La manipolazione genetica in Δku80 Ceppi per analisi genomica funzionale di Toxoplasma gondii

L'obiettivo generale di questa procedura è una sostituzione genica efficiente e affidabile utilizzando ceppi 80 delta di tipo uno e di tipo due di ndii toxoplasmatici. Ciò si ottiene costruendo prima una molecola di DNA bersaglio che fonde il marcatore selezionabile HX GPRT nell'orientamento in avanti tra i distinti cinque geni principali e i tre geni principali che prendono di mira i fianchi del DNA. Il secondo passo della procedura consiste nel trasfettare la molecola di DNA bersaglio in un ceppo DYI di toxoplasma di tipo uno o di tipo due.

Il terzo passo consiste nel selezionare pazientemente per il doppio crossover eventi di ricombinazione omologa e isolare i singoli cloni. Il passo finale consiste nel convalidare la presenza dell'evento di targeting genico nei cloni mutanti isolati. In definitiva, i risultati di questa procedura possono mostrare la funzione dei geni del parassita attraverso l'analisi di knockout genici mirati, sostituzioni geniche e geni tag attraverso una varietà di applicazioni a valle.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che utilizzano ceppi wild type di questo parassita è che i background di parassiti 80 delta di tipo uno e di tipo due consentono ora una selezione estremamente affidabile di eventi di ricombinazione omologa a doppio crossover mirati per produrre ceppi geneticamente definiti precisi. Questa tecnica accelererà notevolmente la scoperta di nuovi bersagli per la terapia farmacologica con plasmi antitossinici e lo sviluppo di ceppi vaccinali attenuati sicuri ed efficaci, soprattutto se abbinata alle risorse genomiche ben concepite situate online@toxodb.org. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà con l'ingegnerizzazione di molecole di DNA mirate o con le manipolazioni genetiche con il Toxoplasma Gandhi.

Tuttavia, la pratica dei pazienti e la progettazione di molecole mirate affidabili garantiranno il successo. Iniziare il protocollo con la PCR amplificando i cinque fianchi di targeting genomico principale e i tre principali per il gene di interesse dal DNA genomico. Quindi la PCR amplifica il marcatore selezionabile HX GPRT con i suoi cinque fianchi principali e tre principali DHFR dalla mini cassetta genica HX GPRT CD NA.

Utilizzare la ricombinazione del lievito o un metodo simile per fondere le molecole di NA 3D nel loro corretto orientamento da cinque primi a tre primi con il plasmide PRS quattro 16, generando così il plasmide p delta GOI che mirerà alla delezione del gene di interesse. Successivamente, preparare un campione da 100 microlitri contenente da 15 a 30 microgrammi di plasmide mirato linearizzato per la trasfezione in T gia da 68 a 72 ore dopo l'inoculazione di un pallone da 25 centimetri di cellule HFF confluenti. Verificare la presenza di parassiti appena mentiti confermando visivamente che dal 90 al 95% delle cellule HFF sono state mentite I parassiti vitali sono essenziali per il targeting genico.

Agitare i parassiti vitali fino a ridurli in soluzione agitando energicamente il pallone chiuso senza spruzzare liquido all'interno del coperchio o sul collo del pallone. Raccogli i parassiti dal pallone e preparali per la trasfezione come descritto nel protocollo di testo. Elettroporazione del plasmide bersaglio nel ceppo di toxoplasma delta CO 80.

Trasferire la miscela elettroporata in un pallone da 150 centimetri contenente cellule HFF confluenti e 30 millilitri di infezione. Medio. Incubare la coltura infetta durante la notte a 37 gradi Celsius circa 20 ore dopo la trasfezione. Sostituire il fluido con il mezzo di selezione MPA plus X.

Ora lascia che i parassiti invaghino a 37 gradi Celsius per circa otto giorni. Indisturbato. Una volta che le placche sono visibili, agitare il pallone per rimuovere i parassiti extracellulari dal monostrato generando una soluzione antiparassitaria. Trasferire circa mezzo millilitro della soluzione del parassita in un nuovo pallone da 25 centimetri di cellule HFF confluenti contenenti cinque millilitri di MPA più il mezzo di selezione X.

Designare questa cultura come PA uno A circa tre giorni dopo. Ripetere il trasferimento di mezzo millilitro della soluzione di parassita dal pallone originale a un altro pallone di cellule HFF con lo stesso mezzo di selezione. Designare queste impostazioni cultura come PA una B nei prossimi cinque giorni.

Il monitor supera un A e un B per pfu. Selezionare il passaggio di una A o di una B per la sottoclonazione in base a un numero adeguato di più di 25 zone di infezione. Ogni volta che i parassiti espellono le cellule HFF, passare la coltura in un nuovo pallone da 25 centimetri di cellule HFF confluenti con terreno di selezione tre settimane dopo la trasfezione, subclonare i parassiti appena allacciati diluendo i parassiti alla concentrazione appropriata in MPA più terreno X e distribuendo uniformemente la soluzione del parassita in un vassoio da 96 pozzetti contenente cellule HFF confluenti.

