Robusto FISH 3D DNA con sonde marcate direttamente

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di studiare l'organizzazione spaziale di specifici loci genomici in singole cellule in modo robusto. Ciò si ottiene generando prima sonde marcate in fluorescenza per legare ed evidenziare la regione genomica di interesse. I passaggi successivi consistono nell'aderire, fissare e permeare le celle di interesse su un vetrino per consentire l'accesso alla sonda.

Quindi una denaturazione termica simultanea della sonda e del DNA cellulare è seguita da fasi di lavaggio dell'ibridazione della sonda durante la notte per rimuovere la sonda non specificamente legata e contrastare con dpi. Per visualizzare il nucleo cellulare, i risultati ottenuti con la microscopia a fluorescenza riveleranno infine la posizione nucleare occupata da specifiche regioni genomiche. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'organizzazione nucleare, come la determinazione delle interazioni funzionali tra i geni.

Il vantaggio principale di questo particolare protocollo DNA FISH è che è veloce, robusto e versatile. Sebbene dimostriamo questo metodo utilizzando le cellule E Es, può essere applicato anche a numerosi altri tipi di cellule, sonde marcate direttamente realizzate da dorsi da 100 a 250. Le kilobasi producono costantemente segnali luminosi se sono necessarie sonde più piccole.

Utilizzare smid da 40 a 50 kilobasi, o anche plasmidi contenenti da cinque a 10 inserti di kilobasi. Identificare i cloni posteriori o smid corrispondenti a geni specifici utilizzando l'ensemble o i browser del genoma UCSC. Per preparare il DNA posteriore di alta qualità utilizzare precipitazioni ripetute o un kit disponibile in commercio, la pulizia della preparazione è proporzionale al volume della sonda richiesto.

Eseguire l'etichettatura in due passaggi. Innanzitutto, utilizzare la traduzione NIC per introdurre l'allele amminico, DUTP. In secondo luogo, utilizzare l'accoppiamento chimico per collegare un colorante reattivo medio AM.

Vale la pena investire tempo nella realizzazione di sonde luminose in quanto sono fondamentali per i segnali forti dei pesci. Questa procedura può essere eseguita in parallelo al trattamento delle cellule e non deve essere eseguita all'inizio della giornata. Per prima cosa ho mescolato da 10 a 20 nanogrammi di sonda direttamente marcata con sei microlitri di CO 1D NA per sei microgrammi.

Quindi aggiungere un microlitro di DNA a filamento singolo dai testicoli di salmone per 9,7 microgrammi. Regolare il volume della miscela a 100 microlitri con acqua. Successivamente, aggiungere 10 microlitri di acetato di sodio a tre molari e 275 microlitri di etanolo e mescolare a vortici.

Lasciare precipitare la miscela per almeno un'ora a meno 20 gradi Celsius. Quindi, centrifugare le precipitazioni in una micro fuge alla massima velocità per 30 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi lavare il pellet con etanolo al 70% e farlo girare di nuovo per cinque minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi asciugare il pellet all'aria. Poi risu. Sospenderlo in cinque microlitri di forma deionizzata.

Ammide a 37 gradi Celsius mentre si agita a 1000 giri/min si lamina per proteggerlo dalla luce. Dopo 30 minuti, aggiungere cinque microlitri di miscela di destrina solfato e continuare l'incubazione agitando. Per altri 10 minuti, la propensione delle cellule ad aderire a Slide varia notevolmente a seconda del tipo di cellula.

Per ogni tipo di cella, determinare empiricamente il tempo di decantazione ottimale e la densità cellulare. Per ottenere risultati coerenti, le cellule devono essere in una sospensione di una singola cellula per far aderire le cellule ES di topo su un vetrino. Inizia girando intorno all'area del vetrino in cui verranno individuate le celle.

Utilizzando una penna idrofoba, ho preparato una sospensione da 20 a 50.000 cellule per 80-100 microlitri in normale terreno di coltura, aggiungi la sospensione cellulare nel cerchio e lascia che le cellule si attacchino per circa tre ore in un incubatore umidificato. Dopo l'attacco del vetrino, fissare le celle immergendo delicatamente il vetrino in PFA al 4% per 10 minuti. Il vetrino deve essere piatto in un vassoio come una scatola per le punte.

Utilizzo di reagenti a temperatura ambiente in barattoli coplan. Per prima cosa spegnere le cellule con tris cloruro per 10 minuti. In secondo luogo, permeasare le cellule utilizzando una miscela di sapina e triton X 100 per 10 minuti.

Ora lava le celle due volte in PBS per cinque minuti per lavaggio. Dopo i lavaggi, incubare le cellule in glicerolo al 20% per almeno 20 minuti. A questo punto, i vetrini possono essere conservati in glicerolo al 50% a meno 20 gradi Celsius per diverse settimane.

La conservazione per un giorno o più dovrebbe aumentare la potenza del segnale. Assicurati di equilibrare le cellule a temperatura ambiente con il 20% di glicerolo in PBS prima di procedere. Ora, congelare e scongelare il vetrino tre volte utilizzando azoto liquido.

Una scivolata alla volta quando il crepitio si ferma. Dopo alcuni secondi, rimuovere il vetrino su un tovagliolo di carta per scongelare attendere che il glicerolo congelato opaco scompaia prima di congelare nuovamente il vetrino, è possibile eseguire comodamente fino a 15 vetrini a rotazione per tre cicli di congelamento e scongelamento. Ora lava i vetrini due volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.

