Name: Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Impara il protocollo DNA FISH 3D con sonde marcate direttamente per analizzare l'architettura nucleare in singole cellule. Questo metodo robusto e versatile permette di studiare l'organizzazione spaziale dei loci genomici.

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Questo lavoro è stato finanziato dal BBSRC e il Wellcome Trust. Vorremmo ringraziare Simon Walker per l&#39;assistenza con l&#39;imaging e Felix Krueger per un aiuto con analisi bioinformatica.

1. Generazione di sonde di DNA marcate direttamente da Nick traduzione Nota: le sonde marcate direttamente realizzati dalla BAC (100-250 kb) realizzare regolarmente i segnali luminosi. Se sono necessarie sonde più piccole, utilizzare fosmidi (40-50 kb) o anche plasmidi contenenti inserti kb 5-10. Identificare BAC o fosmid cloni corrispondenti a geni specifici utilizzando Ensemble o browser genoma UCSC. Preparare BAC DNA di alta qualità da ripetute precipitazioni o utilizzare i kit disponibili in commercio. Il meno la preparazione è contaminato con DNA genomico batterico, meno sonda è necessaria per ogni diapositiva. Eseguire l&#39;etichettatura in due fasi: traduzione nick introducendo aminoallyl-dUTP e accoppiamento chimica di un colorante ammina-reattiva. 1.1. Nick traduzione Durante la traduzione nick, DNasi I è utilizzato per creare singole-filamento. DNA polimerasi I allunga &#39;estremità di questi&#39; del 3 nick &quot;, sostituendo i nucleotidi esistenti con quelli nuovi, t<html> dichiara &#39;tradurre&#39; il nick e fornendo così l&#39;opportunità di incorporare nucleotidi marcati. Aminoallyl-dUTP viene scelta a causa della incorporazione efficiente dalla DNA polimerasi I e il suo potenziale per un successivo attacco chimico per coloranti reattivi-ammina o apteni. E &#39;fondamentale per ottenere il giusto equilibrio tra DNasi I intaccare e DNA polimerasi I di traduzione; troppo DNasi I comportino un&#39;eccessiva digestione DNA dando a basso rendimento e dimensioni dei frammenti brevi, troppo poco non produrre abbastanza nick per la polimerasi per iniziare la traduzione, dando grande dimensione del frammento e la scarsa integrazione di aminoallyl-dUTP. Il seguente protocollo funziona bene, ma può essere necessario per titolare la DNAsi I lotti differenti o da diversi fabbricanti. <ol><li> Impostare l&#39;etichettatura reazione in ghiaccio e incubare per 2 ore a 16 ° C. Questo dovrebbe produrre 0,5-1 mg DNA nick-tradotto e può essere installato su. Diluire DNasi I 1:30 DNasi I tampone (cioè 0,3 U / mL). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentrazione di magazzino </td><td> Volume o importo </td></tr><tr><td> BAC DNA </td><td></td><td> 5-10 mcg </td></tr><tr><td> NTB tampone </td><td> 10x </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 0.1 M </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> 10x </td><td> 5 microlitri </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> DNA polimerasi I </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 microlitri </td></tr><tr><td> DNasi I </td><td> 10 U / ml </td><td> 1 ml (di una diluizione 1:30) </td></tr><tr><td> H 2 O </td><td></td><td> a 50 microlitri </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Esegui 1 microlitri su un gel di agarosio al 2% per controllare la dimensione dei frammenti marcati. Mentre si esegue il gel, tenere la reazione in ghiaccio. Successo nick translation si tradurrà in uno striscio con la maggior parte dei frammenti che corrono tra 150 bp e 700 bp con alcuni frammenti più grandi di ~ 1 kb (PUNTO CRITICO: vedi Rappresentante dei risultati). Se necessario, aggiungere un altro 1 ml di una fresca 1:30 DNasi I diluizione e incubare a 16 ° C per 15-30 min. Tempo di incubazione varierà secondo la quantità e la qualità di BAC DNA. </li><li> Inattivare DNasi I mediante riscaldamento a 75 ° C per 10 min. </li><li> Clean-up DNA ammina-modificato utilizzando un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 ml H 2 O. </li><li> Etanolo DNA precipitato per aggiunta di 10 microlitri NaOAc 3 M (pH 5.2) e 275 ml di etanolo. Lasciare a -20 ° C per almeno 1 ora o durante la notte. Girare alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con 500 microlitri 70% di etanolo e lasciare asciugare all&#39;aria. Questo passaggio rimuove tracce di ammine che interferiscono con la reazione di marcatura. Risospendere il pellet in 6 ml H 2 O per 1x reazione iniziale. </li><li> Usare 1 microlitri per determinare la concentrazione del DNA ammina-modificatomediante spettroscopia UV microvolumi. </li></ol> 1.2. Accoppiamento del colorante fluorescente Etichettatura fluorescenza della sonda è ottenuta mediante accoppiamento chimico del colorante. Alexa Fluor succinimidyl coloranti esteri reagiscono con le ammine di DNA amino-allyldUTP modificato per formare un legame covalente, producendo in tal modo sonde marcate direttamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e coloranti hanno avuto successo per questo processo. <ol><li> Regolare 4 mg di DNA amino-allil modificato per un volume di 5 microlitri, riscaldare a 95 ° C per 5 min, scattare raffreddare su ghiaccio, e aggiungere 3 ml di 0,2 M NaHCO3. </li><li> Sciogliere un&#39;aliquota di colorante reattivo ammina in 2 microlitri DMSO anidro a temperatura ambiente. Aggiungere 8 ml DNA modificato con NaHCO3, vortice, impulso di spin e incubare a temperatura ambiente al buio per 1 ora. </li></ol> Nota: I coloranti reattivi ammine possono essere usati per etichettare più di una sonda basata sul seguente schema. Dal momento oolo 10-20 ng di sonda viene utilizzata per l&#39;etichettatura di diapositive, 1 mg dà abbastanza sonda per 50-100 diapositive. È anche possibile memorizzare DNA ammina-modificato per reazioni di marcatura future a -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantità di DNA </td><td> Volume di DNA </td><td> 0,2 M NaHCO3 </td><td> Volume di colorante </td><td> Totale </td><td> Abbastanza per </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1,25 ml ciascuno </td><td> 0,75 ml ciascuno </td><td> 0,5 microlitri ciascuno </td><td> 2,5 microlitri (1/4) </td><td> 50-100 diapositive ciascuno </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 mcg </td><td> 1,67 ml ciascuno </td><td> 1 microlitri ciascuno </td><td> 0,67 ml ciascuno </td><td> 3,34 microlitri (1/3) </td><td> 65-130 diapositiva ogni </td></tr><tr><td> 2 x 2 mg </td><td> 2,5 microlitri ciascuno </td><td> 1,5 ml ciascuna </td><td> 1 microlitri ciascuno </td><td> 5 microlitri (1/2) </td><td> 100-200scivola ogni </td></tr><tr><td> 1 x 4 microgrammi </td><td> 5 microlitri </td><td> 3 ml </td><td> 2 microlitri </td><td> 10 microlitri (completo) </td><td> 200-400 diapositive </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Aggiungere 90 ml di H 2 O e purificare sonda marcata con un kit di purificazione PCR. Eluire in 100 microlitri 10 mMTris-Cl (pH 8,5). </li><li> Determinare la concentrazione della sonda e l&#39;efficienza di etichettatura mediante spettroscopia gamma completa microvolumi (vedi figura 2) utilizzando le equazioni di Beer-Lambert (istruzioni riportate nella scheda tecnica che accompagna i Alexa Fluor coloranti reattivi o si possono trovare on-line). Sonde contenenti 3-6 coloranti per 100 bp funzionano bene. Sonde con bassi gradi di incorporazione possono dare segnali FISH deboli. In alternativa, eseguire 5 microlitri su un gel di agarosio al 2% del DNA senza macchia e controllare l&#39;incorporazione del colorante fluorescente utilizzando una phosphoimager. Posta-macchia il gel con bromuro di etidio o alternative di colorazione del DNA e confrontare il DNA marcato a DNA totale. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. FISH DNA Tramite le seguenti fasi, le cellule di interesse sono fissati alle diapositive e permeabilizzate. DNA cellulare e sonde marcate direttamente sono poi denaturati insieme su una piastra calda e ibridati durante la notte in una camera umidificata a tenuta di luce. 2.1. Giorno 1 <ol><li> Sonda Precipitazioni Nota: le sonde precipitato a un certo punto durante Day 1. Questo può essere comodamente eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve essere fatto all&#39;inizio della giornata. <ol><li> Mescolare 10-20 ng sonda direttamente etichettato, 6 ml C 0 t-1 DNA (6 mg), 1 ml DNA a singolo filamento da testicoli di salmone (9,7 mg) e regolare il volume a 100 ml con acqua. </li><li> Aggiungere 10 ml 3 M NaOAc e 275 microlitri EtOH, e mescolare nel vortex. Precipitare per almeno 1 ora a -20 ° C. </li><li> Spin in microcentrifuga alla massima velocità per 30 min a 4 ° C. Lavare pellet con EtOH 70% e far girare di nuovo. Secco pellete risospendere in 5 microlitri formammide deionizzata. Sospendere di nuovo per 30 minuti a 37 ° C sotto agitazione a 1000 giri al riparo dalla luce (posto sopra il foglio thermomixer). </li><li> Aggiungere 5 ml di destrano solfato mix e agitare per altri 10 min a 37 ° C al riparo dalla luce nuovamente. Pipettare su e giù appena prima di dispensazione sul vetrino. Nota: Per la pittura cromosoma combinata con sonde BAC, interi cromosomi sonde di pittura che sono forniti in pronta all&#39;uso mix di ibridazione sono una scelta conveniente. Risospendere il precipitato sonda BAC (con C 0 t1 DNA e DNA a singolo filamento da testicoli di salmone) in 10 microlitri cromosoma vernice mescolare pipettando su e giù. Incubare a 37 ° C agitando a 300-500 rpm per 10 min. Utilizzare 10 ml di cromosoma vernice / BAC sonda mix per punto. </li></ol></li><li> Collegamento celle di diapositive Nota: le cellule propensione ad aderire alle diapositive varia con il tipo di cellula. Per ciascun tipo di cellula, determinare ilottimale tempo di assestamento e di densità cellulare empiricamente. Per risultati coerenti, le celle devono essere in una sospensione di cellule singole. Per facilità d&#39;uso cerchio l&#39;area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo, anche se per le cellule risospese in PBS questo non è strettamente necessario. Una barriera idrofoba impedisce la sospensione di diffondersi sul vetrino, continua fino a tre campioni per vetrino ben separati e consente l&#39;impiego di molto piccoli volumi di soluzione di anticorpi in immuno-FISH. Inoltre, la zona chiazze può essere ridotto al minimo se il numero di cellule sono bassi. </li><li> Topo cellule epatiche fetali <ol><li> Raccogliere ogni E13.5 il mouse fegato fetale a circa 1,5 ml di PBS e risospendere pipettando su e giù. Spin in microcentrifuga a 3.000 rpm per 2 min. Ripetere lava tre volte. Al lavaggio ultimi, cellule filtrare attraverso un setaccio 70 micron. Risospendere le cellule da un fegato in 160 l di PBS e utilizzare 50 μ per ogni posto. Lasciare le cellule per 2 minuti a temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mouse ES Cellule 1. Cellule ES di topo non si attaccano facilmente alla diapositiva. In una diapositiva, cerchio l&#39;area delle celle verrà avvistato su con una penna idrofobo. Preparare una sospensione di 20.000-50.000 cellule per 80-100 microlitri nel normale terreno di coltura, pipetta in circolo e partono da allegare per circa 3 ore in un incubatore umidificato. Nota: In alternativa, le cellule staminali possono essere coltivate su vetrini, ma poi formare colonie che potrebbero ostacolare l&#39;imaging automatizzati. </li><li> Cellule fissate 1. Alcuni esperimenti richiedono l&#39;uso di cellule fisse che non si attaccano alle diapositive da soli. Filatura dolci a 300 rpm per 3 minuti usando una citocentrifuga conserva la struttura tridimensionale delle cellule e assicura che le cellule non cadono. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tipo di cella </td><td> Sospensione in </td><td> Tempo di assestamento </td><td> Commento </td></tr><tr><td> Topofegato fetale </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sulla panchina </td></tr><tr><td> Topo ES </td><td> DMEM con gli integratori </td><td> 4 ore </td><td> 37 ° C in incubatore umidificato </td></tr><tr><td> Linfociti mouse </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> Sulla panchina </td></tr><tr><td> Topo P20 cellule germinali </td><td> Fissare in soluzione </td><td> Cytospin </td><td> Sulla panchina </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Per fissare le cellule, delicatamente immergere diapositive nel 4% PFA (ATTENZIONE: eseguire in cappa) per 10 min. Fissare le cellule con la slitta piatta in un vassoio per la migliore conservazione di cellule (per esempio 50 ml 4% PFA nel coperchio di una scatola di punta). Nota: Questo passo non si applica alle cellule fisse prima di attaccamento alle diapositive. </li></ol> Per tutte le fasi successive, utilizzare 50 ml o 100 ml vaschette Coplin. Fare attenzione a non raschiare le cellule off quando si spostano le diapositive tra vasi. <ol start="4"><li> Quench in 0.1 M Tris-Cl, pH 7,4 per 10 minuti a RT. </li><li> Permeabilize cellule in 0,1% saponin/0.1% Triton X-100 in PBS per 10 minuti a RT. </li><li> Lavare due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Incubare per almeno 20 min a 20% glicerolo / PBS a RT. Nota: A questo punto, i vetrini possono essere memorizzati in 50% glicerolo / PBS a -20 ° C per almeno diverse settimane. E &#39;stato osservato che la memorizzazione per almeno un giorno si traduce in un aumento della forza del segnale 9. Ricalibrare a temperatura ambiente 20% di glicerolo / PBS prima di procedere. Nota: Questo è un punto comodo per iniziare a precipitare le sonde (vedi 2.1.1). </li><li> 3x congelamento / scongelamento in azoto liquido. Immergere una diapositiva alla volta in azoto liquido utilizzando un piccolo dewar. Ritirare dopo pochi secondi e un caratteristico rumore di scoppio, e posto su un tovagliolo di carta per lo sbrinamento. Attendere opaco glicerolo congelato per