Name: Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-08T22:00:00.000+00:00
Duration: 5 min 15 s
Description: Impara l'intubazione intratracheale non invasiva per studiare la fisiopatologia polmonare nel topo. Questo metodo consente la somministrazione diretta di trattamenti sperimentali con controllo preciso e visualizzazione della distribuzione.

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Questo lavoro è stato supportato dal programma di ricerca intramurale del National Cancer Institute, Center for Cancer Research.

Il seguente protocollo descrive un metodo non invasivo, semplice e veloce per fornire materiali di interesse per i polmoni del mouse. Tale procedura è stata approvata dalla cura degli animali e del Comitato Usa National Cancer Institute. 1. Anestesia <ol><li> Primo, anestetizzare il mouse usando una miscela di chetamina e xilazina (100 mg / kg di peso corporeo e 10 mg / kg di peso corporeo, rispettivamente). Questo è il ACUC raccomandato anestesia e dose. Con questo importo, i topi sono incosciente, almeno per ~ 20 min. </li><li> Applicare vet unguento agli occhi del mouse per evitare l&#39;essiccazione degli occhi durante l&#39;anestesia. </li><li> Dopo alcuni minuti, pizzicare un piede del mouse per controllare la coscienza. Una volta confermata inconscio, posizionare il mouse su un supporto intubazione angolato a ~ 60 ° e tenerlo in posizione agganciando i suoi incisivi superiori su una piccola banda di gomma situato nella parte superiore dello stand. </li></ol> 2. Intubazione endotracheale </p&gt; <ol><li> Rientrare delicatamente la lingua del mouse per un lato con un Q-tip. </li><li> Quando si utilizza il Biolite intubazione Illuminazione, inserire con attenzione il sistema intubazione fino alla laringe viene visualizzato con l&#39;aiuto della guida di luce a fibre ottiche. </li><li> Una volta che l&#39;epiglottide e le cartilagini aritenoidee vengono visualizzati, inserire la fibra sopra l&#39;epiglottide e tra le cartilagini aritenoidee, e avanzare finché è stata inserita la corretta lunghezza di catetere. </li></ol> Nota: Per avere la corretta lunghezza di catetere da inserire, inizialmente misurare la lunghezza tra la bocca e il punto di biforcazione bronchiale utilizzando un mouse pratica di dimensioni simili in anticipo (Figura 1). La lunghezza dipende in gran parte dalla dimensione del mouse. Inserimento del catetere deve smettere di sopra del punto di biforcazione (circa 1,5 cm per mouse con ~ 25 g di peso corporeo). Questo assicura che il materiale intubato andrà a tutti lobi. Almeno il 50 pratica mice può essere richiesto per una persona che esegue la intubazione per diventare esperti nella tecnica (avanzato significa che il tasso di successo di intubazione è superiore al 95%). <ol start="4"><li> Una volta inserito il catetere, rimuovere rapidamente la guida di luce a fibre ottiche dal catetere per permettere all&#39;animale di respirare normalmente. Quando il sistema intubazione illuminazione non viene utilizzata, inserire direttamente un catetere come descritto. </li><li> Aggiungere una soluzione contenente materiali di interesse ad un catetere. Assicurarsi che la soluzione viene aspirata nei polmoni subito dopo l&#39;aggiunta. Cinquanta microlitri per ~ 25 g di peso corporeo del mouse viene abitualmente utilizzati. </li></ol> 3. Il recupero degli animali <ol><li> Non appena la soluzione viene aspirata nei polmoni, prendere giù il mouse dal cavalletto, e rimetterlo nella gabbia originale. </li><li> Osservare il mouse fino a quando non inizia a muoversi. </li><li> Una volta confermato che il mouse è in buone condizioni, riportare la gabbia di un rack. </li></ol>

