Name: Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T20:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri la registrazione extracellulare dal sistema nervoso intatto dello scarafaggio per studiare l'elaborazione dei segnali sensoriali nel SNC. Questa tecnica elettrofisiologica permette di analizzare l'integrazione neuronale in vivo.

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Ringraziamo Hyewon Cooper per le illustrazioni.

1. Dissezione Soluzione salina scarafaggio utilizzata in questo protocollo ha la seguente composizione: Cockroach soluzione salina 36: (grammi per 100 ml) 210 mM NaCl (1.227 g) 2.9 mM KCl (0,0216 g) 1.8 mM CaCl 2 (0,0265 g) 0.2 mM NaH 2 PO 4 • 2H 2 O (0,0032 g) 1.8 mM Na 2 HPO 4 • 7H 2 O (0,0483 g) (PH 7.2. Regolare il pH con 1 M NaOH o 1 M HCl). <ol><li> Selezionare uno scarafaggio maschio dalla serbatoio che ha robuste Cerci (Figura 1). Gli ultimi segmenti del maschio sono strette rispetto alla femmina, e non contenenti ovaie e massa uovo, i maschi sono più facili da sezionare. I maschi di P. americana hanno un paio di short stili tra i cerci. Questi stili non sono osservati nelle femmine. </li><li> Tagliare le ali, le gambe e la testa e il pin del corpo, ventrale rivolta verso l&#39;alto, ad una dish allineato con elastomero di silicone. </li><li> Con pinze raccogliere le piastre ventrali e tagliarli fuori con le forbici sottili, a partire dalla fine posteriore e di lavoro anteriormente. Tenere sempre gli organi interni umido con soluzione salina, cercando di mantenere il cerci asciutto. Si può utilizzare cera o pezzi di gomma per posizionare gli addome verso l&#39;alto per evitare che la soluzione salina dalla bagnando il cerci. Se non si bagnano, asciugarle con un pezzo di carta velina. Premere il lato gli organi interni e la materia bianca (grasso corporeo). Il VNC è al centro del campo, corre lungo l&#39;addome e dovrebbe essere visibile tra le trachee lucido. Il cordone nervoso è trasparente e può inizialmente essere difficile da vedere finché l&#39;illuminazione è regolata correttamente (Figura 2). NON maneggiare il VNC con una pinza o perni di insetti, invece manipolarla con sonde di vetro. </li><li> Sgombrare il sistema trachee dell&#39;animale nel miglior modo possibile dal cordone nervoso con una pinza e con un paio di bisogno buon bicchiereles, con molta attenzione contempla i connettivi VNC longitudinalmente tra A6 e A5 o A5 e A4 gangli (Figura 3). Culla della cerci e l&#39;addome verso l&#39;alto fuori dalla vasca salina con perni di insetti accorciato e cera o un cuneo di elastomero di silicone che può essere tagliato per adattarsi alla preparazione (Figure 4A e B). Prestare la massima attenzione nel segmento addominale ultima a non danneggiare i nervi Cercal che proiettano nel ganglio (figure 2D e 5). </li></ol> 2. Registrazione extracellulare <ol><li> La preparazione, microscopio, e la registrazione apparecchio sezionato dovrebbe essere impostato all&#39;interno di una gabbia di Faraday, in particolare per bloccare AC, campi elettrici esterni che potrebbero ignorare segnali dai neuroni (Figura 6). </li><li> Posizionare il microscopio in modo che si affaccia sul palco microscopio. Una volta che il preparato viene posto sul piatto, regolare la posizione del fascio ad alta intensità illuminatoreper un&#39;ottima visualizzazione di esso. </li><li> Collegare l&#39;amplificatore differenziale AC / DC per l&#39;unità di registrazione integrata di dati (informazioni dettagliate sulle impostazioni hardware e software specifici sono stati precedentemente descritto 25). Lo stadio testa in possesso di un elettrodo di aspirazione deve essere collegato all&#39;amplificatore. Un filo di terra argento che è stato rivestito con Cl - inserito nei risultati addome in registrazioni più stabili. La ragione è che se la soluzione nella cavità del corpo non è a contatto con il fluido di balneazione nel piatto, il fluido associato con l&#39;elettrodo di registrazione rimane a terra. </li><li> Impostare la frequenza di registrazione a 4 kHz. Impostare la scala di tensione (asse y) a 500 mV (questo può essere regolata per ottimizzare la visualizzazione della traccia). Eseguire il software di registrazione in modalità continua o oscilloscopio per registrare l&#39;attività neurale in risposta agli stimoli. </li><li> Tagliare uno dei connettivi VNC vicino alla A5 e posizionare l&#39;estremità tagliata collegato a A6 in un elettrodo di aspirazione. Assicurati di pull salina nel elettrodo di aspirazione a coprire il filo d&#39;argento al suo interno prima di succhiare nel nervo. </li><li> Con una pipetta soffio d&#39;aria secca a peli situati su ogni cercus. Vedere se stimolando i peli sul omolaterale cercus al connettivo registrato dà una risposta diversa da quella controlaterale. Prendere atto dell&#39;ampiezza delle risposte e il numero di punte in un dato intervallo di tempo durante la stimolazione. </li><li> Spostare l&#39;elettrodo di aspirazione ad un nervo Cercal per la registrazione. Per ottenere una migliore vestibilità, passa a un elettrodo con una minore apertura, se necessario. </li><li> Tagliare il nervo vicino Cercal a A6 e poi aspirare il nervo che porta alla cercus. Ci dovrebbe essere scarica spontanea dei potenziali d&#39;azione. Ora, soffiare aria sul cercus e annotare le risposte. </li></ol> 3. Elettricamente Stimolare i nervi sensoriali per determinare Recruitment <ol><li> Cambiare il software di registrazione in modalità a spazzare in modo che registra le tracce (100-500 MSEc.) ogni volta che uno stimolo viene attivato. </li><li> Collegare l&#39;elettrodo stimolante all&#39;uscita dello stimolatore. </li><li> Collegare il cavo stimolatore con i due cavi mini-gancio o clip. </li><li> Collegare l&#39;uscita del trigger BNC dallo stimolatore per l&#39;ingresso trigger sull&#39;unità di registrazione. </li><li> I seguenti parametri di stimolazione dovrebbe evocare una risposta: Durata: 0,3 sec; Delay: 10 msec; frequenza: 1 Hz; Tensione: regolare come necessario per ottenere un segnale nelle registrazioni (poco più di soglia e di essere in grado di ottenere una risposta massima). Non c&#39;è motivo di andare a tensioni molto più alte della soglia massima per l&#39;assunzione come alta tensione può essere dannoso per il nervo. </li><li> Tagliare il nervo cercal come distale possibile in modo che una lunga radice nervosa può essere tirato nel elettrodo di aspirazione stimolante (Figura 7, freccia testa). Il connettivo tra A6 e A5 o altro segmento più anteriore può essere utilizzato. </li><li> Impostare l&#39;elettrodo di aspirazione di registrazione in modo da poter pull una connettivo tagliato l&#39;elettrodo. Assicurati di tirare qualche soluzione salina nelle elettrodi di aspirazione per coprire il filo d&#39;argento al suo interno prima di succhiare nei nervi. Assicurarsi che l&#39;elettrodo stimolante è anche radicata nella salina bagno (nell&#39;addome vicino A3 è l&#39;ideale). </li><li> Fornire una serie di singoli stimoli di crescente tensione finché non appare un potenziale d&#39;azione sullo schermo. Si dovrebbe fare una registrazione della minima tensione stimolante e la durata di reclutare una risposta. Aumentare l&#39;intensità fino a quando si osserva una risposta sinaptica nei connettivi. Il grande spike (AP extracellulari) dagli assoni giganti appare per la prima, e poi altri più piccoli AP può anche essere osservato. </li></ol>

