Name: Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-07T19:15:00.000+00:00
Duration: 14 min 49 s
Description: Impara a creare nanosensori pH reattivi e ponteggi self-reporting in PLGA per il monitoraggio in tempo reale delle condizioni microambientali durante la coltura cellulare tridimensionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

I finanziamenti del BBSRC è gentilmente riconosciuto (codice di autorizzazione BB H011293 / 1).

Panoramica Sezione 1 descrive la preparazione di pH nanosensori reattivo e la caratterizzazione della risposta nanosensori a pH utilizzando la spettrometria di fluorescenza e la loro dimensione al SEM. Sezione 2 descrive la preparazione di elettrofilate scaffold polimerici e caratterizzazione della loro morfologia e dimensioni utilizzando SEM. Sezione 2 descrive anche la preparazione di scaffolds self-reporting, che sono ponteggi elettrofilate con l&#39;inclusione dei nanosensori reattive pH. I risultanti ponteggi self-report sono caratterizzati da SEM per valutare se si è verificato eventuali modifiche morfologiche delle fibre elettrofilate. La fluorescenza dalle impalcature auto-segnalazione risultanti dai nanosensori incorporati è valutata mediante microscopia confocale. Sezione 3 descrive la coltura di cellule sul patibolo electrospun e il self-report patibolo. I ponteggi vengono prima sterilizzati in preparatione per la coltura cellulare a seguito della quale i ponteggi sono valutati per determinare se la sterilizzazione e la cultura di cellule influenzano la capacità di fluorescenza dei ponteggi auto-segnalazione. Il protocollo descrive inoltre la consegna di nanosensori alle cellule che vengono coltivate su scaffold elettrofilate. Lysotracker colorante viene utilizzato per garantire che nanosensori non sono state prese in compartimenti cellulari acide. 1. Preparazione e analisi di pH Responsive nanosensori sol-gel 1.1 Preparazione del pH Responsive nanosensori sol-gel Nota: Questa preparazione deve essere eseguita in una cappa aspirante. <ol><li> Preparare i fluorofori per l&#39;uso entro il nanosensori pH sciogliendo 5 - (e-6)-carbossifluoresceina, estere succinimidyl (FAM-SE) (1,5 mg) in dimetilformammide (DMF) (1 ml) in un pallone a fondo rotondo e 6-carboxytetramethylrhodamine , estere succinimidyl (TAMRA-SE) (1,5 mg) in DMF (1 ml) in un altro round pallone a fondo.Aggiungere 3-amminopropiltrietossisilano (APTES) (1,5 mL) per ogni beuta e agitare sotto atmosfera di azoto secco (21 ° C) per 24 ore al buio cioè avvolgere i campioni in stagnola. </li><li> Aggiungere entrambi i coloranti di cui sopra (250 mL) ad una miscela di etanolo (6 ml) e idrossido di ammonio (30% in peso, 4 ml) contenuta in un pallone a fondo tondo e agitare per 1 ora (21 ° C). </li><li> Aggiungere lentamente tetraetilortosilicato (TEOS) (0,5 ml) alla miscela, continuare a mescolare per altri 2 hr. La miscela si accende nuvoloso. I nanosensori possono essere raccolti mediante evaporazione rotante. Nanosensori possono essere memorizzati in una fiala di vetro a 4 ° C per un uso futuro. ATTENZIONE: ulteriore manipolazione di nanosensori nella loro forma secca deve essere eseguita in una cappa aspirante o in caso di pesatura loro l&#39;equilibrio dovrebbe essere chiuso, ad esempio in un Weighsafe. </li></ol> 1.2 nanosensori risposta a pH <ol><li> Preparare soluzioni tampone fosfato di Sorensen che vanno dal pH 5,5-8,0 per Mixing rapporti specifici di sodio fosfato monobasico (0,2 M) e sodio fosfato bibasico (0,2 M) soluzioni stock. Controllare il pH finale utilizzando un pHmetro. Apportare le modifiche minori al pH con idrossido di sodio (NaOH) (4 M) o acido cloridrico (HCl) (2 M). </li><li> Sospendere i nanosensori pH nei tamponi di pH (5 mg / ml) da un lato tenendo il recipiente contenente la soluzione di nanosensori in un vortice per 3 minuti poi immergere il vaso in un ultrasonicatore fino a quando la soluzione diventa torbida (circa 5 min). Ripetere la procedura per sospendere pienamente i nanosensori in soluzione. </li><li> Posizionare la prima soluzione in una cuvetta ottica e utilizzare lunghezze d&#39;onda di eccitazione di 488 nm per 5 - (e-6)-carbossifluoresceina (FAM) e 568 nm per 6-carboxytetramethylrhodamine (TAMRA). Raccogliere le lunghezze d&#39;onda di emissione a 500-530 nm per FAM e 558-580 nm per TAMRA con uno spettrometro a fluorescenza. </li><li> Modificare le soluzioni nella cuvetta ottico in modo che il pH può essere osservata a diversi pH e continuare collecting spettri di emissione. </li><li> Calcolare il rapporto