<ol><li>Das, S., Macdonald, K., Chang, H. Y., Mitzner, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+method+of+mouse+lung+intubation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">A simple method of mouse lung intubation.</a> J. Vis. Exp. (73), e50318(2013).</li>
<li>Miller, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+murine+intranasal+dosing+efficiency+using+luminescent+Francisella+tularensis%3A+effect+of+instillation+volume+and+form+of+anesthesia%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Visualization of murine intranasal dosing efficiency using luminescent Francisella tularensis: effect of instillation volume and form of anesthesia.</a> PLoS One. 7, e31359(2012).</li>
<li>Rayamajhi, M., Redente, E. F., Condon, T. V., Gonzalez-Juarrero, M., Riches, D. W., Lenz, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-surgical+intratracheal+instillation+of+mice+with+analysis+of+lungs+and+lung+draining+lymph+nodes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Non-surgical intratracheal instillation of mice with analysis of lungs and lung draining lymph nodes by flow cytometry.</a> J. Vis. Exp. (51), e2702(2011).</li>
<li>Riesenfeld, E. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhaled+salmeterol+and%2For+fluticasone+alters+structure%2Ffunction+in+a+murine+model+of+allergic+airways+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Respir.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhaled salmeterol and/or fluticasone alters structure/function in a murine model of allergic airways disease.</a> Respir. Res. 11, 22(2010).</li>
<li>Rivera, B., Miller, S., Brown, E., Price, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+method+for+endotracheal+intubation+of+mice+and+rats+used+in+imaging+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Contemp.+Top.+Lab+Anim.+Sci%22%5BJournal%5D)">A novel method for endotracheal intubation of mice and rats used in imaging studies.</a> Contemp. Top. Lab Anim. Sci. 44, 52-55 (2005).</li>
<li>Bonniaud, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progressive+transforming+growth+factor+beta1-induced+lung+fibrosis+is+blocked+by+an+orally+active+ALK5+kinase+inhibitor%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Res.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Progressive transforming growth factor beta1-induced lung fibrosis is blocked by an orally active ALK5 kinase inhibitor.</a> Am. J. Res. Crit. Care Med. 171, 889-898 (2005).</li>
<li>Bivas-Benita, M., Zwier, R., Junginger, H. E., Borchard, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-invasive+pulmonary+aerosol+delivery+in+mice+by+the+endotracheal+route%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Pharm.+Biopharm%22%5BJournal%5D)">Non-invasive pulmonary aerosol delivery in mice by the endotracheal route.</a> Eur. J. Pharm. Biopharm. 61, 214-218 (2005).</li>
<li>Haegens, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myeloperoxidase+deficiency+attenuates+lipopolysaccharide-induced+acute+lung+inflammation+and+subsequent+cytokine+and+chemokine+production%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Myeloperoxidase deficiency attenuates lipopolysaccharide-induced acute lung inflammation and subsequent cytokine and chemokine production.</a> J. Immunol. 182, 7990-7996 (2009).</li>
<li>Jackson, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exposure+of+pregnant+mice+to+carbon+black+by+intratracheal+instillation%3A+toxicogenomic+effects+in+dams+and+offspring%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat.+Res%22%5BJournal%5D)">Exposure of pregnant mice to carbon black by intratracheal instillation: toxicogenomic effects in dams and offspring.</a> Mutat. Res. 745, 73-83 (2012).</li>
<li>Bodewes, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pathogenesis+of+Influenza+A%2FH5N1+virus+infection+in+ferrets+differs+between+intranasal+and+intratracheal+routes+of+inoculation%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Pathogenesis of Influenza A/H5N1 virus infection in ferrets differs between intranasal and intratracheal routes of inoculation.</a> Am. J. Pathol. 179, 30-36 (2011).</li>
<li>Winslow, M. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+lung+adenocarcinoma+progression+by+Nkx2-1%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Suppression of lung adenocarcinoma progression by Nkx2-1.</a> Nature. 473, 101-104 (2011).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Intubazione endotracheale qui descritto è un metodo semplice, ma ottima non invasivo per fornire in modo uniforme i materiali di interesse per il mouse del polmone. Questo metodo permette studio dell&#39;effetto e / o il ruolo del materiale somministrato sulla fisiologia e / o patologia polmonare. I materiali possono essere somministrati molecole endogene come le citochine, o materiali esogeni, quali sostanze chimiche xenobiotiche / farmaci, sostanze cancerogene, inquinanti, allergeni, o virus che provocano varie malatt...