Quindi incubare i vetrini in acido cloridrico 0,1 molare per 30 minuti. Seguire il trattamento con acido cloridrico con un altro lavaggio di cinque minuti in PBS. Ora permeare nuovamente le cellule con una linfa più forte e la miscela Triton X 100 per 30 minuti per lavare via i tensioattivi dai vetrini, utilizzare due lavaggi PBS da cinque minuti.

I vetrini sono ora pronti per equilibrarsi in ammide al 50% in XSSC. Questo dovrebbe durare almeno 10 minuti durante l'equilibratura, recuperare la sonda pipettata su e giù alcune volte e quindi trasferire 10 microlitri per punto cellulare su un vetrino coprioggetti della dimensione appropriata. Rimuovere un vetrino dalla forma ammide e asciugare il liquido in eccesso intorno alle cellule con un tovagliolo di carta, ma non lasciare che la macchia cellulare si asciughi.

Ora capovolgi il coperchio. Infilarsi sul vetrino sopra le celle. Sigillare il vetrino coprioggetto al vetrino con del cemento di gomma.

Lasciare asciugare completamente il cemento e mantenere lo scivolo al riparo dalla luce. Quindi, riscalda i vetrini a 78 gradi Celsius per due minuti esatti su una piastra calda. Questo è fondamentale per funzionare correttamente.

Una copertura deve proteggere le celle dalla luce durante questa fase Per preservare il più possibile la morfologia nucleare. È fondamentale non lasciare che le celle si secchino e assicurarsi che il calore abbia la giusta temperatura. Successivamente, posizionare i vetrini in una scatola a tenuta di luce con carta assorbente umida per fornire umidità e incubare per una notte a 37 gradi Celsius.

Iniziare questa procedura staccando il cemento di gomma intorno ai vetrini coprioggetti. Quindi posizionare ogni vetrino in X eccesso SC fino a quando il coperchio non si allenta e scivola via. Successivamente, lavare i vetrini in ammide al 50% in due x eccesso SC per 15 minuti a 45 gradi Celsius.

Tieni un coperchio sul bagnomaria per proteggerli dalla luce. Quindi lavare i vetrini in 0,2 XSSC per 15 minuti a 63 gradi Celsius. Poi due XSSC per cinque minuti a 45 gradi Celsius, e infine all'eccesso di SE a temperatura ambiente per cinque minuti.

I passaggi rimanenti sono tutti a temperatura ambiente, iniziando con un lavaggio di cinque minuti e PBS ora macchia i vetrini con dappy per due minuti e poi trattiene i vetrini con PBS per cinque minuti. Per montare il vetrino coprioggetti, applicare 10 microlitri di terreno di montaggio per punto della cella sul vetrino coprioggetti della misura corretta. Quindi asciugare il PBS in eccesso intorno alla macchia cellulare senza lasciare che le cellule si secchino.

Capovolgere il coperchio, infilarlo su un vetrino e sigillarlo con smalto per unghie utilizzando il protocollo di preparazione della sonda per pesci. Dopo la traduzione del NIC, dovrebbe essere visibile uno striscio di DNA con la maggior parte dei frammenti che vanno da 150 a 700 coppie di basi. Dopo l'accoppiamento chimico, l'incorporazione del colorante fluorescente può essere misurata mediante analisi spettroscopica del passaggio della sonda.

Queste fasi di controllo della qualità per giudicare la qualità della sonda sono fondamentali utilizzando una sonda di questo tipo. L'imaging automatizzato con un microscopio a epifluorescenza era fattibile. Ciò richiede segnali di pesce nitidi, facilmente identificabili e con poco sfondo.

Questa è un'immagine grezza del campo visivo. Le immagini seguenti rappresentano nuclei che sono stati identificati e analizzati automaticamente. Varie distanze inter alleliche e inter locus sono mostrate in alto a destra e su entrambi i lati sotto ogni nucleo.

In questo ingrandimento, le macchie bianche rappresentano i nuclei identificati per campo visivo. Questi istogrammi mostrano le distanze interalleliche massime tra i segnali verdi sopra e i segnali rossi sotto. Tutti i dati provengono da cellule germinali P 20 con sonde localizzate su diversi cromosomi che coprono i geni HBB e HBA e un cluster istonico.

Questi sono esempi di nuclei epatici fetali colorati con sonde posteriori che coprono i geni mic e KC e Q1. Da queste immagini, è possibile ottenere le coordinate nucleari dei segnali dei pesci e calcolare le relazioni spaziali delle regioni genomiche. Le distanze interalleliche sono tracciate come una frazione del raggio del nucleo.

Le sonde rosse erano significativamente più vicine tra loro rispetto alle sonde verdi in questi dati. Era possibile anche la microscopia confocale, che richiede segnali più intensi. Le pile di immagini sono state utilizzate per la modellazione 3D dei segnali dei pesci all'interno dei loro territori cromosomici.

Queste due sonde in rosso e bianco sono vicine a entrambe le estremità del cromosoma sette del topo, la vernice dell'intero cromosoma è mostrata in verde. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire il DNA fish al fine di studiare il posizionamento spaziale di specifici loci genomici in singole cellule. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che tutti i trattamenti possono influenzare l'architettura nucleare ed è importante includere l'appropriato Seguire questa procedura.

Altri metodi, come l'immuno fish, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come le relazioni spaziali tra geni e proteine.