dei valori massimi di emissione prodotta a ciascun valore di pH per produrre una curva di calibrazione. </li></ol> 1.3 SEM di nanosensori <ol><li> Porre un campione dei nanosensori su un carbonio rivestito microscopio elettronico stub e farfugliare mantello d&#39;oro per 5 min in atmosfera di argon. </li><li> Osservare da microscopia elettronica a scansione (SEM). Durante l&#39;imaging regolare la distanza di lavoro, tensione e ingrandimento di minimizzare elettrone di carica (Figura 1). </li></ol> 2. Preparazione e analisi di PLGA Ponteggi 2.1 Electrospinning PLGA Ponteggi <ol><li> In una cappa aspirante sciogliere acido poli (lattico-co-glicolico) (PLGA) in diclorometano (DCM) (20% (w / w)) con piridinio formiato (PF) (1% (w / w)). Porre la soluzione in una siringa da 10 ml con un ago smussato riempimento 18 G e sicuro idonei a una pompa a siringa. </li><li> Dist. la punta dell&#39;ago 20 centimetri di distanza da un 20cm x 15 cm piano di raccolta alluminio. </li><li> Fissare l&#39;elettrodo di un alimentatore ad alta tensione alla punta della siringa e la terra alla piastra di raccolta alluminio. ATTENZIONE: Si deve prestare attenzione in quanto l&#39;alta tensione è usato cioè di spegnere sempre l&#39;alimentazione elettrica prima di gestire qualsiasi apparecchiatura elettrofilatura. </li><li> Consegnare la soluzione con un flusso costante di 3,5 m / ora a 12 kV per 2 ore. Elettrospinning utilizzando queste condizioni darà una profondità un&#39;impalcatura di circa 60 micron. </li><li> Lasciare il patibolo in una cappa per 24 ore per consentire i residui di solvente di evaporare. </li></ol> 2.2 Electrospinning pH Responsive PLGA Ponteggi <ol><li> Preparare ponteggi incorporano pH nanosensori reattivi come descritto nella sezione 2.1, ma con la modifica di aggiungere nanosensori per la soluzione di polimero (5 mg / ml). Sospendere il nanosensori nella soluzione PLGA con l&#39;assistenza di ultrasuoni (circa 5 min) prima<html> per la messa in una siringa da 10 ml. </li></ol> 2.3 SEM di PLGA impalcatura e pH Impalcatura Responsive <ol><li> Porre un campione del patibolo PLGA o pH patibolo reattivo su un microscopio elettronico rivestito stub carbonio e procedere come descritto per SEM di nanosensori (Figura 1). </li></ol> 2.4 Calibrazione del pH impalcatura Responsive <ol><li> Porre un campione di pH scaffold reattivo in una piastra di coltura a 35 mm e immergersi in apposite soluzioni tampone. </li><li> In un microscopio confocale utilizzare un laser argon 488 nm per eccitare la FAM e un laser krypton 568 nm per eccitare il TAMRA entro i nanosensori. Osservare l&#39;emissione di fluorescenza di pH ponteggi rispondenti a 500-530 nm per FAM e 558-580 nm per TAMRA. (Figura 2). Utilizzare la scansione sequenziale per evitare la raccolta di lunghezze d&#39;onda di eccitazione. </li></ol> 3. Coltura cellulare su PLGA Ponteggi e pH Responsive PLGA Ponteggi S copi &quot;&gt; Nota: Le seguenti deve essere eseguita in un armadio coltura cellulare. 3.1 Preparazione di PLGA Ponteggi per coltura cellulare <ol><li> Tagliare le PLGA o pH reattivo ponteggi PLGA in due centimetri 2 pezzi. </li><li> Sterilizzare scaffold mediante irradiazione con raggi ultravioletti (UV) ad una distanza di 8 cm per 15 min per lato. </li><li> Trasferire i ponteggi ad una piastra di coltura 12 pozzetti e mettere un anello in acciaio sulla parte superiore. Aggiungere una soluzione di penicillina / streptomicina (5% v / v) in tampone fosfato salino (PBS) all&#39;interno e all&#39;esterno dell&#39;anello dell&#39;acciaio, incubare una notte (37 ° C, 5% CO 2). Nota: l&#39;anello di acciaio è stato realizzato presso l&#39;Università di Nottingham e ha le seguenti dimensioni: diametro esterno 2 cm, 1 cm di diametro interno, 1 cm di profondità. </li><li> Rimuovere la soluzione sterilizzante e lavare con PBS. </li><li> Aggiungere cella di coltura verso l&#39;interno (500 microlitri) e all&#39;esterno (500 microlitri) dell&#39;anello acciaio, posto in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2 </sub&gt;) mentre preparare una sospensione cellulare. </li><li> Preparare una sospensione cellulare ed eseguire una conta cellulare utilizzando un saggio di esclusione Trypan Blue. </li><li> Creare una sospensione di cellule per ottenere un numero di cellule di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Rimuovere i supporti da dentro e fuori dal ring in acciaio. </li><li> Sostituire con preriscaldata mezzi di coltura delle cellule sulla parte esterna dell&#39;anello dell&#39;acciaio (1 m). </li><li> Aggiungere 300 microlitri della sospensione cellulare all&#39;interno dell&#39;anello acciaio - piastra roccia avanti e indietro delicatamente per distribuire le cellule. </li><li> Posizionare la piastra di coltura cellulare in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) - l&#39;adesione cellulare avrebbe dovuto aver luogo entro 24 ore, ma continuare cultura per tutto il tempo dell&#39;esperimento richiede - rinfrescante media ogni 2-3 giorni. </li></ol> 3.2 nanosensori Consegna in cellule coltivate su PLGA impalcatura <ol><li> Cellule Seed Onto PLGA patibolo come descritto nella sezione 3.1. Per questo studio un vuoto PLGA patibolo (non contenanosensori Ning) è stato utilizzato a causa della sovrapposizione di emissione di fluorescenza durante l&#39;imaging. </li><li> Posizionare la cella scaffold seminato in un incubatore (37 ° C, 5% CO 2) per 72 ore per permettere alle cellule di crescere e migrano in tutto il ponteggio prima nanosensori consegna. </li><li> Prima di nanosensori consegna lavare le cellule con PBS e cambiare il supporto da terreni di coltura standard per i media liberi antibiotici e siero, incubare (37 ° C, 5% CO 2) per 1 ora. Nota: mezzi di coltura standard per 3T3 compone di mezzo di Eagle modificato da Dulbecco supplementato con siero fetale di vitello, soluzione ((v / v) 10%) L-glutammina (2 mM), penicillina / streptomicina (1% (v / v)) . </li><li> Durante il periodo di incubazione preparare il complesso nanosensori-liposomi da sonicating brevemente nanosensori (5 mg) con OptiMEM (50 pl) per creare una soluzione A. </li><li> Crea soluzione B aggiungendo Lipofectamine 2000 (5 ml) a OptiMEM (45 microlitri), incubare a temperatura ambiente per 5 min. </li><li> Aggiungere la soluzioneA alla soluzione B, incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare la soluzione C, che è il complesso nanosensori-liposoma. </li><li> Aggiungere la soluzione C (100 microlitri) di cellule e incubare (37 ° C, 5% CO 2) per 3 ore. </li><li> Rimuovere le cellule scaffold seminati dal termostato, supporto Aspirare e lavare due volte con PBS prima di aggiungere PBS (1 ml) per consentire la visualizzazione di cellule in vivo mediante microscopia confocale. Nota: PBS è stato utilizzato in questo protocollo in modo che l&#39;indicatore rosso fenolo presente nella cella di coltura non ha causato autofluorescenza e anche perché veniva eseguita una calibrazione a differenti pH. Tuttavia fenolo media liberi rosse potrebbero essere utilizzati per l&#39;analisi a lungo termine delle colture cellulari. </li><li> Immergere la cella scaffold seminato nei buffer di diverso pH e monitorare la risposta dei nanosensori associati con le cellule. </li><li> Monitorare Phi determinando il rapporto tra le intensità di fluorescenza da FAM e TAMRA osservando fluorescenza utilizzando la microscopia confocale (Figure 3). </li></ol> 3.3 nanosensori posizione all&#39;interno di cellule di mammifero <ol><li> Incubare le cellule con nanosensors contenenti solo il colorante FAM come descritto nella sezione 3.2 (questo perché l&#39;emissione di fluorescenza di TAMRA è nella stessa regione spettrale come LysoTracker Rosso). Preparare questi nanosensori come descritto nella sezione 1.1, ma con l&#39;omissione di preparazione e aggiungendo TAMRA. </li><li> Dopo il periodo di consegna nanosensori diluire la soluzione LysoTracker Rosso a 50 nm. </li><li> Aggiungere una aliquota della soluzione diluita (2 ml) per cellule in coltura su scaffold PLGA. </li><li> Incubare le cellule con LysoTracker rosso per 1 ora (37 ° C, 5% CO 2). </li><li> Dopo il periodo di incubazione rimuovere il supporto e lavare le cellule due volte con PBS (pH 7,4) prima di cambiare il supporto di PBS (pH 7,4) (2 ml) in preparazione per la visualizzazione mediante microscopia confocale. Nota: fenolo media liberi rosse potrebbero essere utilizzati al posto di PBS. </li><li> Aggiungere la macchia nucleare DraQ5 al PBS così una concentrazione finale di 5 mM e incubare le cellule per 3 min (37 ° C 5% CO 2). Non è necessario cambiare il supporto successivo al periodo di incubazione con DRAQ5. </li><li> Utilizzare un laser a 488 nm argon per eccitare il FAM solo nanosensori, una krypton laser 568 nm per eccitare il LysoTracker Rossa e 633 nm elio / neon laser per eccitare il cromoforo DRAQ5 e osservare la fluorescenza a 500-530 nm, 580-600 nm, 650 -750 nm rispettivamente (Figura 3). Utilizzare la scansione sequenziale per evitare la raccolta di lunghezze d&#39;onda di eccitazione. </li></ol>