Polmone è un organo in cui molte malattie devastanti sono comunemente diagnosticati. Tra questi, il cancro del polmone è la seconda più cancro diagnosticati in uomini e donne, e la causa più comune di morte per cancro. Malattia cronica polmonare ostruttiva, noto anche come enfisema e bronchite cronica, è una malattia molto grave e la terza causa di morte negli Stati Uniti. Nel 2011, è stato stimato che 25,9 milioni di americani avevano l&#39;asma, tra cui 7,1 milioni di bambini al di sotto dei 18 anni. L&#39;asma è la terza causa di ospedalizzazione tra i bambini al di sotto dei 15 anni (American Lung Association, <a href="http://www.lung.org" target="_blank">http://www.lung.org</a> ). Per studiare la fisiopatologia e / o eziologia di queste malattie devastanti e dei loro meccanismi sottostanti, l&#39;uso di modelli accurati è critica in congiunzione con somministrazione conveniente e non invasiva di vari materiali di interesse per polmone. I topi forniscono uno dei migliori modelli distudiare i meccanismi molecolari alla base della patologia e fisiologia delle malattie polmonari a causa della crescente disponibilità di eliminazione diretta e topi transgenici e una grande quantità di informazioni genetiche disponibili. Vari metodi sono stati utilizzati da un certo numero di ricercatori in contesti diversi per fornire materiali di interesse per i polmoni del mouse, tra cui inalazione, instillazione intranasale, instillazione, e l&#39;intubazione endotracheale 1-4. Quest&#39;ultima procedura non è stato utilizzato di routine perché è considerato piuttosto difficile da eseguire. Intubazione endotracheale qui descritto è un metodo non invasivo, semplice e pratica per fornire materiali di interesse ai polmoni di topo per studiare l&#39;effetto dei materiali consegnati sul pattern di espressione genica, patologia e / o la fisiologia del polmone 5. Questa tecnica garantisce la consegna di materiali esogeni per un intero polmone e non comporta alcun intervento chirurgico sopravvivenza e quindi sarà likely essere approvato da tutti i comitati per la cura degli animali e uso istituzionale.

<table><tbody><tr><td>KetaVed</td><td>Vedco</td><td></td><td>Ketamina</td></tr><tr><td>AnaSed Iniezione 20 mg</td><td>LLOYD</td><td></td><td>Xilazina</td></tr><tr><td>BioLite Stand</td><td>Braintree Scientific</td><td>RIS100</td><td>Per topi</td></tr><tr><td>Sistema di illuminazione per intubazione BioLite</td><td>Braintree Scientific</td><td>BIO MI-KIT</td><td>Per topi</td></tr><tr><td>22 G, catetere endovenoso da 1 pollice</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2225CA</td><td>Per topi <forte>sotto</forte> 30 g. Il catetere viene utilizzato solo nel caso in cui non venga utilizzato il sistema di illuminazione per intubazione.</td></tr><tr><td>Catetere endovenoso da 20 G, 1 pollice</td><td>Terumo</td><td>SR-OX2025CA</td><td>Per topi over 30 g. Il catetere viene utilizzato solo nel caso in cui non venga utilizzato il sistema di illuminazione per intubazione.</td></tr></tbody></table>

non invasivo intratracheale intubazione per studiare la patologia e fisiologia del mouse polmone

Noninvasive Intratracheal Intubation to Study the Pathology and Physiology of Mouse Lung

L&#39;uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell&#39;uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Con la crescente disponibilità di knockout e transgenici derivati, insieme ad una grande quantità di informazioni genetiche, i topi forniscono una delle migliori modelli per studiare i meccanismi molecolari alla base della patologia e fisiologia delle malattie polmonari. Inalazione, instillazione intranasale, instillazione, e l&#39;intubazione endotracheale sono le tecniche più utilizzate da un numero di investigatori per amministrare i materiali di interesse per i polmoni del mouse. Ci sono pro e contro per ogni tecnica a seconda degli obiettivi di uno studio. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato. Questa tecnica è stata applicata ad amministrare bleomicina ai polmoni topo come modello per lo studio della fibrosi polmonare. &lt;/ P&gt;

Inizialmente, soluzione verde-tinto è stato usato per intubare topi per la pratica. Il polmone è stato asportato immediatamente dopo l&#39;intubazione per esaminare come uniformemente il colore è stato distribuito nel polmone (Figura 2). Questa tecnica è stata applicata per studiare la fibrosi polmonare indotta da bleomicina utilizzando C57BL / 6 topi. Quando i topi sono stati intratracheale intubati con 1,2 U / kg di bleomicina o soluzione fisiologica come controllo e necroscopia dopo 3 settimane, i to...

L&#39;uso di un modello che simula la condizione di malattie polmonari nell&#39;uomo è fondamentale per lo studio della fisiopatologia e / o eziologia di una particolare malattia e per lo sviluppo di un intervento terapeutico. Ecco un metodo non invasivo intubazione endotracheale in grado di fornire direttamente i materiali esogeni ai polmoni del mouse è presentato.