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Gli autori dichiarano che non vi siano conflitti di interesse.

Una delle ragioni per le tecniche di esporre per questa preparazione classica è che il sistema cerci è stato ed è una zona attiva di ricerca per affrontare questioni dello sviluppo di circuiti neurali nonché le questioni riguardanti la riparazione e la rigenerazione sinaptica 26-31. Entrambi i metodi di evocare attività nel cordone nervoso ventrale scarafaggio può essere usato per esaminare gli effetti di agenti farmacologici o insetticidi in funzione del sistema nervoso. Questi esperimenti sono fatti semplicemente sciogliendo sostanze chimiche neuroattivi in ​​salina. Dopo lo scambio di questa soluzione con il normale mezzo di balneazione, si possono osservare i cambiamenti nell&#39;attività evocata o spontanea durante la registrazione da connettivi o un nervo motore per dare una lettura coerente dell&#39;effetto della sostanza chimica sulla funzione del sistema nervoso centrale. Come in tutti gli esperimenti neurofisiologici un problema comune è il rumore elettrico. Probabilmente il più grande fattore di qualità del segnale per queste preparazioni is la guarnizione elettrodo di aspirazione sul tessuto nervoso. La tenuta stagna che non completamente disegnare nel nervo Cercal o connettivo è l&#39;ideale. Le registrazioni possono essere effettuate anche con elettrodi doppio gancio posto sotto il cordone nervoso e isolando il VNC con una miscela di olio minerale e petrolato. La miscela può essere caricato in una siringa ed espulso tutto il cordone nervoso 32. Anche una dissezione accurata è critico qui come in qualsiasi preparazione CNS. Alcuni potrebbero trovare più facile per accedere al sistema nervoso centrale sezionando la cuticola dorsale. Mentre questo riduce la possibilità di danneggiare il cordone nervoso ventrale può essere più difficile da rimuovere tutti i visceri utilizzando questo approccio. Non è descritto qui, ma questa preparazione è suscettibile di registrazione intracellulare nelle interneuroni giganti 32,33. L&#39;intero cordone nervoso può anche essere rimosso per accogliere vari elettrodi di registrazione e stimolante allo stesso tempo. In esplorazione fatto della Lobe antenne, funghi body, e altre strutture del sistema nervoso centrale anteriore è ancora in corso 34-35. Mentre lo scarafaggio CNS continua a far luce sulla moderna ricerca neurobiologica questa particolare preparazione è abbastanza semplice da essere utilizzato in laboratori accademici universitari.

