Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

L'obiettivo generale del seguente esperimento è studiare in modo robusto l'organizzazione spaziale di specifici loci genomici in singole cellule. Questo risultato si ottiene innanzitutto generando sonde marcate con fluorocromo che si legheranno e metteranno in evidenza la regione genomica di interesse. I passaggi successivi consistono nell'adesivare, fissare e permeabilizzare le cellule di interesse su un vetrino, in modo da consentire l'accesso delle sonde.

Successivamente, una denaturazione termica simultanea della sonda e del DNA cellulare è seguita da passaggi di lavaggio per ibridazione della sonda da eseguire tutta la notte, al fine di rimuovere la sonda legata in modo non specifico e da un controllavaggio con dpi. Per visualizzare il nucleo cellulare, i risultati ottenuti mediante microscopia a fluorescenza riveleranno infine la posizione nucleare occupata da specifiche regioni genomiche. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'organizzazione nucleare, come la determinazione di interazioni funzionali tra geni.

Il vantaggio principale di questo particolare protocollo di FISH su DNA è che è rapido, robusto e versatile. Sebbene dimostriamo questo metodo utilizzando cellule staminali embrionali di E, può essere applicato anche a numerose altre tipologie cellulari. Sonde marcate direttamente ottenute da frammenti di 100-250 chilobasi producono in modo costante segnali intensi, qualora siano richieste sonde di dimensioni inferiori.

Utilizzare smid di 40-50 chilobasi o anche plasmidi contenenti inserti di cinque-dieci chilobasi. Identificare le copie genomiche o le copie smid corrispondenti a geni specifici mediante i browser genomici Ensemble o UCSC. Per preparare DNA genomicico di alta qualità, utilizzare o la precipitazione ripetuta o un kit commercialmente disponibile; la purezza della preparazione è proporzionale al volume di sonda richiesto.

Eseguire l'etichettatura in due passaggi. Prima, utilizzare la traduzione NIC per introdurre l'amino allele, DUTP. In secondo luogo, utilizzare un'accoppiamento chimico per attaccare un colorante reattivo AM.

Vale la pena investire del tempo nella preparazione di sonde fluorescenti intense, poiché queste sono fondamentali per ottenere segnali FISH forti. Questa procedura può essere eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve necessariamente essere effettuata all'inizio della giornata. Innanzitutto, mescolare da 10 a 20 nanogrammi di sonda marcate direttamente con sei microlitri di CO 1D NA per sei microgrammi.

Quindi aggiungere un microlitro di DNA a singolo filamento proveniente dai testicoli di salmone per 9,7 microgrammi. Portare il volume della miscela a 100 microlitri aggiungendo acqua. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio 3 M e 275 microlitri di etanolo e mescolare mediante vortexaggio.

Lasciare precipitare la miscela per almeno un'ora a meno 20 gradi Celsius. Successivamente, centrifugare il precipitato in una microcentrifuga alla velocità massima per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet con etanolo al 70% e centrifugare nuovamente per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Successivamente, lasciare asciugare all'aria il pellet. Quindi risospendere in cinque microlitri di forma deionizzata.

Amide a 37 gradi Celsius, agitando a 1000 giri al minuto, proteggendolo dalla luce con della stagnola. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di solfato di destrina, mescolare e proseguire l'incubazione con agitazione. Per ulteriori 10 minuti, la propensione delle cellule ad aderire al vetrino varia notevolmente in base al tipo cellulare.

Per ogni tipo di cellula, determinare empiricamente il tempo di sedimentazione e la densità cellulare ottimali. Per ottenere risultati costanti, le cellule devono trovarsi in sospensione singola. Per far aderire le cellule staminali embrionali di topo su un vetrino, iniziare tracciando un cerchio nell'area del vetrino in cui verranno depositate le cellule.

Utilizzando una penna idrofoba, preparare una sospensione di 20-50.000 cellule per 80-100 microlitri in mezzo di coltura normale, aggiungere la sospensione cellulare all'interno del cerchio e lasciare attaccare le cellule per circa tre ore in un incubatore umidificato. Dopo l'adesione delle cellule al vetrino, fissare le cellule immergendo delicatamente il vetrino in PFA al 4% per 10 minuti. Il vetrino deve essere posizionato in posizione orizzontale in un contenitore simile a una scatola per punte.

Utilizzo di reagenti a temperatura ambiente in barattoli coplan. Primo, spegnere le cellule con cloruro di tris per 10 minuti. Secondo, permeabilizzare le cellule utilizzando una miscela di sapina e Triton X-100 per 10 minuti.

Ora lavare le cellule due volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio. Dopo i lavaggi, incubare le cellule in glicerolo al 20% per almeno 20 minuti. A questo punto, i preparati possono essere conservati in glicerolo al 50% a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane.

La conservazione per un giorno o più dovrebbe aumentare l'intensità del segnale. Assicurarsi di equilibrare le cellule a temperatura ambiente in glicerolo al 20% in PBS prima di procedere. A questo punto, congelare e scongelare il vetrino tre volte utilizzando azoto liquido.

Un vetrino alla volta, quando il suono di scricchiolio cessa. Dopo alcuni secondi, rimuovere il vetrino e appoggiarlo su un tovagliolo di carta per scongelare, attendendo che la glicerolo congelata opaca scompaia prima di congelare nuovamente il vetrino; comodamente fino a 15 vetrini possono essere trattati in successione per tre cicli di congelamento-scongelamento. A questo punto, lavare i vetrini due volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio.

