / σ t) - (S 0 / σ 0), dove S 0 e S T indicano il segnale nel tumo o reni prima e dopo contrasto, e σ 0 e σ t sono la deviazione standard del rumore misurato dall&#39;aria sfondo prima e dopo contrasto. </li><li> Calcolare i valori di p utilizzando due code t-test dello studente, assumendo la significatività statistica p &lt;0.05. </li></ol>

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</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Fasi critiche Selezione di Biomarker corretta e Targeting piccolo peptide Per sviluppare con successo un agente di contrasto mirato con dimensioni ridotte, due punti chiave devono essere considerati. In primo luogo, è importante selezionare marcatori molecolari appropriati che sono abbondantemente presenti in tessuti malati con scarsa presenza nei tessuti normali. Il nostro biomarcatore per cancro selezionata, proteine ​​del plasma coagulato, soddis...

Rappresentazione efficace di bersagli molecolari connessi con il cancro è di grande importanza per migliorare la precisione di rilevamento del cancro precoce e diagnosi. La risonanza magnetica (MRI) è una potente modalità di imaging clinico ad alta risoluzione spaziale e nessuna radiazione di ionizzazione 1. Tuttavia, nessun agente di contrasto mirata è disponibile per l&#39;imaging molecolare cancro MR clinica. Il design innovativo e lo sviluppo di agenti di contrasto per risonanza magnetica mirati sarebbero notevolmente progredire l&#39;applicazione di imaging molecolare cancro MR. Sono stati fatti notevoli sforzi per sviluppare agenti di contrasto mirate per RM dei biomarcatori espressi sulla superficie delle cellule tumorali. A causa della relativamente bassa sensibilità della RM e bassa concentrazione di questi biomarcatori, è una sfida di generare sufficiente aumento del contrasto per l&#39;imaging molecolare RM efficace con piccoli mezzi di contrasto a bersaglio molecolare 2,3. Al fine di ottenere il miglioramento sufficiente, vari sistemi di erogazione such come liposomi, nanoparticelle e polimeri coniugati con un alto carico utile di paramagnetici di Gd (III) chelati sono stati predisposti per aumentare la concentrazione locale di agenti di contrasto ai siti bersaglio 4,5. Sebbene questi sistemi di consegna sono stati in grado di generare un miglioramento significativo del tumore nei modelli animali, loro grandi dimensioni comportato l&#39;eliminazione lenta e incompleta dal corpo, con conseguente accumulo prolungato di Gd (III) ioni tossici, che possono provocare gravi problemi di sicurezza 6. Recentemente, alcuni studi hanno dimostrato che i limiti di MRI per l&#39;imaging molecolare possono essere superati selezionando marcatori molecolari adeguate con elevata espressione locale nelle lesioni e utilizzando piccoli agenti molecolari che possono essere facilmente escreti 7,8. La caratteristica fondamentale di questi agenti è quanto si rivolgono marcatori molecolari abbondantemente presenti nei tessuti malati con scarsa presenza nei tessuti normali. Un&#39;elevata concentrazione di agenti di contrasto in grado di legarsi a questi obiettivi, con conseguente sufficiente miglioramento del contrasto per l&#39;imaging molecolare efficace MR. Poiché la loro dimensione è inferiore alla soglia di filtrazione renale, agenti di contrasto legate possono facilmente essere espulso dal corpo con rumore di fondo ridotto. Abbiamo selezionato un biomarcatore per cancro universale, proteine ​​del plasma coagulato, che esistono in abbondanza nella stroma tumorale, e sono raramente presenti nei tessuti normali 9. Abbiamo sintetizzato un agente di contrasto mirato con un piccolo peptide di targeting CGLIIQKNEC (CLT1), che ha mostrato forte legame al modello di tumore della prostata PC3 10 specifica, e quattro chelati monoammide Gd-DOTA. Qui, forniamo una metodologia di imaging molecolare del cancro MR per rilevare i tumori nei topi.

<table><tr><tbody><td colspan="4">REAGENTS</td></tr><tr><td>Fmoc protected amino acids</td><td>EMD Chemicals Inc</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOTA-tris(t-Bu)</td><td>TCI America</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PyBOP, HOBt, HBTU</td><td>Nova Biochem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DIPEA, Trifluoroacetato di tallio(III), TIS</td><td>Sigma-Aldrich Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Texas Red, estere succinimidilico, isomero singolo</td><td>Invitrogen</td><td>T20175</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">EQUIPMENTS</td></tr><tr><td>Agilent 1100 HPLC system Agilent</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>ZORBAX 300SB-C18 Colonna PrepHT</td><td>Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ICP-&#8211; S Optima 3100XL</td><td>Perkin-Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro di massa MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td>AutoflexTM Speed</td><td></td></tr><tr><td>Maestro FLEX Sistema di imaging in vivo</td><td>Cambridge Research Instrumentation, Inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scanner per risonanza magnetica Biospec 7T</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

mr imaging molecolare del cancro alla prostata con un piccolo molecular clt1 peptide mirato di contrasto agente

MR Molecular Imaging of Prostate Cancer with a Small Molecular CLT1 Peptide Targeted Contrast Agent