Ci sono più di 4.000 specie di scarafaggio, ma solo 30 sono parassiti domestici. Forse il più noto è il nome sbagliato scarafaggio americano Periplaneta americana che ha avuto origine in Africa, e ora si trova quasi ovunque sul pianeta. Oltre alla sua rapida velocità di funzionamento 1 e comportamento sfuggente, nei tropici P. americana è capace di 2,3 volo. Le caratteristiche predominanti del sistema nervoso centrale scarafaggio (CNS) sono la sua natura segmentata e la decentralizzazione del controllo processi 4,5. Il cervello, toracica, addominale e dei gangli sono uniti da connettivi interganglionic accoppiati per formare il cordone nervoso ventrale (VNC). Il gangli in ogni segmento stanno integrando centri. Sono composte da una, regione corticale esterna contenente cellule responsabili della emato-encefalica permeabilità della barriera appena sotto di loro, e la somata dei neuroni originarinari in quel ganglio. Questi somata possono appartenere a interneuroni, neuroni modulatori, o neuroni motori. Essi forniscono assoni che rimangono all&#39;interno del ganglio di origine (interneurone locale), o assoni che proiettano tra i gangli del sistema nervoso centrale (interneuroni interganglionic) o che terminano sulle cellule muscolari periferiche (neuroni motori). La maggior parte dei somata sono posizionati ventrale o ventrolaterally nella corteccia gangliare 5. Le coppie, connettivi interganglionic contengono solo assoni e corpi cellulari neuronali. Il neuropil di un ganglio contiene cellule gliali (neuroglia), tratti di assoni, fasci di assoni, dendriti e neuriti () di neuroni. Il neuropil è privo di corpi cellulari neuronali. Questa è la regione all&#39;interno del ganglio dove la comunicazione sinaptica diretta tra cellule nervose e integrazione di ingressi verifica. La capacità del scarafaggio americano P. americana per rilevare e improvvisamente rispondere ad un predatore si avvicina (a piedi, hand, ecc.) è stata attribuita ad un circuito riflesso che consiste nella cerci e gigante 6,7 sistema fibra. Il cerci sono una coppia di strutture vento sensibili corno come vicino all&#39;estremità dell&#39;addome (Figura 1). In P. americana superficie ventrale di ogni cercus contiene circa 200 filiforme (thread) peli che sono organizzati in 14 colonne. Nove di queste colonne può individuare in modo coerente in diversi animali secondo le proprietà di risposta della cellula recettore associato e assone. Ogni capello è in una presa che permette di piegare più facilmente in un piano che è specifica colonna. Movimento dei capelli in una direzione lungo il suo piano induce una depolarizzazione nella cella recettore e una raffica di potenziali di azione (AP) nel neurone sensoriale. Il movimento nella direzione opposta inibisce qualsiasi AP spontanee in corso 8. L&#39;aereo preferito di deflessione e direzionalità della risposta è differente in ciascuna colonna. Così, il filiforcomplessi m capelli-recettore sono responsabili non solo per rilevare il movimento di aria, ma anche per &#39;codifica&#39;, sotto forma di punti di accesso, la direzione dalla quale la corrente d&#39;aria origine. Trattamento di tali informazioni da parte del CNS si traduce in un &#39;appropriata&#39; la risposta di fuga 6,7. Questo funzionale, specificità colonnare dei peli sensori è preservata da un animale all&#39;altro. La cella recettore di ogni capello filiforme è responsabile per trasdurre la deformazione meccanica dei capelli in un evento neurale (risultante in un burst o inibizione di AP nel l&#39;assone recettore 9. L&#39;AP viaggiano al ganglio addominale terminale (A6) tramite cercal XI nervo, dove sinapsi con assoni giganti del cordone nervoso ventrale (VNC). Gli assoni giganti sono da ritenersi responsabili per la trasmissione e la successiva eccitazione dei neuroni motori che si traduce in un comportamento di fuga 6,10,11. Il comportamento di latenza of la risposta di fuga di P. americana è uno dei più brevi di qualsiasi animale 7. Latenza comportamentale è il tempo tra l&#39;arrivo di uno stimolo a meccanorecettori e l&#39;inizio della risposta di fuga. In esperimenti usando la cinematografia ad alta velocità per registrare il tentativo di fuga da un rospo attaccare, lo scarafaggio è stato osservato per iniziare il suo turno di distanza dal rospo in circa 40 msec (tempo dall&#39;inizio della proroga lingua per scarafaggio movimento 7,12. Usando soffi di vento controllate , la latenza comportamentale potrebbe essere ridotto a 11 msec. Altri esperimenti hanno rivelato che un soffio velocità del vento minima di 12 mm / msec (con un&#39;accelerazione pari a 600 mm / msec 2) può evocare una risposta di fuga, mentre velocità ancora più basse (3 mm / sec) causato camminando lentamente scarafaggi per fermare movimento 12. La forte correlazione che esiste tipicamente tra sistemi a fibre giganti e comportamenti di fuga è stato ben documentato 13,14. In instrecchi dove è necessario e sufficiente per evocare un particolare comportamento una determinata cella la cella viene indicato come un comando neurone 15,16. Interneuroni giganti (IG) nel circuito fuga vento di P. americana non sono necessari per il riflesso. Gli animali che hanno sperimentalmente ablati IG ancora mostrano il comportamento di fuga, pertanto questi soldati non sono considerati i neuroni di comando 17,18. Severing connettivi cervicali che sono rostrale al circuito sensomotorio influenza anche il comportamento, indicando che discendente input dal cervello ha un effetto sulla direzione di fuga 19. Questi aspetti di un controllo preciso e ridondanza sono di primaria importanza per la sopravvivenza dell&#39;organismo e sono completati dalla modulazione neurochimica via ammine biogene 20. Il P. preparazione del cavo americana nervo è stato un elegante sistema modello per neuroethologists nel corso degli ultimi decenni a partire con il lavoro pionieristico di Roeder &lt;sup&gt; 21. Permette agli studenti di registrare, visualizzare e analizzare l&#39;attività sensoriale primaria e quelli risultanti dagli interneuroni giganti per la loro 22,23,24 input. Oltre a trasmettere l&#39;idea che i circuiti neurali alla base identificabili risposte comportamentali per l&#39;ambiente, questi esercizi dovrebbero infondere un apprezzamento per i contributi biologiche fatte da questo parassita comune della famiglia.