<ol><li>Takimoto, Y., Dixit, V., Arthur, M., Gitnick, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+liver+tissue+formation+in+rats+using+a+novel+collagen-polypropylene+scaffold%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Transplantation%22%5BJournal%5D)">De novo liver tissue formation in rats using a novel collagen-polypropylene scaffold.</a> Cell Transplantation. 12 (4), 413-421 (2003).</li>
<li>Sales, V. L., Engelmayr, G. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+precoating+of+elastomeric+tissue-engineering+scaffolds+increased+cellularity%2C+enhanced+extracellular+matrix+protein+production%2C+and+differentially+regulated+the+phenotypes+of+circulating+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Protein precoating of elastomeric tissue-engineering scaffolds increased cellularity, enhanced extracellular matrix protein production, and differentially regulated the phenotypes of circulating endothelial progenitor cells.</a> Circulation. 116 (11), I55-I63 (2007).</li>
<li>Hollister, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Porous+scaffold+design+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Materials%22%5BJournal%5D)">Porous scaffold design for tissue engineering.</a> Nature Materials. 4 (7), 518-524 (2005).</li>
<li>Li, D., Xia, Y. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+nanofibers%3A+Reinventing+the+wheel%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Advanced+Materials%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of nanofibers: Reinventing the wheel?</a> Advanced Materials. 16 (14), 1151-1170 (2004).</li>
<li>Sill, T. J., von Recum, H. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electro+spinning%3A+Applications+in+drug+delivery+and+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Electro spinning: Applications in drug delivery and tissue engineering.</a> Biomaterials. 29 (13), 1989-2006 (2008).</li>
<li>Pham, Q. P., Sharma, U., Mikos, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospinning+of+polymeric+nanofibers+for+tissue+engineering+applications%3A+A+review%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Engineering%22%5BJournal%5D)">Electrospinning of polymeric nanofibers for tissue engineering applications: A review.</a> Tissue Engineering. 12 (5), 1197-1211 (2006).</li>
<li>Sawyer, N. B. E., Worrall, L. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+situ+monitoring+of+3D+in+vitro+cell+aggregation+using+an+optical+imaging+system%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">In situ monitoring of 3D in vitro cell aggregation using an optical imaging system.</a> Biotechnology and Bioengineering. 100 (1), 159-167 (2008).</li>
<li>Dan, L., Chua, C. K., Leong, K. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibroblast+Response+to+Interstitial+Flow%3A+A+State-of-the-Art+Review%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Fibroblast Response to Interstitial Flow: A State-of-the-Art Review.</a> Biotechnology and Bioengineering. 107 (1), 1-10 (2010).</li>
<li>Pancrazio, J. J., Wang, F., Kelley, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enabling+tools+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Biosensors+%26+Bioelectronics%22%5BJournal%5D)">Enabling tools for tissue engineering.</a> Biosensors & Bioelectronics. 22 (12), 2803-2811 (2007).</li>
<li>You, Y., Lee, S. W., Youk, J. H., Min, B. M., Lee, S. J., Park, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+degradation+behaviour+of+non-porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29%2Fpoly%28L-lactic+acid%29+fibres+and+porous+ultra-fine+poly%28glycolic+acid%29+fibres%5BTitle%5D)+AND+%22Polymer+Degradation+and+Stability%22%5BJournal%5D)">In vitro degradation behaviour of non-porous ultra-fine poly(glycolic acid)/poly(L-lactic acid) fibres and porous ultra-fine poly(glycolic acid) fibres.</a> Polymer Degradation and Stability. 90 (3), 441-448 (2005).</li>
<li>Dong, Y. X., Liao, S., Ramakrishna, S., Chan, C. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinctive+degradation+behaviors+of+electrospun+PGA%2C+PLGA+and+P%28LLA-CL%29+nanofibers+cultured+with%2Fwithout+cell+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Multi-Functional+Materials+and+Structures%22%5BJournal%5D)">Distinctive degradation behaviors of electrospun PGA, PLGA and P(LLA-CL) nanofibers cultured with/without cell culture.</a> Multi-Functional Materials and Structures. 47 - 50, 1327-1330 (2008).</li>
<li>Xu, Y. H., Sun, J. J., Mathew, G., Jeevarajan, A. S., Anderson, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+glucose+monitoring+and+control+in+a+rotating+wall+perfused+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+and+Bioengineering%22%5BJournal%5D)">Continuous glucose monitoring and control in a rotating wall perfused bioreactor.</a> Biotechnology and Bioengineering. 87 (4), 473-477 (2004).</li>
<li>Harrington, H. C., Rose, F. R. A. J., Reinwald, Y., Buttery, L. D. K., Ghaemmaghami, A. M., Aylott, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+PLGA+fibre+sheets+incorporating+fluorescent+nanosensors%3A+self-reporting+scaffolds+for+application+in+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Methods%22%5BJournal%5D)">Electrospun PLGA fibre sheets incorporating fluorescent nanosensors: self-reporting scaffolds for application in tissue engineering.</a> Analytical Methods. 5 (1), (2013).</li>
<li>Wang, X. Y., Drew, C., Lee, S. H., Senecal, K. J., Kumar, J., Sarnuelson, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+membranes+for+highly+sensitive+optical+sensors%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Letters%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous membranes for highly sensitive optical sensors.</a> Nano Letters. 2 (11), 1273-1275 (2002).</li>
<li>Yang, Y., Yiu, H. H. P., El Haj, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On-line+fluorescent+monitoring+of+the+degradation+of+polymeric+scaffolds+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Analyst%22%5BJournal%5D)">On-line fluorescent monitoring of the degradation of polymeric scaffolds for tissue engineering.</a> Analyst. 130 (11), 1502-1506 (2005).</li>
<li>Blackwood, K. A., McKean, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+biodegradable+electrospun+scaffolds+for+dermal+replacement%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Development of biodegradable electrospun scaffolds for dermal replacement.</a> Biomaterials. 29 (21), 3091-3104 (2008).</li>
<li>Bashur, C. A., Dahlgren, L. A., Goldstein, A. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+fiber+diameter+and+orientation+on+fibroblast+morphology+and+proliferation+on+electrospun+poly%28D%2CL-lactic-co-glycolic+acid%29+meshes%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Effect of fiber diameter and orientation on fibroblast morphology and proliferation on electrospun poly(D,L-lactic-co-glycolic acid) meshes.</a> Biomaterials. 27 (33), 5681-5688 (2006).</li>
<li>Li, W. J., Laurencin, C. T., Caterson, E. J., Tuan, R. S., Ko, F. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrospun+nanofibrous+structure%3A+A+novel+scaffold+for+tissue+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biomedical+Materials+Research%22%5BJournal%5D)">Electrospun nanofibrous structure: A novel scaffold for tissue engineering.</a> Journal of Biomedical Materials Research. 60 (4), 613-621 (2002).</li>
<li>Sung, H. J., Meredith, C., Johnson, C., Galis, Z. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+scaffold+degradation+rate+on+three-dimensional+cell+growth+and+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The effect of scaffold degradation rate on three-dimensional cell growth and angiogenesis.</a> Biomaterials. 25 (26), 5735-5742 (2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