Matrice extracellulare tumore ha abbondanza di proteine ​​del cancro correlati che possono essere utilizzate come marcatori per l&#39;imaging molecolare cancro. In questo lavoro, abbiamo dimostrato efficace imaging molecolare del cancro RM con un piccolo peptide molecolare mirata complesso monoammide Gd-DOTA come agente di contrasto per risonanza magnetica mirato specifico alle proteine ​​plasmatiche coagulato in stroma tumorale. Abbiamo eseguito l&#39;esperimento di valutare l&#39;efficacia dell&#39;agente per il rilevamento non invasivo di tumore della prostata con MRI in un ortotopico PC-3 modello di cancro della prostata mouse. Il mezzo di contrasto mirate si è dimostrato efficace per produrre miglioramento significativo contrasto del tumore con una dose bassa di 0,03 mmol Gd / kg. Il peptide mirato agente di contrasto per risonanza magnetica è promettente per l&#39;imaging molecolare RM del tumore alla prostata.

La figura 1 illustra la sintesi del mezzo di contrasto mirato CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 e lo schema complessivo dell&#39;esperimento. CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 mostra relassività molto superiore clinica Gd-DOTA (Tabella 1). A 1,5 T, T 1 relassività per gadolinio di CLT1-DL-(Gd-DOTA) 4 in PBS (pH 7,4) è circa 3 volte superiore a quella di Gd-DOTA 10. Imaging Maestro conferma la forte legame di Texas Red etichettato CLT1 (CLT1-TR) per tumore con un minimo legame ...

Per dimostrare imaging molecolare del cancro RM con un piccolo peptide mirato MRI mezzo di contrasto specifico alle proteine ​​plasmatiche coagulato in stroma tumorale in un modello di cancro alla prostata del mouse.

MR Imaging Molecolare del cancro alla prostata con un piccolo Molecular CLT1 Peptide mirato di contrasto agente

Tumor extracellular  matrix has abundance of cancer related proteins that can be used as biomarkers  for cancer molecular imaging. In this work,  we ...

L'obiettivo generale di questa procedura è eseguire un'immagine molecolare del cancro alla prostata nei topi utilizzando un agente di contrasto peptidico sicuro ed efficace con risonanza magnetica o RM. Imaging molecolare. In primo luogo, si verifica lo sviluppo corretto e le dimensioni adeguate dei tumori ortotopici della prostata nel modello murino di tumore prostatico. Successivamente, la specificità di legame del peptide al tumore viene confermata mediante imaging a fluorescenza e istologia nel modello murino di cancro ortotopico della prostata.Successivamente, viene iniettato l'agente mirato o di controllo, dopo l'acquisizione dell'immagine RM di base pre iniezione. Infine, vengono acquisite immagini RM con contrasto in diversi punti temporali fino a 30 minuti. In definitiva, si possono ottenere risultati che dimostrano come l'agente di contrasto RI mirato al peptide CLT1 possa essere efficace per il rilevamento specifico dei tumori della prostata mediante tecniche di imaging molecolare.Il principale vantaggio della risonanza magnetica molecolare con agenti di contrasto MI mirati rispetto alle tecnologie esistenti come la risonanza magnetica e la PET con agenti di contrasto cl

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Questo articolo descrive la radiosintesi, la formulazione, il controllo di qualità di una nuova sonda radiomarcata (ad esempio, 68nanocorpi marcati con GA NM-02) e il suo utilizzo per l'imaging PET/CT di piccoli animali in un modello di xenotrapianto.

Radiosintesi, controllo di qualità e tomografia a emissione di positroni per piccoli animali di 68nanomolecole marcate con GA

La biopsia prostatica è il metodo diagnostico gold standard per il cancro alla prostata. La biopsia prostatica guidata dalla fusione cognitiva, che combina l'ecografia transrettale con parametri di risonanza magnetica premisurati, migliora l'accuratezza della biopsia e aumenta il tasso di rilevamento del cancro alla prostata clinicamente significativo.

Una biopsia prostatica guidata dalla fusione cognitiva mediante risonanza magnetica multiparametrica ed ecografia transrettale

L'ipertrattamento viene spesso somministrato a pazienti con carcinoma prostatico a basso rischio; La sorveglianza superattiva può aiutare a evitare tale trattamento eccessivo.

Una nuova tecnica per il trattamento del cancro alla prostata a basso rischio: la sorveglianza super attiva

Questa ricerca descrive il processo automatizzato per la produzione di [68Ga]Ga-3BP-3940 con il sintetizzatore GAIA V2, per l'imaging PET della proteina di attivazione dei fibroblasti. Vengono inoltre presentati i risultati dei test di controllo qualità eseguiti su tre lotti di prova.

Preparazione automatizzata di [68Ga]Ga-3BP-3940 su un modulo di sintesi per l'imaging PET del microambiente tumorale

Scopri l'imaging molecolare del cancro alla prostata nei topi utilizzando un agente di contrasto MRI mirato al peptide CLT1. Questo metodo consente la rilevazione specifica dei tumori con alta risoluzione.

MR Imaging Molecolare del cancro alla prostata con un piccolo Molecular CLT1 Peptide mirato di contrasto agente

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