scomparire poi congelare di nuovo. Fino a 15 diapositive può essere fatto comodamente a rotazione per tre cicli di congelamento / scongelamento. </li><li> Wcenere due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Incubare in HCl 0,1 M per 30 minuti a RT. </li><li> Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Permeabilize nel 0,5% saponin/0.5% X-100/PBS Triton per 30 min a RT. </li><li> Lavare due volte in PBS per 5 min a RT. </li><li> Equilibrare nel 50% formamide/2x SSC per almeno 10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Sonda Pipetta su un vetrino. Rimuovere diapositiva dal vaso e asciugare il liquido in eccesso intorno al punto cellulare (s) con un tovagliolo di carta. Come si asciuga rapidamente formammide, fare attenzione a non asciugare cellule. Per le diapositive con due o tre punti di cellule, applicare 10 ml di sonda per ogni posto su di un 22 millimetri x 50 mm coprioggetto corrispondente per individuare posizione nella diapositiva. Inverti coprioggetto sul vetrino sopra spot (s). Sigillare con mastice e permettere che questo si asciughi completamente. Proteggere dalla luce in tutte le fasi successive. </li><li> Diapositive di calore a 78 ° C per esattamente 2 minuti su una piastra calda (ad esempio un blocco di riscaldamento rovesciata, PUNTO CRITICO: vedi la discussione). Mettere un coperchio (scatola di cartone o sim<html> Ilar) sopra il piatto caldo al riparo dalla luce durante la denaturazione. </li><li> Incubare per una notte a 37 ° C in una camera umidificata a tenuta di luce. Per umidificare, mettere gli asciugamani di carta in una scatola a tenuta di luce e di inumidire con acqua. </li></ol> 2.2 Giorno 2 <ol><li> Preparare vaschette Coplin con soluzioni alla giusta temperatura per le successive fasi di lavaggio. Proteggere i vetrini dalla luce il più possibile durante tutte le fasi successive. Un caffè può fa una buona copertura a tenuta di luce per vaschette Coplin. </li><li> Staccare mastice e luogo vetrino in SSC 2x fino coprioggetto allentare e sfilare. </li><li> Lavare a 50% formamide/2x SSC per 15 min a 45 ° C. Mettere il coperchio sulla bagnomaria per proteggerlo dalla luce. </li><li> Lavare a 0.2x SSC per 15 min a 63 ° C. </li><li> Lavare in SSC 2x per 5 min a 45 ° C. </li><li> Lavare in 2x SSC per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Lavare in PBS per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Colorare con DAPI (5 mg / ml in 2x SSC) per 2 minuti in una vaschetta Coplin a RT. </li></ol>contenuto &quot;&gt; Nota: La soluzione DAPI può essere conservato a 4 ° C al buio per 2 mesi. <ol start="9"><li> Destain in PBS per 5 min a RT. </li><li> Per montare il coprioggetti, pipetta mezzo di montaggio su un vetrino. Utilizza 10 microlitri per posto cella, da 22 mm x 22 mm coprioggetto per uno spot, e 22 mm x 50 coprioggetto mm per 2-3 punti. Asciugare PBS intorno al punto cella il più possibile, ma attenzione a non far seccare le cellule. Inverti coprioggetto sul vetrino, e sigillare con smalto. </li></ol>

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</ol>

La produzione di questo articolo è stato in parte sponsorizzato da Carl Zeiss e MetaSystems.

FISH 3D DNA è diventato uno strumento ampiamente riconosciuto per analizzare disposizioni spaziali nel nucleo. Mentre il pesce fornisce risultati visivi e diretti, come con ogni tecnica, bisogna essere consapevoli dei suoi limiti. FISH DNA affronta il problema intrinseco che i trattamenti relativamente dure sono necessarie per rendere cromatina accessibile per sonde FISH che alla fine interrompe nucleare struttura-la cosa che deve essere analizzato. Diverse strategie sono state perseguite a destreggiarsi tra accessibilità e la conservazione della struttura. Nel protocollo qui descritto, il DNA cromosomico viene resa accessibile dal congelamento-scongelamento permeabilizzazione delle cellule e denaturazione termica prima di ibridazione della sonda. Solovei, et al., (2002) ha analizzato cambiamenti strutturali dopo trattamento simile ed ha trovato che lo spostamento medio dei domini cromatinici era 300 nm che limita la risoluzione di analisi strutturale a circa 1 Mb regioni nel genoma 8. Mentre questo non è alta risoluzione, essaè un ragionevole per analizzare la posizione nucleare. Una considerazione più pratica per l&#39;analisi FISH è che l&#39;acquisizione dell&#39;immagine e misure di distanze nucleari sono processi richiede tempo che limitano il numero di nuclei che può essere analizzato. Al fine di studiare eventi rari abbiamo cercato di fare imaging ad alta velocità automatizzato. Poi, con comandi idonei in atto, numero sufficiente possono essere confrontati per permettere l&#39;analisi statistica robusta delle relazioni spaziali. Noi abitualmente Analizziamo 600 nuclei per ogni punto di dati per il quale si determinano le coordinate 3D di tutti i segnali FISH all&#39;interno del volume nucleare. Questi dati richiedono poco spazio di archiviazione e consentono l&#39;analisi di inter-e intra-allelica distanze o posizioni radiali in qualsiasi momento successivo. Inoltre, il trattamento automatizzato può essere fatto in modo cieco ricercatore che riduce notevolmente la probabilità di distorsione inconsapevole. Per abilitare questo tipo di analys ad alto rendimentosi, il nostro obiettivo era quello di stabilire un modo veloce ed efficiente di eseguire FISH DNA. Abbiamo trovato il protocollo qui descritto per essere estremamente robusta, costantemente produrre segnali luminosi a basso fondo. Ha funzionato per tutti i tipi di cellule che abbiamo provato fornito abbiamo adattato la fase di fissare le cellule al vetrino. Inoltre, con una sola eccezione, tutti i BAC abbiamo utilizzato potrebbero essere trasformate in sonde luminose. Abbiamo anche rilevato con successo un certo numero di proteine ​​nucleari mediante colorazione anticorpale dopo FISH DNA. Mentre per alcune proteine ​​questo funziona bene, si consiglia di confronto con immunofluorescenza tradizionale (IF) per garantire la coerenza del pattern di colorazione anticorpale tra IF e DNA immuno FISH (cfr. 11). Generalmente, abbiamo trovato che sonde marcate in diversi colori producevano gli stessi risultati. Tuttavia, i seguenti aspetti devono essere considerati quando si sceglie il colorante etichettatura. Prima, il colore del fluoroforo deve essere ben rilevabile con il microscopio uSED. In secondo luogo, la lunghezza d&#39;onda della luce emessa dai fluorofori dovrebbe essere sufficientemente diverso per evitare sanguinare attraverso nell&#39;altro canale. Questo dipenderà filtri nel microscopio. E terzo, almeno nelle nostre mani, alcuni colori producono segnali luminosi più coerente di altri. Abbiamo sempre usato DAPI (blu) come di contrasto che rende Alexa Fluor 555 (rosso), 488 (verde), e 647 (rosso lontano) buone scelte per l&#39;etichettatura di sonde. Con il nostro sistema di imaging, abbiamo trovato Alexa