La manipolazione genetica in

L'obiettivo generale di questa procedura è la sostituzione genica efficiente e affidabile mediante l'utilizzo di ceppi di tipo uno e tipo due delta due 80 di Toxoplasmic ndii. Questo risultato si ottiene innanzitutto costruendo una molecola di DNA di targeting che fonde il marcatore selezionabile HX GPRT in orientamento diretto tra specifiche regioni terminali cinque prime e tre prime di DNA per il targeting genico. Il secondo passaggio della procedura consiste nel trasfettare la molecola di DNA di targeting in un ceppo di Toxoplasma DYI di tipo uno o di tipo due.

Il terzo passaggio consiste nel selezionare con pazienza gli eventi di ricombinazione omologa a doppio crossover e isolare singole linee cellulari clonali. L'ultimo passaggio prevede la verifica della presenza dell'evento di targeting genico nei cloni mutanti isolati. In definitiva, i risultati di questa procedura possono rivelare la funzione dei geni del parassita mediante l'analisi di knockout genici mirati, sostituzioni geniche ed etichettatura genica, attraverso una varietà di applicazioni successive.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti che utilizzano ceppi di tipo selvatico di questo parassita è che gli sfondi parassitari di tipo uno e di tipo due delta due 80 consentono ora una selezione estremamente affidabile di eventi di ricombinazione omologa a doppio crossover mirati per produrre ceppi geneticamente definiti con precisione. Questa tecnica accelererà notevolmente l'individuazione di nuovi bersagli per la terapia farmacologica con plasmi antitossina e lo sviluppo di ceppi vaccinali attenuati sicuri ed efficaci, specialmente quando abbinata alle ben strutturate risorse genomiche disponibili online@toxodb.org. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potrebbero incontrare difficoltà nel progettare molecole di DNA mirate o nel compiere manipolazioni genetiche con Toxoplasma Gandhi.

Tuttavia, la pratica clinica e la progettazione di molecole di targeting affidabili garantiranno il successo. Iniziare il protocollo amplificando mediante PCR le regioni genomiche di targeting a monte (cinque prime) e a valle (tre prime) del gene di interesse, a partire dal DNA genomico. Successivamente, amplificare mediante PCR il marcatore selezionabile HX GPRT con le sue regioni a monte e a valle DHFR a cinque prime e tre prime, a partire dal mini-cassetta genica HX GPRT CD NA.

Utilizzare la ricombinazione del lievito o un metodo simile per fondere le molecole di NA 3D nella loro corretta orientazione da cinque prime a tre prime con il plasmide PRS quattro 16, generando così il plasmide p delta GOI che indirizzerà l'eliminazione nel gene di interesse. Successivamente, preparare un campione di 100 microlitri contenente da 15 a 30 microgrammi di plasmide bersaglio linearizzato per la trasfezione in T gia 68-72 ore dopo l'inoculo di un fiasco da 25 centimetri di cellule HFF confluenti. Verificare la presenza di parassiti appena lisiati confermando visivamente che il 90-95% delle cellule HFF è stato lisiato; i parassiti vitali sono essenziali per il targeting genico.

Agitare i parassiti vitali in soluzione agitando vigorosamente il flacone chiuso senza far schizzare il liquido sulla parte interna del coperchio o sul collo del flacone. Raccogliere i parassiti dal flacone e prepararli per la trasfezione come descritto nel protocollo testuale. Eseguire l'elettroporazione del plasmide di targeting nella ceppia delta CO 80 di toxoplasma.

Trasferire la miscela elettroporata in una fiasca da 150 centimetri contenente cellule HFF confluenti e 30 millilitri di mezzo di infezione. Incubare la coltura infetta durante la notte a 37 gradi Celsius, circa 20 ore dopo la trasfezione. Sostituire il mezzo con mezzo di selezione MPA più X.

Ora lasciare incubare i parassiti a 37 gradi Celsius per circa otto giorni, senza disturbarli. Una volta visibili le placche, agitare il flacone per staccare i parassiti extracellulari dal monostrato, ottenendo una soluzione di parassiti. Trasferire circa mezzo millilitro della soluzione di parassiti in un nuovo flacone da 25 centimetri quadrati contenente cellule HFF confluenti e cinque millilitri di mezzo di selezione MPA più X.

Designare questa coltura come PAs one A circa tre giorni dopo. Ripetere il trasferimento di mezzo millilitro della soluzione di parassiti dal flacone originale a un altro flacone di cellule HFF con lo stesso mezzo di selezione. Designare questa coltura come PAs one B nei successivi cinque giorni.

Monitorare i passaggi A e B per pfu. Selezionare un passaggio, A o B, per il subclonaggio in base a un numero adeguato di zone di infezione superiore a 25. Ogni volta che i parassiti lisano le cellule HFF, trasferire la coltura in un nuovo fiasco da 25 centimetri quadrati contenente cellule HFF confluenti con mezzo di selezione; tre settimane dopo la trasfezione, subclonare i parassiti appena lacerati diluendo i parassiti alla concentrazione appropriata nel mezzo MPA più X ed distribuendo uniformemente la soluzione di parassiti in una piastra a 96 pozzetti contenente cellule HFF confluenti.