Non invasivo intratracheale intubazione per studiare la Patologia e Fisiologia del mouse polmone

The use of a model that mimics the condition of lung diseases in humans is critical for studying the pathophysiology and/or etiology of a particular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare l'intubazione endotracheale per studiare gli effetti di trattamenti sperimentali sulla fisiologia e sulla patologia del polmone controlaterale. Questo viene ottenuto misurando innanzitutto un topo di controllo di dimensioni simili a quelle del topo sperimentale, dalla bocca fino al punto di biforcazione bronchiale del polmone. Successivamente, utilizzare il sistema di illuminazione per intubazione BioLite per localizzare la trachea.La fibra ottica viene quindi rapidamente rimossa dopo l'inserimento, lasciando il catetere in posizione. Nell'ultimo passaggio, una soluzione contenente il trattamento sperimentale viene somministrata ai polmoni attraverso il catetere. Infine, la distribuzione uniforme della molecola di interesse può essere visualizzata in tutto il polmone mediante l'utilizzo di un colorante verde abbinato.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi di intubazione è che, con la nostra tecnica, il sistema di eliminazione a fibra ottica facilita l'individuazione della trachea nonché il posizionamento del catetere, garantendo una somministrazione ottimale del materiale di interesse direttamente nel polmone. A dimostrazione della procedura sarà presente un post-dottorato del mio laboratorio. Prima di iniziare la procedura, misurare la lunghezza tra la bocca e il punto bronchiale utilizzando un topo modello di dimensioni simili per determinare la lunghezza corretta del catetere da inserire durante l'intubazione. Successivamente, applicare un unguento oftalmico veterinario su entrambi gli occhi dell'animale sperimentale anestetizzato.Dopo alcuni minuti, pizzicare un piede per confermare la sedazione, quindi posizionare l'animale su un supporto per intubazione. Posizionarsi con un angolo di circa 60 gradi. Agganciare gli incisivi superiori a una piccola fascetta di gomma situata nella parte superiore del supporto per mantenere l'animale fermo, quindi utilizzare un bastoncino di ovatta per ritrarre delicatamente la lingua del topo verso un lato.L'aspetto più difficile di questa procedura consiste nell'individuare chiaramente la trachea, che è distinta dall'asso Fergus e nella quale deve essere inserito il catetere. Per avere successo, assicurarsi che la laringe sia ben illuminata dalla fibra ottica e tenere presente la direzione in cui deve essere inserito il catetere. Inserire con attenzione il sistema di intubazione finché la laringe non sarà visualizzata con l'aiuto della guida a fibra ottica.Una volta visualizzate l'epiglottide e le cartilagini ioidee, inserire la fibra al di sopra dell'epiglottide e tra le cartilagini ioidee, avanzando il sistema fino a quando non sia stato introdotto il tratto di catetere precedentemente determinato. Una volta posizionato il catetere, rimuovere rapidamente la guida a fibra ottica per permettere all'animale di respirare normalmente, quindi somministrare la soluzione di interesse attraverso il catetere. Un'intubazione corretta determina l'immediata aspirazione della soluzione attraverso il tubo nei polmoni.Non appena la soluzione viene aspirata nei polmoni, rimuovere il topo dal supporto e riposizionarlo nella gabbia originale. Osservare il topo fino a quando non inizia a muoversi. Una volta confermato lo stato di salute dell'animale, riposizionare la gabbia nel suo rack.Negli esperimenti iniziali, una soluzione di colorante verde è stata utilizzata per esercitarsi nell'intubazione dei topi. I polmoni sono stati immediatamente resecati dopo l'intubazione per esaminare quanto uniformemente il colore fosse distribuito. Il colorante è stato osservato nella maggior parte delle parti del polmone, indicando un'intubazione riuscita.La tecnica è stata quindi applicata per studiare la fibrosi polmonare indotta da bleomicina utilizzando topi C57BL/6, a tre settimane dall'intubazione intratracheale con bleomicina o soluzione salina come controllo. I polmoni sono stati esaminati mediante analisi istologica per valutare lo sviluppo della fibrosi indotta da bleomicina. Nessuna fibrosi era visibile né a bassa né ad alta ingrandimento nei polmoni degli animali trattati con soluzione salina.Al contrario, i topi intubati con bleomicina hanno sviluppato fibrosi in tutto il polmone, come evidente sia nelle immagini a basso che ad alto ingrandimento. Il contenuto di idrossiprolina era più elevato nei polmoni dei topi trattati con bleomicina rispetto a quelli trattati con soluzione salina. Ulteriore dimostrazione che i topi trattati con bleomicina sviluppano fibrosi polmonare.L'area danneggiata è stata quindi ricoperta con una griglia a 121 punti e il numero di intersezioni o punti cadenti sulle aree fibrotiche è stato contato ed espresso come percentuale rispetto al totale di 121 punti; la percentuale delle aree danneggiate così calcolata era proporzionale alla quantità di bleomicina somministrata. Assicurarsi di avere in anticipo un'idea della profondità con cui il catetere deve essere inserito nella trachea e di verificare che la soluzione venga aspirata attraverso il catetere e raggiunga i polmoni immediatamente dopo l'aggiunta.

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