Fluor 555 (rosso) per produrre i segnali luminosi, seguiti da Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (rosso lontano) ha lo svantaggio che non può essere rilevata dall&#39;occhio umano e quindi non segnali può essere visto quando guardando il microscopio. Così, se facendo FISH a due colori, si consiglia la combinazione di coloranti rossi e verdi. Possono sorgere due problemi principali: le cellule lavare via le diapositive e segnali deboli. Come le cellule e aderire alla diapositiva è betw estremamente variabiletipi di cellule een, e il miglior protocollo per risolvere / seme le cellule devono essere determinati. Abbiamo utilizzato con successo sia con carica positiva o vetrini rivestiti di poli-L-lisina (acquistati pronti per l&#39;uso), ma abbiamo trovato le cellule generalmente rispettati meglio vetrini rivestiti di poli-L-lisina. Abbiamo anche scoperto che quando le cellule erano intere zone troppo dense avrebbe tolto come un foglio, mentre l&#39;imaging automatizzato è stato ostacolato se le cellule erano troppo scarsi. Così, se il campione non è troppo preziosa, numeri cellulari differenti dovrebbero essere seminate per determinare la densità ideale. Se le cellule sono particolarmente inclini a lavare, una penna barriera idrofobica può essere utilizzato, e passi FISH può essere eseguita con una pipetta con attenzione le soluzioni direttamente sul vetrino. Pipettaggio inoltre riduce drasticamente i volumi dei reagenti necessari, ma richiede molto più tempo quando si fa più diapositive. I segnali deboli sono di solito a causa di sonde poveri, e vale la pena di investire tempo nel fare buoni. Clean BAC DNA deve essere un usod come materiale che può essere ottenuto mediante ripetute precipitazione o kit disponibili in commercio partenza. Contaminazione con DNA genomico batterico influisce negativamente sulla qualità sonda e accurato trattamento durante la lisi cellulare e filtraggio del lisato cellulare è necessaria per mantenerlo al minimo. E &#39;, tuttavia, non è necessario utilizzare un passo esonucleasi per digerire il DNA lineare, in quanto ciò riduce notevolmente rendimento. Etichettatura efficiente della sonda è di fondamentale importanza. Il controllo di qualità più importante per questo passaggio sta controllando la dimensione del frammento dopo la traduzione nick (vedi Rappresentante dei risultati). Un &#39;buon&#39; striscio quasi sempre si tradurrebbe in un brillantemente sonda colorata. Tuttavia, abbiamo trovato che occasionalmente un certo BAC non può essere trasformato in una buona sonda, e una diversa BAC deve essere scelto. Un altro passo importante è la denaturazione al calore. Se la temperatura è troppo bassa, il DNA sarà solo parzialmente denaturate e ibridazione sonda sarà compromessa. Se la temperatura è troppo elevata, la struttura nucleare will essere turbato più del necessario. Nelle nostre mani, 78 ° C su blocco calda invertito è il compromesso ideale, ma questo può variare a seconda del rispettivo blocco calda utilizzata. Abbiamo avuto buoni risultati utilizzando montaggio Vectashield medie, ma ha scoperto che SlowFade Oro ha meno di fondo e mantiene il segnale fluorescente a lungo. Si sconsiglia l&#39;utilizzo di hard-set di mezzo di montaggio, come abbiamo trovato che questo influisce struttura 3D e di formare bolle d&#39;aria nel corso del tempo. In conclusione, brillantemente fluorescenti sonde marcate direttamente insieme al protocollo FISH DNA qui descritti offrono una soluzione efficiente per l&#39;analisi robusta e rapida dell&#39;architettura nucleare che è applicabile ad un&#39;ampia varietà di questioni biologiche.

DNA ibridazione in situ fluorescente (FISH DNA) permette la visualizzazione tridimensionale dei singoli loci genici, domini subchromosomal e anche interi cromosomi durante tutte le fasi del ciclo cellulare. FISH 2D viene utilizzato per studi metafase mentre FISH 3D è stato ampiamente utilizzato per sondare il rapporto tra l&#39;organizzazione spaziale del genoma e la sua funzione durante l&#39;interfase (1,2 e riferimenti ivi citati). Storicamente, gli studi di co-associazione sono stati eseguiti da indagando decine a centinaia di singoli loci dai pesci. Tecniche più recentemente potente high throughput 3C-based come 4C e Hi-C sono stati sviluppati 3, permettendo l&#39;indagine molecolare, cross-talk tra molte migliaia di differenti loci. Mentre le tecniche di 3C-based e FISH DNA possono essere metodi complementari, non necessariamente rispondere alle stesse domande. Metodi basati 3C forniscono una lettura insieme di popolazioni cellulari miste, con un conseguente probalità per la co-associazioni. Al contrario, mentre in basso rendimento, le tecniche base di pesce offrono la possibilità di analizzare le disposizioni spaziali di loci o cromosomi nelle cellule individuali in base alle loro diverse fasi del ciclo di sviluppo o cellulare. Quindi, FISH continuerà ad essere un importante strumento per sondare i rapporti struttura-funzione nucleari. Ci sono due considerazioni importanti nello svolgimento di successo esperimenti di FISH 3D. Questi sono: 1. ottenendo sonde marcate in modo ottimale e 2. scelta di trattamenti cellulari, compresa la fissazione, pre e procedura post-ibridazione, per preservare morfologia nucleare il più possibile rendendo DNA sufficientemente accessibile per l&#39;ibridazione della sonda. Etichettatura sonda efficiente è di fondamentale importanza per i pesci. Tradizionalmente, nick-translation è stato usato per introdurre o aptene o nucleotidi fluoroforo-coniugati 4. Allo stesso modo, i kit commerciali nick-traduzione sono disponibili per aptene diretta o fluoroforo incorporazione, but anche per l&#39;etichettatura in due fasi utilizzando nucleotidi aminoallyl e coloranti ammina-reattiva. Quest&#39;ultimo rende incorporazione colorante più efficace dando polimerasi DNA una molecola meno ingombrante con cui lavorare. Più recentemente, kit per l&#39;etichettatura non enzimatica di DNA sono stati sviluppati che sfruttano legame coordinativo di platino per acidi nucleici. Sonde FISH possono anche essere acquistati già etichettato 5. Mentre i kit e le sonde prodotte commercialmente senza dubbio dare la facilità d&#39;uso, sono notevolmente più costosi rispetto all&#39;acquisto dei singoli componenti e la produzione di sonde in-house. Abbiamo ottimizzato un protocollo di traduzione nick a basso costo al fine di etichettare direttamente molte diverse sonde BAC in più colori. Abbiamo scoperto che l&#39;ottenimento di DNA altamente puro BAC è critica e risultati in un requisito per solo il 10-20 ng di sonda per vetrino FISH, rispetto a 10-20 volte più quando viene utilizzato impuro DNA stampo, con conseguente maggiore costo e tempo- risparmio. L&#39;uso di ammino-allyldUTP permette di etichettatura flessibilesonde con coloranti ammina-reattivi disponibili (ad esempio, Alexa Fluor o Cy-coloranti) o apteni (es. biotina, digossigenina). Aptene-sonde marcate vengono rilevati da anticorpi coniugati fluoroforo o streptavidina per amplificare e visualizzare il segnale. Luminoso sonde marcate direttamente mostrano generalmente meno la colorazione di fondo e di evitare sovra-amplificazione dei segnali, e quindi una conseguente rappresentazione più accurata della localizzazione nucleare e locus morfologia. Ci sono diverse tecniche di pesci diversi che utilizzano diversi fissativi, pre-trattamenti e lavaggi post-ibridazione, ma questi generalmente rientrano nelle seguenti categorie: fissazione glutaraldeide con NaOH denaturazione, la fissazione di formaldeide con HCl denaturazione, e la fissazione di formaldeide con denaturazione al calore 6-9 . Ognuno di questi ha vantaggi e svantaggi. Glutaraldeide risultati fissaggio in buona conservazione strutturale nucleare, ma richiede un trattamento con agenti riducenti per ridurre al minimol&#39;autofluorescenza risultante, e il trattamento NaOH deve essere attentamente controllato per bilanciare sufficiente denaturazione del DNA e potenziali danni alla struttura nucleare 6. Fissazione formaldeide è meno forte, dando una maggiore probabilità di perturbazioni di architettura nucleare, ma anche in genere dando segnali più forti e più affidabile e più bassi autofluorescenza 9. HCl trattamento depurinates DNA e ne estrae le proteine, che fornisce un facile accesso al DNA per le sonde, ma può anche introdurre rotture del DNA. Riscaldamento separa fisicamente i due filamenti di DNA con conseguente buona ibridazione target e segnali forti, ma può causare qualche perturbazione della struttura nucleare 8. Il grado in cui ciascuna di queste tecniche affetti epitopi proteici varia ampiamente 6,9, con la conseguente esigenza di determinare sperimentalmente per ogni proteina il protocollo ottimale da utilizzare in esperimenti di immuno-FISH. Mentre non vi è alcun &#39;perfetto&#39; DNA FISH technique, tutti possono essere utili se ben controllata. Nostro obiettivo era ottimizzare un protocollo per robusto e riproducibile FISH DNA per indagare posizionamento spaziale dei loci multipli in una varietà di tipi cellulari 10, concentrandosi sul metodo di riscaldamento per la maggior parte dei segnali affidabili. Con questo e l&#39;uso di un sistema di imaging automatizzato abbiamo puntato ad aumentare il throughput per l&#39;analisi di singole cellule di accordi nucleari.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Tampone NTB</td><td>Passaggio 1.1.1 (Vedere l'elenco 'Tamponi FISH e miscele di reazione' di seguito)</td>DTT Invitrogen D-1532 Passaggio 1.1.1 dNTP Bioline BIO-39025 Passaggio 1.1.1 (Vedere l'elenco 'Tamponi FISH e miscele di reazione' di seguito)Aminoallyl-dUTP Ambion <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>AM8439</td><td>Passaggio 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA polimerasi I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Passaggio 1.1.1</td></tr><tr><td>DNasi I RNasi ricombinante senza Roche</td><td></td><td>4716728001</td><td>Passaggio 1.1.1</td></tr><tr><td>Kit di purificazione QIAquick PCR</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Passaggio 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Passaggio 1.1.5, Passaggio 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Passaggio 1.2.1</td></tr><tr><td>Decapacks di coloranti reattivi Alexa Fluor per applicazioni di microarray</td><td>Invitrogen (sonde molecolari)</td><td>A32750, A32756, A32757</td><td>Passaggio 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (anidro) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Passaggio 1.2.2</td></tr><tr><td>Colorazione gel DNA sicura SYBR</td><td>Life</td><td>Technologies S33102</td><td>Passaggio 1.2.4 (alternativa al bromuro di etidio)</td></tr><tr><td>Cot-1 DNA</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Passaggio 2.1.1.1 (Il DNA Cot-1 può essere prodotto in casa in grandi quantità e funziona altrettanto bene)</td></tr><tr><td>DNA a filamento singolo da testicoli di salmone </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Passaggio 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Formamide deionizzata</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Passaggio 2.1.1.3 (Pericolo per la salute)</td></tr><tr><td>Solfato di destrano</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>Passaggio 2.1.1.4 (Vedere l'elenco "Tamponi FISH e miscele di reazione" di seguito)</td></tr><tr><td>Sonde di verniciatura XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Passaggio 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Vetrini rivestiti in poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Passaggio 2.1.2</td></tr><tr><td>Penna idrofobica (ImmEdge)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Passaggio 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m setaccio (Topo f&#8211; BD</td> <td>Falcon</td><td>352350</td><td>Passaggio 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Passaggio 2.1.3 (Infiammabile, corrosivo, tossicità acuta, pericolo per la salute) (Vedere l'elenco "Tamponi FISH e miscele di reazione" di seguito)</td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Passaggio 2.1.3 (Vedere l'elenco "Tamponi FISH e miscele di reazione" di seguito)</td></tr><tr><td>Saponina dalla corteccia di Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Fase 2.1.4, 2.1.11 (Tossicità acuta), (vedere l'elenco "Tamponi FISH e miscele di reazione" di seguito)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Fase 2.1.4, 2.1.11 (Tossicità acuta, pericolosa per l'ambiente)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Fase 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Fase 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Fase 2.1.9 (Tossicità acuta, corrosiva)</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Fase 2.1.14, 2.2.3 (Pericolo per la salute)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Fase 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Vedere l'elenco "Tamponi FISH e miscele di reazione" di seguito)</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Fase 2.1.15</td></tr><tr><td>Vetrini coprioggetti 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Passaggio 2.1.15</td></tr><tr><td>Cemento di gomma</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Passaggio 2.1.15 (Infiammabile, pericolo per la salute, pericolo per l'ambiente)</td></tr><tr><td></td><td>Sonde molecolari DAPI Invitrogen</td><td>D3571</td><td>Passaggio 2.2.8 (pericolo per la salute)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Passaggio 2.2.10 (supporto di montaggio)</td></tr><tr><td>Smalto trasparente</td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Passaggio 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific Step</td><td></td><td>1.1.6, 1.2.4 (spettroscopia di microvolumi)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Step 