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagente&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>182 silicone kit</td><td>Kit per elastomero siliconico 182</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>&lt;strong&gt;S7653&lt;/strong&gt;</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71505</td><td></td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;&amp;bull;7H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9390</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Per regolare il pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Per regolare il pH</td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Nome del materiale&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Strumenti da dissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortment</td><td></td></tr><tr><td>Puntine per insetti</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico</td><td>World Precision Instruments</td><td>PZMIII-BS</td><td></td></tr><tr><td>Microelettrodi in vetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Confezione da 200, elettrodi a suggizione</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>Può essere fissato alla base o su un’asta metallica</td></tr><tr><td>Filo d’argento (10/1.000 di pollice)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore differenziale AC/DC</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Testa di registrazione</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Fornita insieme all'amplificatore AC/DC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cavi elettrici</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti in vetro</td><td>autocostruiti</td><td></td><td>Per manipolare i nervi</td></tr><tr><td>Cavi e connettori</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette con pallina</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Confezione da 500</td></tr><tr><td>Beccherelli</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera o argilla da modellare</td><td>qualsiasi azienda o negozi locali</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 o S88</td><td></td></tr><tr><td>Punta di plastica per elettrodo a suggizione</td><td>negozio di ferramenta locale (marca Watt's)</td><td>&amp;frac14; pollice di diametro esterno x 0,170 pollici di diametro interno</td><td>Tagliare in piccoli pezzi. Tirare sopra una fiamma e ritagliare la punta alla dimensione corretta.</td></tr></tbody></table>