L&#39;ingegneria tissutale aspira a creare sostituti biologici che può essere utilizzato sia come in vivo come modelli in vitro e in tessuto in terapia sostitutiva tessuto di riparare, sostituire, mantenere o migliorare la funzione di un particolare tessuto o organo. Sostituti sintetici sono stati utilizzati per molti anni a sostituire o riparare ausilio di tessuti, ma questi spesso falliscono a causa della scarsa integrazione con il tessuto ospite e / o infezione, che alla fine porta al rifiu...

Una strategia chiave nell&#39;ingegneria dei tessuti è l&#39;uso di materiali biocompatibili per fabbricare scaffold cui morfologia assomiglia al tessuto che sta per sostituire ed è anche in grado di sostenere la crescita e la funzione delle cellule 1,2. L&#39;impalcatura fornisce supporto meccanico consentendo attaccamento cellulare e la proliferazione tuttavia permette la migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D. Il ponteggio deve permettere il trasporto di massa di nutrienti cellulari e non inibire la rimozione dei rifiuti metabolici 3. Electrospinning è emerso come un metodo promettente per la realizzazione di supporti polimerici in grado di supportare la crescita cellulare 4-6. Le fibre elettrofilate non tessuti prodotti sono adatti per la crescita cellulare in quanto sono spesso porosi e permettono l&#39;interazione cellula-cellula e migrazione cellulare durante gli interstizi di un costrutto cellulare 3D 7. E &#39;importante monitorare la vitalità cellulare durante tl periodo di coltura e per garantire che la vitalità cellulare è mantenuta per tutto l&#39;arco del costrutto 3D. Ad esempio, condizioni di coltura come l&#39;ossigeno e pH richiedono un attento controllo, come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere all&#39;interno del costrutto 3D. Bioreattori o sistemi di perfusione possono essere impiegati per simulare le condizioni in vivo di flusso interstiziale e come risultato un trasferimento incremento dei nutrienti e la rimozione metabolica rifiuti 8. La questione se tali sistemi sono garantire condizioni microambientali costanti può essere affrontato valutando il microambiente cellulare in tempo reale. Metriche chiave microambiente che possono essere monitorati in tempo reale le seguenti: temperatura, composizione chimica di supporti cellulari, concentrazione di ossigeno disciolto e anidride carbonica, pH e umidità. Di questi parametri, la temperatura può essere più facilmente monitorata utilizzando sonde in situ. Metodi per monitorare i restanti parametri di cui comunemente inrimozione volve di una aliquota di campionamento e quindi disturbare la coltura cellulare e aumentano il rischio di contaminazione. Si cercano continui, metodi in tempo reale. Metodi di controllo attuali di solito contare su strumenti che analizzano fisicamente il costrutto cellulare come un monitor pH o sonda ossigeno. Tuttavia, questi metodi intrusivi possono danneggiare il costrutto cellulare e disturbare l&#39;esperimento in corso. Monitoraggio non invasivo di concentrazioni dell&#39;analita all&#39;interno del costrutto 3D potrebbe consentire il monitoraggio in tempo reale di vari aspetti ambientali quali la riduzione dei nutrienti 9. Ciò consentirebbe di valutare apporto di sostanze nutritive alle regioni più profonde all&#39;interno della struttura e determinare se scorie metaboliche veniva eliminato in modo efficace 10,11. Sistemi che tentano di risolvere il problema di invasività genere comportano l&#39;uso di una camera di perfusione che passa mezzo di coltura sia attraverso il recipiente di coltura e ai sensori esterni per monitorare pH, ossigeno e glucosio 12. Ilre è crescente interesse nello sviluppo di sensori che possono essere integrati direttamente nel recipiente di coltura che non richiede la rimozione di una aliquota di campionamento e come tale sarebbe fornire monitoraggio in situ. Per affrontare tali carenze per in situ e monitoraggio non invasivo delle condizioni microambientali abbiamo incorporato analiti nanosensori reattivo in scaffolds elettrofilate