Quindi incubare i vetrini in acido cloridrico 0,1 M per 30 minuti. Dopo il trattamento con acido cloridrico, eseguire un altro lavaggio di cinque minuti in PBS. A questo punto, permeabilizzare nuovamente le cellule con una miscela più concentrata di sapone e Triton X-100 per 30 minuti; per rimuovere i tensioattivi dai vetrini, utilizzare due lavaggi in PBS di cinque minuti ciascuno.

I vetrini sono ora pronti per raggiungere l'equilibrio in 50% formammide in XSSC. Questa fase deve durare almeno 10 minuti; durante l'equilibrazione, prelevare la sonda aspirando e dispensando alcune volte, quindi trasferire 10 microlitri per ogni punto cellulare su un'immersione delle dimensioni appropriate. Estrarre un vetrino dalla formammide e asciugare con un fazzoletto di carta qualsiasi liquido in eccesso attorno alle cellule, facendo attenzione a non far seccare il punto cellulare.

Ora capovolgere il coperchio. Farlo scivolare sul vetrino sopra le cellule. Sigillare il coperchio al vetrino con cemento di gomma.

Lasciare asciugare completamente il cemento e proteggere il vetrino dalla luce. Successivamente, riscaldare i vetrini a 78 gradi Celsius per esattamente due minuti su una piastra riscaldante. È fondamentale eseguire correttamente questa fase.

Un coperchio deve proteggere le cellule dalla luce durante questo passaggio per preservare al massimo la morfologia nucleare. È fondamentale evitare che le cellule si secchino e assicurarsi che il termoloc abbia la temperatura corretta. Successivamente, posizionare i vetrini in una scatola impermeabile alla luce con tovaglioli di carta umidi per fornire umidità e incubare tutta la notte a 37 gradi Celsius.

Iniziare questa procedura staccando il cemento di gomma intorno ai vetrini. Successivamente, posizionare ogni vetrino in SC in eccesso X fino a quando i vetrini non si allentano e scivolano via. Quindi, lavare i vetrini in formammide al 50% in SC in doppio eccesso per 15 minuti a 45 gradi Celsius.

Mantenere un coperchio sul bagno termico per proteggerli dalla luce. Quindi lavare le lamelle in 0,2 XSSC per 15 minuti a 63 gradi Celsius. Poi in due XSSC per cinque minuti a 45 gradi Celsius e infine in abbondante SE a temperatura ambiente per cinque minuti.

I passaggi rimanenti si eseguono tutti a temperatura ambiente, iniziando con un lavaggio di cinque minuti in PBS; successivamente, colorare i vetrini con DAPI per due minuti e quindi lavare nuovamente i vetrini in PBS per cinque minuti. Per montare il coverslip, applicare 10 microlitri di mezzo di montaggio per ogni spot cellulare sul coverslip di dimensioni appropriate. Quindi asciugare l’eccesso di PBS attorno allo spot cellulare senza far asciugare le cellule.

Rovesciare la copertura, farla scivolare su un vetrino e sigillarla con vernice per unghie seguendo il protocollo di preparazione della sonda per pesci. Dopo la traduzione NIC, dovrebbe essere visibile una macchia di DNA con la maggior parte dei frammenti compresi tra 150 e 700 paia di basi. Dopo l'accoppiamento chimico, l'incorporazione del colorante fluorescente può essere valutata mediante analisi spettroscopica del passaggio della sonda.

Questi passaggi di controllo qualità per valutare la qualità della sonda sono fondamentali quando si utilizza una tale sonda. È stato possibile effettuare l’imaging automatizzato con un microscopio a fluorescenza episcopica. Ciò richiede segnali dei pesci nitidi e facilmente identificabili, con un fondo minimo.

Questa è un'immagine grezza del campo visivo. Le immagini seguenti rappresentano nuclei che sono stati identificati e analizzati automaticamente. In alto a destra e lateralmente sotto ciascun nucleo sono mostrate varie distanze interalleliche e interlocus.

In questo ingrandimento, le macchie bianche rappresentano i nuclei identificati per campo visivo. Questi istogrammi mostrano le distanze massime interalleliche tra i segnali verdi in alto e i segnali rossi in basso. Tutti i dati provengono da cellule germinali P 20 con sonde localizzate su cromosomi diversi che coprono i geni HBB e HBA e un cluster di istoni.

Questi sono esempi di nuclei di fegato fetale colorati con sonde retrograde che coprono i geni mic, KC e Q1. Da queste immagini è possibile ottenere le coordinate nucleari dei segnali FISH e calcolare le relazioni spaziali tra regioni genomiche. Le distanze interalleliche sono riportate come frazione del raggio del nucleo.

I sonde rosse erano significativamente più vicine tra loro rispetto alle sonde verdi in questi dati. È risultata inoltre fattibile la microscopia confocale, che richiede segnali più intensi. Gli stack di immagini sono stati utilizzati per la modellizzazione tridimensionale dei segnali nei pesci all'interno dei loro territori cromosomici.

Questi due sonde in rosso e bianco si trovano vicino a ciascuna estremità del cromosoma sette del topo; l'intera colorazione cromosomica è mostrata in verde. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire l'ibridazione fluorescente in situ del DNA (FISH) al fine di studiare il posizionamento spaziale di specifici loci genomici in singole cellule. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che ogni trattamento potrebbe influenzare l'architettura nucleare ed è fondamentale includere opportuni controlli seguendo correttamente la procedura.

Altri metodi, come l'immuno FISH, possono essere eseguiti per rispondere ad ulteriori domande riguardo le relazioni spaziali tra geni e proteine.