1.2.4</td></tr><tr><td>Barattoli Coplin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Step 2.1.3 in poi</td></tr><tr><td>Dewar di azoto liquido </td><td>Qualsiasi fornitore</td><td></td><td>Step 2.1.7</td></tr><tr><td>Base con coperchio nero (camera a tenuta di luce)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Passaggio 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Passaggio 2.2.3 (o utilizzare l'agitatore in un 37 &deg; C room)</td></tr><tr><td colspan="4">Imaging ed elaborazione delle immagini</td></tr><tr><td>Metafer - Piattaforma di automazione dell'imaging</td> Software di <td>imaging automatizzato</td><td>MetaSystems</td><td></td></tr><tr><td>MetaCyte - Analisi FISH interfasica automatizzata</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Software di imaging automatizzato</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 Microscopio</td><td>verticale per epifluorescenza Zeiss</td><td></td><td>utilizzato con imaging automatizzato</td></tr><tr><td>Microscopio confocale IX81 (FV1000)</td><td>Microscopio confocale</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane, versione 7.3</td><td>Software di analisi delle immagini e modellazione 3D</td><td>Imaris</td><td></td></tr><tr><td>Imaging scientifico del volume, versione 4.1</td><td>Software di analisi e deconvoluzione delle immagini</td> <td>Huygens</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"> FISH tamponi e miscele di reazione <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> </tr> <tr> <td> 10 x tampone NTB</td> <td>0,5 M Tris-HCl, pH 7,5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP Mix</td> <td>0,5 mM dGTP</td> <td>Memorizza 50 &mu; l aliquote a -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0.125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>Pesare 4 g/100 ml di PFA in PBS e riscaldare a 62 °C. Regolare il pH con NaOH a 7,0 per sciogliere il PFA rimanente.</td> <td>Conservare 50 ml di aliquote a -20 &deg; C, non ricongelare</td> </tr> <tr> <td>2 % soluzione di saponina</td> <td>Sciogliere 2 g di saponina per 100 ml di PBS agitando a lungo. Sciogliere e regolare il pH a 7,0 con NaOH. Portare a 1 l con ddH20 e autoclave. </td> <td>Conservare 5 ml di aliquote a -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>Pesare 175,3 g di NaCl e 88,2 g di citrato di sodio e aggiungere a 80 ml di ddH20 . Sciogliere e regolare il pH a 7,0 con NaOH. Portare a 1 l con ddH20 e autoclave.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>Destrano solfato di miscela</td> <td>20 % di destrano solfato in 2 x tampone SSC; Agitare la soluzione e mescolare su un bilanciere durante la notte.</td> <td>Store 500 &mu; l aliquote a -20 &deg; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

robusto fish 3d dna con sonde marcate direttamente

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

FISH 3D DNA è diventato uno strumento importante per analizzare l&#39;organizzazione tridimensionale del nucleo, e diverse variazioni della tecnica sono stati pubblicati. In questo articolo descriviamo un protocollo che è stato ottimizzato per la robustezza, la riproducibilità e la facilità d&#39;uso. Vivaci fluorescenti sonde marcate direttamente sono generati da nick-translation con amino-allyldUTP seguita da accoppiamento chimica del colorante. FISH 3D DNA viene eseguita utilizzando una fase di congelamento-scongelamento per permeabilizzazione cellulare e una fase di riscaldamento per denaturazione simultanea di sonda e DNA nucleare. Il protocollo è applicabile ad una gamma di tipi di cellule e una varietà di sonde (BAC, plasmidi, fosmidi, o vernici Chromosome interi) e permette l&#39;imaging automatizzato ad alta produttività. Con questo metodo abbiamo quotidianamente indaghiamo localizzazione nucleare di un massimo di tre regioni cromosomiche.

Il protocollo qui descritto (Figura 1 per una panoramica), è stato utilizzato con grande effetto per combinare FISH DNA con l&#39;acquisizione di immagini ad alta velocità per l&#39;analisi di organizzazione genomica. La generazione di sonde di buona qualità è fondamentale per il successo (vedi discussione). Figura 2 mostra due importanti controlli di qualità per le sonde FISH. Dopo nick-translation, uno striscio di DNA dovrebbe essere visibile con la maggior parte dei frammenti in esecuzione tra i 150 e 700 bp (Figura 2A). Dopo accoppiamento chimico, incorporazione del colorante fluorescente può essere misurato mediante analisi spettroscopica della sonda (Figura 2B). Quando si utilizza buone sonde, seguendo il protocollo FISH DNA di solito si traduce in segnali FISH DNA luminose a basso fondo. Abbiamo utilizzato con successo questo protocollo su una varietà di diversi tipi di cellule, e sia con microscopi a fluorescenza o confocale. L&#39;imaging automatico utilizzando un epi-fluorescence microscopio richiede taglienti, segnali FISH facilmente identificabile con sfondo poco (Figura 3), mentre la microscopia confocale richiede segnali più intensi. Figura 4A mostra immagini elaborate rappresentative. Coordinate nucleari di segnali FISH possono essere ottenuti, e le relazioni spaziali di regioni genomiche possono essere calcolati (per un esempio vedere la Figura 4B). Abbiamo anche utilizzato stack di immagini ottenute al microscopio confocale per la modellazione 3D di segnali FISH nei loro territori cromosomici (Movie 1). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Figura 1. Flusso di lavoro per l&#39;etichettatura e la sonda FISH DNA. Preparazione della sonda è in blu. Procedimento FISH DNA appare in bianco con dettagli forniti nel verde. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Figura 2. Etichettatura sonde da nick-traduzione e il controllo di qualità delle sonde marcate. A) Gel mostrando striscio ideale prima di riscaldamento per inattivare DNasi I (corsia 1: scala del DNA, corsia 2 e 3: BAC dopo nick-translation). Frammenti dovrebbero essere nel range 150-700 bp. Un ulteriore striscio a ~ 1 kb è frequentemente osservata con successo reazioni nick-traduzione. B) Microvolume analisi spettro completo di sonde marcate. Un picco di DNA a 260 nm si osserva con un secondo picco corrispondente alla lunghezza d&#39;onda di assorbimento del fluoroforo della sonda è marcato con: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. Visualizzati sono tre sonde con buona incorporazione: picchi di assorbimento fluorofori sono una altezza simile o superiore a quella dei picchi di DNA. Alexa Fluor 647 ha in genere maggiore assorbanzadi Alexa Fluor 555, che a sua volta ha assorbanza superiore Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 assorbe anche qualche luce a 260 nm, quindi il primo picco di tale sonda è superiore alle altre. Sonde con scarsa incorporazione spettacolo fluoroforo assorbanza 2-3 volte inferiore rispetto alla assorbanza DNA. Sonde con più di 2 volte superiore picco fluoroforo di DNA di picco in genere contengono colorante non coniugata che possono causare sfondo nel pesce. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Figura 3. Screenshot del software di imaging 3D FISH MetaCyte che mostra un tipico esperimento di FISH a tre colori. Lo schermo è diviso in più parti. A) campo di vista (FOV) immagini Raw catturata dal Metafer / sistema di scansione MetaCyte diapositiva. B) Galleria di immagini di nuclei identificati che hanno Onuelaborazione di immagini dergone e segmentazione per segnali FISH. Vari tipi di dati possono essere visualizzati su ogni immagine galleria. In questo esempio, il numero di cellulare viene visualizzato in alto a sinistra con varie interallelic e interlocus distanze alto a destra e su entrambi i lati sotto ogni immagine. C) nome della diapositiva con il numero di nuclei individuati nell&#39;analisi. D) Rappresentazione della slitta con l&#39;area acquisita dal sistema. E) Allargamento della zona sottoposta a scansione. Macchie bianche rappresentano nuclei individuati per FOV. F) I dati elaborati. In questo esempio vengono mostrati massime distanze interallelic tra i segnali verdi (in alto) e segnali rossi (in basso). I dati indicati sono da topo P20 cellule germinali. Le sonde si trovano su cromosomi diversi, che coprono Hbb e geni HBA e un cluster istoni. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Entro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Figura 4. Esempi di immagini elaborate e dati posizionali derivati. A Immagini) trattati per E13.5 topo cellule epatiche fetali marcate con sonde BAC situati su cromosomi diversi che coprono Myc e KCNQ1 geni (chiamati myc e KvDMR, di colore verde e rosso, rispettivamente). B) Tukey box-whisker che rappresentano la distanza interallelic distribuzione per gli stessi loci in 600 nuclei. Distanza Interallelic è tracciata come una frazione del raggio del nucleo &#39;(distanza / raggio) per tenere conto di variazioni di dimensione nucleare. Nuclei delle cellule ES hanno un raggio di circa 5 micron. Raggi rossi sono significativamente inferiore a quello di sonde verdi (***: p &lt;0.01, spaiati t-test). Dati da 10. Movie 1. Modellazione 3D di due loci nel loro cromosoma territory. Due sonde BAC situati vicino alle estremità di topo cromosoma 7 sono stati etichettati (rosso e rosso lontano, (bianco pseudo-colorato)) e ibridati con una vernice cromosoma intero (verde) di topo cellule ES. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Clicca qui per vedere film</a> .

Descriviamo un protocollo robusto e versatile per l&#39;analisi dell&#39;architettura nucleare dalla FISH DNA 3D utilizzando sonde fluorescenti direttamente etichettati.

Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare in modo robusto l'organizzazione spaziale di specifici loci genomici in singole cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando sonde marcate con fluorocromo che si legheranno e metteranno in evidenza la regione genomica di interesse. I passaggi successivi consistono nell'adesivare, fissare e permeabilizzare le cellule di interesse su un vetrino, in modo da consentire l'accesso delle sonde.Successivamente, una denaturazione termica simultanea della sonda e del DNA cellulare è seguita da passaggi di lavaggio per ibridazione della sonda da eseguire tutta la notte, al fine di rimuovere la sonda legata in modo non specifico e da un controllavaggio con dpi. Per visualizzare il nucleo cellulare, i risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza riveleranno infine la posizione nucleare occupata da specifiche regioni genomiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'organizzazione nucleare, come la determinazione di interazioni funzionali tra geni.Il vantaggio principale di questo particolare protocollo di FISH su DNA è che è rapido, robusto e versatile. Sebbene dimostriamo questo metodo utilizzando cellule staminali embrionali di E, può essere applicato anche a numerose altre tipologie cellulari. Sonde marcate direttamente ottenute da frammenti di 100-250 chilobasi producono in modo costante segnali intensi, qualora siano richieste sonde di dimensioni inferiori.Utilizzare smid di 40-50 chilobasi o anche plasmidi contenenti inserti di cinque-dieci chilobasi. Identificare le copie genomiche o le copie smid corrispondenti a geni specifici mediante i browser genomici Ensemble o UCSC. Per preparare DNA genomicico di alta qualità, utilizzare o la precipitazione ripetuta o un kit commercialmente disponibile; la purezza della preparazione è proporzionale al volume di sonda richiesto.Eseguire l'etichettatura in due passaggi. Prima, utilizzare la traduzione NIC per introdurre l'amino allele, DUTP. In secondo luogo, utilizzare un'accoppiamento chimico per attaccare un colorante reattivo AM.Vale la pena investire del tempo nella preparazione di sonde fluorescenti intense, poiché queste sono fondamentali per ottenere segnali FISH forti. Questa procedura può essere eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve necessariamente essere effettuata all'inizio della giornata. Innanzitutto, mescolare da 10 a 20 nanogrammi di sonda marcate direttamente con sei microlitri di CO 1D NA per sei microgrammi.Quindi aggiungere un microlitro di DNA a singolo filamento proveniente dai testicoli di salmone per 9,7 microgrammi. Portare il volume della miscela a 100 microlitri aggiungendo acqua. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio 3 M e 275 microlitri di etanolo e mescolare mediante vortexaggio.Lasciare precipitare la miscela per almeno un'ora a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il precipitato in una microcentrifuga alla velocità massima per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet con etanolo al 70% e centrifugare nuovamente per cinque minuti a quattro gradi Celsius.Successivamente, lasciare asciugare all'aria il pellet. Quindi risospendere in cinque microlitri di forma deionizzata.Amide a 37 gradi Celsius, agitando a 1000 giri al minuto, proteggendolo dalla luce con della stagnola. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di solfato di destrina, mescolare e proseguire l'incubazione con agitazione. Per ulteriori 10 minuti, la propensione delle cellule ad aderire al vetrino varia notevolmente in base al tipo cellulare.Per ogni tipo di cellula, determinare empiricamente il tempo di sedimentazione e la densità cellulare ottimali. Per ottenere risultati costanti, le cellule devono trovarsi in sospensione singola. Per far aderire le cellule staminali embrionali di topo su un vetrino, iniziare tracciando un cerchio nell'area del vetrino in cui verranno depositate le cellule.Utilizzando una penna idrofoba, preparare una sospensione di 20-50.000 cellule per 80-100 microlitri in mezzo di coltura normale, aggiungere la sospensione cellulare all'interno del cerchio e lasciare attaccare le cellule per circa tre ore in un incubatore umidificato. Dopo l'adesione delle cellule al vetrino, fissare le cellule immergendo delicatamente il vetrino in PFA al 4% per 10 minuti. Il vetrino deve essere posizionato in posizione orizzontale in un contenitore simile a una scatola per punte.Utilizzo di reagenti a temperatura ambiente in barattoli coplan. Primo, spegnere le cellule con cloruro di tris per 10 minuti. Secondo, permeabilizzare le cellule utilizzando una miscela di sapina e Triton X-100 per 10 minuti.Ora lavare le cellule due volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, incubare le cellule in glicerolo al 20% per almeno 20 minuti. A questo punto, i preparati possono essere conservati in glicerolo al 50% a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane.La conservazione per un giorno o più dovrebbe aumentare l'intensità del segnale. Assicurarsi di equilibrare le cellule a temperatura ambiente in glicerolo al 20% in PBS prima di procedere. A questo punto, congelare e scongelare il vetrino tre volte utilizzando azoto liquido.Un vetrino alla volta, quando il suono di scricchiolio cessa. Dopo alcuni secondi, rimuovere il vetrino e appoggiarlo su un tovagliolo di carta per scongelare, attendendo che la glicerolo congelata opaca scompaia prima di congelare nuovamente il vetrino; comodamente fino a 15 vetrini possono essere trattati in successione per tre cicli di congelamento-scongelamento. A questo punto, lavare i vetrini due volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio.Quindi incubare i vetrini in acido cloridrico 0,1 M per 30 minuti. Dopo il trattamento con acido cloridrico, eseguire un altro lavaggio di cinque minuti in PBS. A questo punto, permeabilizzare nuovamente le cellule con una miscela più concentrata di sapone e Triton X-100 per 30 minuti; per rimuovere i tensioattivi dai vetrini, utilizzare due lavaggi in PBS di cinque minuti ciascuno.I vetrini sono ora pronti per raggiungere l'equilibrio in 50% formammide in XSSC. Questa fase deve durare almeno 10 minuti; durante l'equilibrazione, prelevare la sonda aspirando e dispensando alcune volte, quindi trasferire 10 microlitri per ogni punto cellulare su un'immersione delle dimensioni appropriate. Estrarre un vetrino dalla formammide e asciugare con un fazzoletto di carta qualsiasi liquido in eccesso attorno alle cellule, facendo attenzione a non far seccare il punto cellulare.Ora capovolgere il coperchio. Farlo scivolare sul vetrino sopra le cellule. Sigillare il coperchio al vetrino con cemento di gomma.Lasciare asciugare completamente il cemento e proteggere il vetrino dalla luce. Successivamente, riscaldare i vetrini a 78 gradi Celsius per esattamente due minuti su una piastra riscaldante. È fondamentale eseguire correttamente questa fase.Un coperchio deve proteggere le cellule dalla luce durante questo passaggio per preservare al massimo la morfologia nucleare. È fondamentale evitare che le cellule si secchino e assicurarsi che il termoloc abbia la temperatura corretta. Successivamente, posizionare i vetrini in una scatola impermeabile alla luce con tovaglioli di carta umidi per fornire umidità e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.Iniziare questa procedura staccando il cemento di gomma intorno ai vetrini. Successivamente, posizionare ogni vetrino in SC in eccesso X fino a quando i vetrini non si allentano e scivolano via. Quindi, lavare i vetrini in formammide al 50% in SC in doppio eccesso per 15 minuti a 45 gradi Celsius.Mantenere un coperchio sul bagno termico per proteggerli dalla luce. Quindi lavare le lamelle in 0,2 XSSC per 15 minuti a 63 gradi Celsius. Poi in due XSSC per cinque minuti a 45 gradi Celsius e infine in abbondante SE a temperatura ambiente per cinque minuti.I passaggi rimanenti si eseguono tutti a temperatura ambiente, iniziando con un lavaggio di cinque minuti in PBS; successivamente, colorare i vetrini con DAPI per due minuti e quindi lavare nuovamente i vetrini in PBS per cinque minuti. Per montare il coverslip, applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio per ogni spot cellulare sul coverslip di dimensioni appropriate. Quindi asciugare l’eccesso di PBS attorno allo spot cellulare senza far asciugare le cellule.Rovesciare la copertura, farla scivolare su un vetrino e sigillarla con vernice per unghie seguendo il protocollo di preparazione della sonda per pesci. Dopo la traduzione NIC, dovrebbe essere visibile una macchia di DNA con la maggior parte dei frammenti compresi tra 150 e 700 paia di basi. Dopo l'accoppiamento chimico, l'incorporazione del colorante fluorescente può essere valutata mediante analisi spettroscopica del passaggio della sonda.Questi passaggi di controllo qualità per valutare la qualità della sonda sono fondamentali quando si utilizza una tale sonda. È stato possibile effettuare l’imaging automatizzato con un microscopio a fluorescenza episcopica. Ciò richiede segnali dei pesci nitidi e facilmente identificabili, con un fondo minimo.Questa è un'immagine grezza del campo visivo. Le immagini seguenti rappresentano nuclei che sono stati identificati e analizzati automaticamente. In alto a destra e lateralmente sotto ciascun nucleo sono mostrate varie distanze interalleliche e interlocus.In questo ingrandimento, le macchie bianche rappresentano i nuclei identificati per campo visivo. Questi istogrammi mostrano le distanze massime interalleliche tra i segnali verdi in alto e i segnali rossi in basso. Tutti i dati provengono da cellule germinali P 20 con sonde localizzate su cromosomi diversi che coprono i geni HBB e HBA e un cluster di istoni.Questi sono esempi di nuclei di fegato fetale colorati con sonde retrograde che coprono i geni mic, KC e Q1. Da queste immagini è possibile ottenere le coordinate nucleari dei segnali FISH e calcolare le relazioni spaziali tra regioni genomiche. Le distanze interalleliche sono riportate come frazione del raggio del nucleo.I sonde rosse erano significativamente più vicine tra loro rispetto alle sonde verdi in questi dati. È risultata inoltre fattibile la microscopia confocale, che richiede segnali più intensi. Gli stack di immagini sono stati utilizzati per la modellizzazione tridimensionale dei segnali nei pesci all'interno dei loro territori cromosomici.Questi due sonde in rosso e bianco si trovano vicino a ciascuna estremità del cromosoma sette del topo; l'intera colorazione cromosomica è mostrata in verde. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione fluorescente in situ del DNA (FISH) al fine di studiare il posizionamento spaziale di specifici loci genomici in singole cellule. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che ogni trattamento potrebbe influenzare l'architettura nucleare ed è fondamentale includere opportuni controlli seguendo correttamente la procedura.Altri metodi, come l'immuno FISH, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo le relazioni spaziali tra geni e proteine.

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