per la produzione di ponteggi auto-segnalazione 13. Ponteggi che agiscono come dispositivi di rilevamento per il monitoraggio dell&#39;attività di fluorescenza sono stati preparati in precedenza, in cui il dispositivo di rilevamento era o scaffold polimerico effettivo creato da elettrospinning o attraverso l&#39;uso di un colorante reattivo analita che è incorporato nel polimero prima della formazione del ponteggio 14,15 . Tuttavia, questi dispositivi di rilevamento hanno il potenziale per dare uscite ottiche erronee causate da possibili interferenze di altri analiti. L&#39;uso di un dispositivo di rilevamento su raziometricoch come quelli preparati nel protocollo descritto ha il potenziale per eliminare questi possibili effetti negativi e fornire una risposta specifica per l&#39;analita in questione. I ponteggi elettrofilate qui presentati sono stati preparati dal sintetico co-polimero di poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA), selezionato a causa di avere Food and Drug Administration (FDA), grazie alle sue proprietà biodegradabili e biocompatibili ed una pista record di sostenere la crescita e la funzione dei vari tipi di cellule 16-18. Gli analiti raziometrico nanosensori reattivo pronti sono sensibili al pH. I nanosensori incorporano due coloranti fluorescenti in una matrice sol-gel biocompatibile in cui un colorante, FAM è sensibile al pH e l&#39;altra, TAMRA agisce come standard interno in quanto non è sensibile al pH. Inoltre la fluorescenza sia FAM e TAMRA può essere analizzata separatamente in quanto non si sovrappongono in modo significativo. Determinare il rapporto tra la emi fluorescenzaSsion di entrambi i coloranti a specifiche lunghezze d&#39;onda dà una risposta pH indipendente da altre condizioni ambientali. Le impalcature self-reporting potrebbero consentire la valutazione ripetizione del pH in situ e in tempo reale senza interrompere il modello 3D sviluppato. Abbiamo dimostrato che questi scaffold sono in grado di supportare attaccamento e la proliferazione cellulare e rimangono reattivo al analita in questione. La cinetica di acidi sottoprodotti di costrutti ingegnerizzati rimane poco studiato e come tale utilizzando i ponteggi reattive pH possono notevolmente facilitare tali studi 19. Inoltre, l&#39;uso dei ponteggi auto-segnalazione per applicazioni di ingegneria tissutale presenta l&#39;opportunità di comprendere appieno, monitorare e ottimizzare la crescita del modello 3d costrutti di tessuti in vitro, non invasivo e in tempo reale. I nanosensori reattiva di pH sono stati consegnati per l&#39;ambiente intracellulare di fibroblasti in coltura su electrospun PLGA ponteggiods. Il rapporto tra l&#39;emissione di fluorescenza dei coloranti sono stati utilizzati per monitorare pHi e rispetto ad un auto-segnalazione ponteggio Incorporando nanosensori pH. La consegna di nanosensori a cellule coltivate in un ambiente 3D potrebbe consentire il monitoraggio della concentrazione di analita in profondità all&#39;interno del costrutto in modo non distruttivo. Pertanto nanosensori possono essere uno strumento di imaging valida per valutare in modo non distruttivo il comportamento delle cellule in tutto 3D costruisce consentendo analisi a lungo termine. Screening della concentrazione dell&#39;analita di singole celle all&#39;interno di un costrutto 3D potrebbe assicurare che stanno ricevendo concentrazioni di nutrienti e di ossigeno sufficienti. Parametri di processo di monitoraggio potrebbe contribuire allo sviluppo di tecniche standardizzate per il trasporto di massa effettiva di ossigeno e nutrienti. La consegna dei nanosensori per l&#39;ambiente intracellulare e l&#39;incorporazione di nanosensori in scaffold polimerici potrebbe essere combinati per consentire la valutazione della vitalità cellulare così come la prestazione impalcatura all&#39;interno const 3Dructs durante il processo di crescita dei tessuti. Questo può portare ad un aumento della conoscenza di questi costrutti e progredire la realizzazione di sostituti del tessuto biologico pertinenti.