neural circuit registrazione da un intatto scarafaggio sistema nervoso

Neural Circuit Recording from an Intact Cockroach Nervous System

La preparazione cordone nervoso ventrale scarafaggio è un sistema maneggevole per esperimenti Neuroethology, modellazione di reti neurali, e verificare gli effetti fisiologici di insetticidi. Questo articolo descrive l&#39;ambito di scarafaggi modalità sensoriali che possono essere utilizzati per eseguire il test come un sistema nervoso degli insetti risponde alle perturbazioni ambientali. Enfasi è sul comportamento di fuga mediata da Cerci al gigante di trasmissione in fibra in Periplaneta americana. Questo in preparazione situ richiede solo abilità dissezione moderato e competenze elettrofisiologico per generare le registrazioni riproducibili di attività neuronale. Peptidi o altri reagenti chimici possono essere applicati direttamente al sistema nervoso in soluzione con la soluzione fisiologica. Insetticidi potrebbero anche essere somministrate prima della dissezione e il circuito di fuga possono servire come proxy per lo stato eccitabile del sistema nervoso centrale. In questo contesto i saggi qui descritti sarebbe anche utile per researchers interessati alla rigenerazione degli arti e l&#39;evoluzione dello sviluppo del sistema nervoso per la quale P. americana è un organismo modello stabilito.

La stimolazione dei peli sul cerci da un soffio d&#39;aria provoca scarichi di neuroni sensoriali primari che possono essere registrate mediante elettrodi di aspirazione extracellulari attaccati sia per connessioni tra gangli addominale o il nervo Cercal stessa (Figura 8). Ampiezze picco registrate dalle due regioni sono dell&#39;ordine di alcuni microorganismi volt a millivolt. A causa di integrazione sensoriale nel ganglio del numero di picchi osservati nel potenziale d&#39;azione composto o come singoli picchi registrati dal nervo Cercal è notevolmente maggiore rispetto a quella osservata nelle registrazioni dei connettivi. Tuttavia anche notare che è sostanzialmente meno rumore nella registrazione al connettivo dovuta alla tenuta migliore tra l&#39;elettrodo e il tessuto nervoso. Con sbuffando dell&#39;aria nelle grandi picchi Cerci può essere osservato nei connettivi (Figura 8A). Usando questo metodo stimolante, registrazioni tra A3 e A4 tipica<html> mostra ly una grande caratteristica di punta del interneurone gigante (s). Registrazione da un nervo cercal mentre fisicamente strofinando la cerci con una pinza prodotto una forte busto di attività (Figura 8B 1). In un&#39;altra registrazione, 2 sbuffi d&#39;aria ogni prodotto una risposta rapida busting nel nervo Cercal (Figura 8B 2). Quando stimolando elettricamente il nervo cercal con un elettrodo di aspirazione e la registrazione nel connettivo tra A3 e A4, si può osservare una soglia nella stimolazione di risposte evocate (Figura 8C 1). La stimolazione elettrica del nervo cercal chiaramente suscita una risposta in connettivi che può essere quantificata per gli studi di manipolazione con agenti farmacologici o circonda la ambientale locale, quali la temperatura (Figura 8C 2). <html> fig1.jpg &quot;/&gt; Figura 1. Americana Periplaneta con cerci intatto. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig2.jpg" /> Figura 2. Vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio come si è visto con la cuticola ventrale rimosso (A). Una vista ingrandita del segmento indicato dalle frecce è visto in (B). In (C) i connettivi si sono riversate tra A4 e A3 con una sonda di vetro. Il 6 ° ganglio addominale è mostrato in (D) con i due nervi Cercal lasciando alla fine caudale. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig3.jpg" /> Figura 3. Schema vista ventrale del cordone nervoso scarafaggio. ys &quot;&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig4.jpg" /> Figura 4. L&#39;cerci sono posizionati verso l&#39;alto fuori dalla vasca salina. L&#39;addome aperte possono essere inondate con soluzione salina (A) con l&#39;estremità caudale del scarafaggio essere elevato con un piccolo pezzo di forma incuneata elastomero di silicone per mantenere la cerci out del bagno (B). <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig5.jpg" /> Figura 5. Il 6 ° ganglio addominale con il nervo Cercal (indicato dalle frecce). <img alt="Figura 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig6.jpg" /> Figura 6. L&#39;apparecchiatura istituito. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50584/50584fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere lar</a>ger figura. <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig7.jpg" /> Figura 7. Stimolante ed elettrodo di registrazione impostati. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5.75in" src="/files/ftp_upload/50584/50584fig8.jpg" /> Figura 8. Registrazioni neurali dei connettivi e nervo cercal con varie procedure di stimolazione. Registrazione con un elettrodo di aspirazione dalle connessioni tra A3 e A4, mentre fumano aria alla Cerci (A). Registrazione da neuroni Cercal primarie con un elettrodo di aspirazione, mentre sia fisicamente sfregamento (B 1) o la fornitura di sbuffi d&#39;aria (B 2) Risultati in rapide sequenze di attività nel nervo Cercal. Elettricamente stimolando il nervo Cercal produce risposte a connettivi ( <strong&gt; C 1). Si noti il ​​graduale aumento dell&#39;intensità stimolante (frecce indicano l&#39;ampiezza del manufatto stimolante) e l&#39;intensità delle seguenti risposte evocate. La stimolazione elettrica del nervo cercal fornisce un mezzo relativamente più controllati di stimolazione del nervo cercal coerenza nella stimolazione per quantificare le risposte (C 2).