Preparare una piastra a una concentrazione di un parassita per pozzetto e preparare una seconda piastra a una concentrazione di due parassiti per pozzetto. Incubare entrambe le piastre a 37 gradi Celsius a partire dalla data originale della trasfezione. Non eseguire il subclonaggio dei parassiti prima del giorno 20 per i parassiti di tipo uno o del giorno 25 per i parassiti di tipo due.

Continuare a suddividere il matraccio da 25 centimetri su base settimanale come descritto nel testo online, fino a quando la linea priva del gene non è stata convalidata. Dopo circa una settimana, esaminare le piastre a 96 pozzetti con un ingrandimento compreso tra 40 e 60 volte. Selezionare soltanto i pozzetti che contengono una singola PFU, identificata come una singola zona di infezione, utilizzando una pipetta regolata a 50 microlitri.

Mescolare il contenuto di queste pozzette indirizzando il flusso del liquido sopra le PFU per disperdere i parassiti all'interno della pozzetta. Da quattro a cinque giorni dopo il mescolamento delle pozzette selezionate, scegliere una dozzina di cloni con cellule lisate. Trasferire 12 cloni dalla piastra a 96 pozzette a 12 pozzette di una piastra a 24 pozzette. Eseguire questa operazione grattando con la punta della pipetta sul fondo della pozzetta e aspirando sei microlitri.

Trasferire la soluzione in una pozzetta di una piastra a 24 pozzette contenente cellule HFF confluenti in un millilitro di MPA più selezione X. Incubare la piastra a 24 pozzette a 37 gradi Celsius e monitorare la lisi delle cellule HFF. Passaggiare i parassiti da una pozzetta lisata nella piastra a 24 pozzette secondo un programma settimanale.

Utilizzare la tecnica di graffiatura e prelievo per trasferire due microlitri della soluzione di parassiti in una nuova piastra con MPA e selezione X. Dopo il passaggio, raccogliere i parassiti dalla piastra originale a 24 pozzetti e trasferirli in provette piccole per la raccolta del DNA.

Per concludere, utilizzare la PCR per verificare l'eliminazione del gene di interesse al fine di controllare l'integrazione dei tratti bersaglio a monte (cinque prime) e a valle (tre prime). E per verificare la presenza del marcatore selezionabile HX GPRT. Questo protocollo riguarda la rimozione del marcatore HX GPRT dalla ceppa delta Q 80 manipolata ed è descritto nel testo online.

P delta GOYC mira alla rimozione di HX GPRT dal parassita mediante selezione negativa utilizzando sei mezzi TX. Successivamente, la PCR viene utilizzata per confermare la perdita di HX GPRT, come dimostrato da una banda di 1,2 paia di chilobasi dove HX GPRT non è stata rimossa dal locus. È presente una banda di 3,4 paia di chilobasi.

L'ultima parte di questo protocollo, la marcatura del terminale C delle proteine, è descritta in dettaglio nel testo online; dopo aver seguito il protocollo descritto per realizzare una delezione genica mirata, è stata utilizzata la PCR per convalidare l'eliminazione di un knockout del tipo uno R 18, un bersaglio generalmente difficile da colpire. La PCR uno mostra l'assenza del prodotto amplificato del gene R 18.

La PCR due mostra la presenza del tratto genomico bersaglio al sito tre primi R 18; le PCR tre e quattro mostrano la presenza del marcatore selezionabile correttamente integrato tra le regioni genomiche bersaglio a monte (cinque primi) e a valle (tre primi), definendo così la delezione R 18. Per riutilizzare il marcatore selezionabile al fine di generare delezioni successive in un ceppo, l'originale HX GPRT deve prima essere rimosso dal locus. Dopo aver seguito il protocollo descritto.

Il gene HX GPRT è stato rimosso dal locus GRA due eliminato nella ceppa delta due 80 delta GRA due HX.G-P-R-T-P-C-R è stato utilizzato per confermare la perdita di HX GPRT, evidenziata da una banda di 1,2 KILOBASI. Quando H-X-G-P-R-T non è stato rimosso, si osservava una banda di 3,4 KILOBASI dopo il primo passaggio di targeting genico. Possono essere applicati ulteriori metodi di targeting genico per costruire delezioni multiple nella stessa ceppa di tipo uno o tipo due, oppure per marcare o complementare una ceppa mutante al fine di rispondere ad altre domande, come ad esempio: dove si localizza questa proteina nella cellula?

O qual è il dominio chiave o l'attività di questa proteina o via metabolica che ne spiega la funzione biologica? Questa tecnica apre la strada ai ricercatori del settore per intensificare l'esplorazione della funzione genica nei parassiti nel complesso AP modello e nel parassita Toxoplasma. Gandhi eye.

Non dimenticare che lavorare con toxoplasma può essere pericoloso e che durante tutta la procedura devono essere mantenute precauzioni come il rispetto di tutte le linee guida BSL due.