Preparare un vassoio a una concentrazione di un parassita per pozzetto e preparare un secondo vassoio a una concentrazione di due parassiti per pozzetto. Incubare entrambi i vassoi a 37 gradi Celsius dopo la data di trasfezione originale. Non subclonare i parassiti prima del giorno 20 per i parassiti di tipo uno o del giorno 25 per i parassiti di tipo due.

Continuare a passare il pallone da 25 centimetri con un programma settimanale come descritto nel testo online fino a quando il ceppo knockout non è stato convalidato. Dopo circa una settimana, i vassoi da 96 pozzetti sono sotto l'ingrandimento da 40 a 60x. Selezione solo dei pozzetti che contengono un singolo PFU identificato come una singola zona di infezione utilizzando una pipetta impostata a 50 microlitri.

Mescolare il contenuto di questi pozzetti dirigendo il flusso del fluido sul PFU per disperdere i parassiti intorno al pozzo. Quattro o cinque giorni dopo aver mescolato i pozzetti selezionati, scegliere una dozzina di cloni con cellule liete. Trasferire 12 cloni dal vassoio da 96 pozzetti a 12 pozzetti di un vassoio da 24 pozzetti A tale scopo, grattare con la punta di una pipetta sul fondo del pozzetto e prelevare sei microlitri.

Trasferire la soluzione in un pozzetto di un vassoio da 24 pozzetti con cellule HFF confluenti in un millilitro di MPA più la selezione X. Incubare il vassoio da 24 pozzetti a 37 gradi Celsius e monitorare la lisi delle cellule HFF. Passaggio dei parassiti da un pozzetto lisato nel vassoio a 24 pozzetti con un programma settimanale.

Usa la tecnica del graffio e del disegno per trasferire due microlitri della soluzione del parassita su una nuova piastra con selezione MPA e X. Dopo il passaggio, raccogli i parassiti dai 24 originali. Pozzetti, vassoio e trasferimento in piccole provette per la raccolta del DNA.

Per finire, utilizzare la PCR per testare la delezione del gene di interesse per verificare l'integrazione dei cinque fianchi bersaglio principali e dei tre fianchi bersaglio primario. E per verificare la presenza del marcatore selezionabile HX GPRT. Questo protocollo è per la rimozione del marcatore HX GPRT dal ceppo delta Q 80 manipolato ed è descritto nel testo online.

P delta GOYC mira alla rimozione di HX GPRT dal parassita mediante selezione negativa utilizzando sei mezzi TX. Quindi la PCR viene utilizzata per confermare la perdita di HX GPRT come mostrato da una banda di coppia di 1,2 kilobasi in cui HX GPRT non è stato rimosso dal locus. C'è una banda di coppie di 3,4 kilobasi.

La parte finale di questo protocollo, la marcatura C terminale delle proteine, è anche descritta in dettaglio nel testo online dopo aver seguito il protocollo delineato per effettuare una delezione genica mirata, la PCR è stata utilizzata per convalidare la delezione di un knockout di tipo uno R 18. Un lato basso che è generalmente difficile da prendere di mira. La prima PCR mostra l'assenza del prodotto PCR del gene R 18.

La PCR 2 mostra la presenza dei tre fianchi di targeting genomico R 18 primari, la PCR tre e la PCR quattro mostrano la presenza del marcatore selezionabile correttamente integrato tra i cinque e i tre fianchi di targeting genomico primario, che definisce la delezione R 18. Al fine di riutilizzare il marcatore selezionabile per effettuare successive delezioni in un ceppo, l'HX GPRT originale deve prima essere rimosso dal locus. Dopo aver seguito il protocollo delineato.

HX GPRT è stato rimosso dal GRA deleto due locus nel ceppo delta due, 80 delta GRA, due HX. G-P-R-T-P-C-R è stato utilizzato per confermare la perdita di HX GPRT mostrata da una KILOBASE di 1,2 KILOBASE per banda. Quando H-X-G-P-R-T non è stato rimosso, c'era una base di 3,4 kilobasi per banda dopo la fase iniziale di targeting genico. Ulteriori metodi di targeting genico possono essere applicati per costruire più knockout nello stesso ceppo di tipo uno o di tipo due, o per etichettare o completare un ceppo mutante per rispondere a ulteriori domande come, dove si localizza questa proteina nella cellula?

O qual è il dominio chiave o l'attività di questa proteina o percorso che spiega la sua funzione biologica? Questa tecnica apre la strada ai ricercatori del settore per accelerare l'esplorazione della funzione del gene del parassita nel complesso modello AP e nel toxoplasma del parassita. Occhio di Gandhi.

Non dimenticare che lavorare con il toxoplasma può essere pericoloso e che le precauzioni come seguire tutte le linee guida BSL due devono essere mantenute durante tutta la procedura.