Questo articolo descrive la blatta ventrale nervo dissezione spinale e registrazioni extracellulari dal nervo Cercal e connettivi. Risposte evocate sono generate dalla stimolazione elettrica del nervo cercal o stimolazione meccanica diretta della cerci.

Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso

The cockroach ventral nerve cord preparation is a tractable system for neuroethology experiments, neural network modeling, and testing the physiological ...

Questa tecnica dimostra come un organismo percepisca il suo ambiente attraverso stimoli meccanosensoriali e come l'informazione venga integrata e trasformata nei centri superiori del SNC esponendo il cordone nervoso ventrale e i nervi circolari. Per prima cosa si registra dai connettivi nel cordone nervoso ventrale, il che dimostra il tipo di segnali che il SNC sta trasmettendo. Successivamente si registra dai neuroni sensoriali primari per confrontare l'attività dei neuroni primari con l'attività nei connettivi.I risultati mostrano come il movimento dei peli sottili dovuto alla vibrazione dell'aria mette in relazione i segnali elettrici con il SNC e come tali segnali vengono elaborati. Questo metodo può fornire informazioni sull'integrazione dell'attività dei neuroni sensoriali e degli scarafaggi, oppure può essere applicato ad altri circuiti motori o ad altri organismi modello. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la dissezione può essere un po' difficile sezionare l'animale nel modo giusto per mantenere i peli sensoriali asciutti durante la registrazione dal nervo sensoriale primario.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto è difficile da imparare perché è facile danneggiare il fascio nervoso. Seleziona uno scarafaggio maschio dal serbatoio di contenimento che ha circa gli ultimi segmenti del maschio sono stretti e non hanno ovaie e massa di uova, a differenza della femmina. I maschi di P Americana hanno anche un paio di occhi corti tra le femmine, non osservati nelle femmine, tagliati le ali, le zampe e la testa.Quindi fissare il lato ventrale del corpo a un piatto rivestito con elastomero siliconico con una pinza. Raccogli le placche ventrali e tagliale con le forbici sottili partendo dall'estremità posteriore e lavorando anteriormente Mantieni sempre gli organi interni umidi con strizzatori cercando di mantenere il circa asciutto. Questo viene fatto usando cera o gomma per sollevare l'addome.Se il Cirque si bagna, asciugatelo con un pezzo di carta velina. Quindi, metti da parte gli organi interni e la sostanza bianca. Il VNC dovrebbe ora essere visibile tra la trache lucida E.It corre per tutta la lunghezza dell'addome.Potrebbe essere necessario regolare l'illuminazione per vedere il VNC. Non maneggiare il VNC con pinze o perni per insetti. Invece, manipolalo usando sonde di vetro.Elimina il sistema trache E dell'animale dal cordone nervoso nel miglior modo possibile con una pinza con un paio di aghi di vetro sottili. Dividere con molta attenzione i connettivi VNC longitudinalmente tra la culla A sei e una cinque o la culla A cinque e quattro gangli. Il Siri e l'addome verso l'alto fuori dal bagno salino.Utilizzare spilli per insetti accorciati e cera o un cuneo di elastomero siliconico. Fai molta attenzione nell'ultimo segmento addominale per evitare di danneggiare i nervi circolari, che si proiettano nel ganglio. Il microscopio di preparazione sezionato e l'apparato di registrazione dovrebbero essere installati all'interno di una gabbia di Faraday per bloccare i campi elettrici esterni che potrebbero ignorare i segnali provenienti dai neuroni.Posizionare il microscopio in modo che si trovi sopra il tavolino. Quindi regolare la posizione del fascio dell'illuminatore ad alta intensità. Per visualizzare al meglio la preparazione, collegare l'amplificatore differenziale AC CDC all'unità di registrazione dati integrata.Lo stadio principale che contiene un microelettrodo deve essere collegato all'amplificatore. Per stabilizzare le registrazioni. Macinare l'addome con il filo d'argento rivestito di cloruro.Il motivo del filo di terra d'argento è se la soluzione all'interno della cavità corporea perde il contatto con il fluido del bagno nel piatto. Quindi la soluzione associata all'elettrodo di registrazione rimane collegata a terra. Quindi, imposta la frequenza di registrazione su quattro kilohertz.Quindi avviare la scala di tensione sulla traccia a 500 millivolt. Regolarlo secondo necessità e impostare il software in modo che venga eseguito in modalità continua o oscilloscopio in base alla preparazione. Taglia uno dei connettivi VNC vicino a un cinque.Quindi posizionare l'estremità tagliata attaccata a un sei in un elettrodo di aspirazione preriempito con la soluzione di suoneria. Con una pipetta asciutta soffiare aria sui peli situati su ogni circo. Verificare se la stimolazione dei peli del circo omolaterale al connettivo registrato dà una risposta diversa rispetto a quella controlaterale.Prendi nota dell'ampiezza della risposta e della frequenza dei picchi. Quindi spostare l'elettrodo di aspirazione su un nervo circolare per la registrazione. Se l'adattamento non è buono, passare a una punta dell'elettrodo con un'apertura più piccola.Quindi, taglia il nervo circolare vicino a un sei e aspira il nervo che porta al circo. Ciò dovrebbe portare a potenziali d'azione spontanei. Ora soffia aria sul circo e nota le risposte.Impostare il software di registrazione in modalità sweep in modo da registrare le tracce ogni volta che viene attivato uno stimolo. Queste tracce devono essere comprese tra uno e 500 millisecondi. Collegare l'elettrodo stimolante all'uscita dello stimolatore e collegare l'uscita trigger BNC dallo stimolatore all'ingresso trigger sull'unità di registrazione.Ora, alcuni parametri di stimolazione dovrebbero evocare una risposta, regolare la tensione di stimolazione per ottenere un segnale appena sopra la soglia e in grado di ottenere una risposta massima. Non c'è motivo di andare a tensioni molto più alte della soglia massima per il reclutamento. Poiché un'alta tensione può essere dannosa per il nervo, tagliare il nervo circolare il più distalmente possibile in modo che una lunga radice nervosa possa essere tirata nella strada dell'elettrodo di aspirazione stimolante.Ora, può essere utilizzato il connettivo tra i gangli A sei e cinque o in un segmento più anteriore. Aspirare la soluzione salina nell'elettrodo di aspirazione e quindi estrarre un connettivo tagliato nell'elettrodo. Assicurarsi che l'elettrodo stimolante sia collegato a terra nella soluzione fisiologica del bagno.Idealmente, l'elettrodo di registrazione dovrebbe essere nell'addome vicino a un tre. Ora eroga una serie di singoli stimoli di tensione crescente fino a quando sullo schermo appare un potenziale d'azione composto. Prendere nota della tensione e della durata minime di stimolazione per reclutare una risposta.Inizia con un livello basso e aumenta l'intensità fino a quando non si osserva una risposta sinaptica nei connettivi. Il grande picco e il potenziale d'azione extracellulare degli assoni giganti appariranno per primi, e poi altri potenziali d'azione più piccoli potranno essere osservati anche soffiando aria sul cci. Grandi picchi sono stati osservati nei connettivi utilizzando questo paradigma stimolante.Le registrazioni dei connettivi tra un tre e un quattro hanno mostrato tipicamente un grande picco caratteristico dei giganteschi interneuroni che registrano da un nervo circolare mentre strofinano fisicamente il Siri con una pinzetta hanno prodotto una forte esplosione di attività in un altro registrando due sbuffi d'aria, ciascuno dei quali ha prodotto una rapida risposta di scoppio nel nervo circolare quando stimola elettricamente il nervo circolare con un elettrodo di aspirazione e registra nel connettivo tra un tre e un quattro, una soglia nella stimolazione alle risposte evocate è stato registrato. La stimolazione elettrica del nervo circolare suscita chiaramente una risposta nei connettivi che può essere quantificata per studi manipolativi con agenti farmacologici o con parametri ambientali locali Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di non pizzicare i nervi con le pinzette o di non tirare troppo forte il nervosismo con l'elettrodo di aspirazione.Dopo aver visto questo video, si spera che tu abbia una buona comprensione di come sezionare il sistema nervoso degli scarafaggi e raccogliere registrazioni extracellulari evocate sensoriali.

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Questo video mostra la procedura per isolare il cervello tutto da adulto Drosophila, in preparazione per la registrazione di singoli neuroni utilizzando tecnologia standard a cellula intera. Esso comprende le immagini di cellule GFP etichettati e neuroni visualizzati durante la registrazione.

Registrazioni cella intero cervello di adulti Drosophila

Misurazioni non invasive di schemi di attività neurale nel comportarsi liberamente gli animali sono ottenuti combinando registrazioni neurofisiologiche con videografia ad alta velocità.

Le registrazioni di attivazione circuito neurale in Liberamente Comportarsi Animali

Registrazione elettrofisiologiche in Drosophila Embryo

La registrazione simultanea dei segnali di calcio da parte dei neuroni identificati e comportamento alimentare di Drosophila melanogaster</em

Il video dimostra la registrazione extracellulare dell'attività neuronale dal sistema nervoso centrale (SNC) delle larve di Drosophila. Il SNC sezionato viene posizionato in una camera di registrazione e l'attività elettrica di un nervo discendente viene registrata per stabilire la frequenza di attivazione di base. Viene quindi introdotto un agente di prova e viene registrata la variazione della frequenza di attivazione per determinare l'effetto eccitatorio o inibitorio dell'agente.

Registrazione extracellulare dell'attività elettrica nel sistema nervoso centrale della Drosophila

Dimostriamo variazioni del extracellulare più unità tecnica di registrazione per la caratterizzazione degli odori-risposte evocate nelle prime tre fasi del percorso olfattivo invertebrati. Queste tecniche possono essere facilmente adattati per esaminare l'attività ensemble in altri sistemi neuronali pure.

Multi-unit Metodi di registrazione per caratterizzare l&#39;attività neurale nel Locust (<em&gt; Schistocerca Americana</em&gt;) Circuiti olfattive

Abbiamo già sviluppato una tecnica per impiantare i fili tetrode nel complesso centrale del cervello scarafaggi che ci permette di monitorare l'attività in singole unità di scarafaggi frenati. Qui vi presentiamo una versione modificata di quella tecnica che ci permette di registrare anche l'attività cerebrale nel muoversi liberamente insetti.

Extracellulare Wire Tetrode registrazione in Brain di Liberamente Walking Insetti

Registrazioni simultanee extracellulari lungo termine provenienti da due diversi neuropiles cerebrali o due diversi tratti anatomici sono stati stabiliti nelle api. Queste registrazioni permettono lo studio di aspetti temporali del trattamento neuronale attraverso diverse aree cerebrali del singolo neurone, così come a livello di complesso in un animale comportarsi.

Registrazioni simultanee a lungo termine in due fasi neuronale Processing in Comportarsi api

I microelettrodi affilati consentono un'accurata caratterizzazione elettrofisiologica dell'output dei fotorecettori e degli interneuroni visivi in Drosophila vivente. Qui mostriamo come utilizzare questo metodo per registrare risposte di tensione di alta qualità delle singole cellule alla stimolazione luminosa controllata. Questo metodo è ideale per studiare l'elaborazione delle informazioni neurali negli occhi composti da insetti.

Metodo elettrofisiologiche per la registrazione intracellulare di tensione Risposte di<em&gt; Drosophila</em&gt; Fotorecettori e Interneuroni a luce stimoli<em&gt; In Vivo</em

Questo protocollo descrive un metodo per registrare l'attività elettrica discendente del sistema nervoso centrale Drosophila melanogaster per abilitare il costo-efficiente e conveniente test degli agenti farmacologici, mutazioni genetiche delle proteine neuronali, e/o il ruolo di inesplorate vie fisiologiche.

Registrazione elettrofisiologica dell'attività del sistema nervoso centrale di terza-Instar Drosophila Melanogaster

Questo protocollo presenta un metodo per l'imaging dell'attività della popolazione neuronale con risoluzione a singola cellula in specie di invertebrati non transgenici utilizzando coloranti sensibili alla tensione di assorbanza e un array di fotodiodi. Questo approccio consente un flusso di lavoro rapido, in cui l'imaging e l'analisi possono essere perseguiti nel corso di un solo giorno.

Imaging ottico basato su fotodiodi per la registrazione di dinamiche di rete con risoluzione a singolo neurone in invertebrati non transgenici

Scopri la registrazione extracellulare dal sistema nervoso intatto dello scarafaggio per studiare l'elaborazione dei segnali sensoriali nel SNC. Questa tecnica elettrofisiologica permette di analizzare l'integrazione neuronale in vivo.

Neural Circuit Registrazione da un intatto scarafaggio Sistema Nervoso

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