<table><tbody><tr><td>Etanolo</td><td>Fisher</td><td>32221</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilformammide anidra (DMF)</td><td>Sigma</td><td>270547</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di ammonio 50% (v/v) soluzione acquosa</td><td>Alfa Aesar</td><td>35574</td><td>diluito al 30% (v/v) con acqua pura</td></tr><tr><td>TEOS</td><td>Sigma</td><td>13190-3</td><td></td></tr><tr><td>3-Amminopropiltrietossisilano (APTES)</td><td>Sigma</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>5-(e-6)-carbossifluoresceina, estere succinimidilico (FAM-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1311</td><td></td></tr><tr><td>6-carbossitetrametilrodamina, estere succinimidilico (TAMRA-SE)</td><td>Invitrogen</td><td>C1171</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-9638</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato di sodio bibasico (0,2 M)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S-0876</td><td></td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S8045</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T4174</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D6046</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Fonte Bioscience</td><td>Batch-213-101992</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7513</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 2000</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Optimem</td><td>Invitrogen</td><td>11058-021</td><td></td></tr><tr><td>LysoTracker Rosso</td><td>Invitrogen</td><td>L-7528</td><td></td></tr><tr><td>Draq5</td><td>Biostatus Ltd</td><td>DR50050</td><td></td></tr><tr><td>Azoto gassoso</td><td>BOC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DCM</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320269</td><td></td></tr><tr><td>TFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T6508</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocale</td><td>Leica TCS-SP</td><td></td><td>dotato di laser ad argon e kriptone e lente ad immersione in acqua 63X 0.9NA</td></tr><tr><td>Luce UV</td><td>UVLS28 UVP, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra di agitazione</td><td>SB161-3 Misuratore di pH Jencons-PLS</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Jenway modello 3510</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Evaporatore rotante</td><td>Buchi Rotary Evaporatore R200</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (nanosensori)</td><td>Hermle Z300</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga (coltura cellulare)</td><td>Thermo Scientific Heraeus Biofuge Primo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Whirlimixer Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrasuonatore</td><td>FB11021 Fisherbrand</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foglio di alluminio</td><td>Nottingham University</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Piastra per colture cellulari da 35 mm</td><td>Siringa</td><td>3000035 da 10</td><td></td></tr><tr><td>ml Siringa</td><td>Becton Dickenson</td><td></td><td></td></tr><tr><td>3T3 Fibroblasti</td><td>Collezione europea di colture</td><td></td><td></td>cellulari</tr><tr><td>PLGA</td><td>Lakeshore Biomaterials</td><td>7525 DLG 7E</td><td></td></tr><tr><td>Formiato di piridinio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8535</td><td></td></tr><tr><td>Trypan blue</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T8154</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato monobasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S9638</td><td></td></tr><tr><td>Sodio fosfato bibasico</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S5136</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>320331</td><td></td></tr></tbody></table>

ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-dimensional

Self-reporting Scaffolds for 3-Dimensional Cell Culture

Celle di coltura in 3D su ponteggi adeguati è pensato per imitare al meglio il microambiente in vivo e aumentare le interazioni cellula-cellula. La risultante costrutto cellulare 3D può essere spesso più rilevante per studiare gli eventi molecolari e le interazioni cellula-cellula di esperimenti simili studiati in 2D. Per creare culture efficaci 3D con la vitalità delle cellule elevata in tutto il patibolo le condizioni di coltura come ossigeno e pH bisogno di essere attentamente controllata come gradienti di concentrazione di analiti possono esistere in tutto il costrutto 3D. Qui si descrivono i metodi di preparazione biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel e la loro incorporazione in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate insieme a loro successiva preparazione per la coltura di cellule di mammifero. I ponteggi reattivo pH possono essere utilizzati come strumenti per determinare microambientali pH all&#39;interno di un costrutto cellulare 3D. Inoltre, tendiamo particolare la consegna di pH nanose reattivansors per l&#39;ambiente intracellulare di cellule di mammifero la cui crescita è stata sostenuta da elettrofilate scaffold PLGA. La posizione citoplasmatica dei nanosensori reattive pH può essere utilizzato per monitorare pH intracellulare (PHI) durante la sperimentazione in corso.

La distribuzione dimensionale delle pH nanosensori reattivi preparati è stata caratterizzata mediante SEM, dove la popolazione di nanosensori impressionate stati misurati e risultano avere dimensioni nanometriche nell&#39;intervallo 240-470 nm (Figura 1A). Il raggiungimento di un diametro ridotto e ragionevolmente piccolo è coerente con l&#39;utilizzo del metodo Stöber per preparare nanoparticelle. È stato trovato che utilizzando un ambiente basico pH durante la sintesi di nanoparticelle IE nan...

Biocompatibili pH reattivo nanosensori sol-gel possono essere incorporati in poli (acido lattico-co-glicolico) (PLGA) ponteggi elettrofilate. Le impalcature self-reporting prodotti possono essere utilizzati per il monitoraggio in situ delle condizioni microambientali mentre coltura di cellule sul patibolo. Questo è vantaggioso in quanto il costrutto cellulare 3D può essere monitorato in tempo reale senza disturbare l&#39;esperimento.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Culturing cells in 3D on appropriate scaffolds is thought to better mimic the in vivo microenvironment and increase cell-cell interactions. The resulting ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre nanosensori sensibili al pH e scaffold autoreportanti che possono essere monitorati in tempo reale e in situ, al fine di facilitare la comprensione delle condizioni che influenzano la crescita cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando nanosensori biocompatibili sensibili all'analita, in grado di monitorare il pH attraverso segnali fluorescenti. In un secondo passaggio, i nanosensori sensibili al pH vengono incorporati in scaffold polimerici elettrofilati, creando un ambiente tridimensionale su cui coltivare e monitorare le cellule.Successivamente, le cellule mammifere vengono seminate sui scaffold elettrotessuti e i nanosensori vengono inoltre consegnati nel loro ambiente intracellulare al fine di monitorare il pH intracellulare. Durante l'esperimento, si ottengono risultati che dimostrano la capacità dei nanosensori intracellulari e dei scaffold autorilevanti di monitorare il pH all'interno di ambienti ingegnerizzati di tessuto, basandosi sui rapporti di fluorescenza acquisiti mediante microscopia confocale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di sonde elett

self-reporting-scaffolds-for-3-dimensional-cell-culture

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Vi presentiamo due processi per la microfabbricazione di chip polimerici porosi tridimensionali coltivazione delle cellule. Il primo è goffratura a caldo combinato con un solvente processo di saldatura vapore. La seconda utilizza un processo recentemente sviluppato microthermoforming combinata con la tecnologia agli ioni di pista che porta ad una significativa semplificazione di fabbricazione.

Microfabbricazione di chip di dimensioni Ponteggi per tridimensionale coltura cellulare

Questo manoscritto presenta un protocollo dettagliato per la fabbricazione di una piattaforma di coltura di epatociti tridimensionale emergente, l'impalcatura di cristalli colloidali invertiti e le tecniche concomitanti per valutare il comportamento degli epatociti. I pori controllabili in base alle dimensioni, l'interconnettività e la capacità di coniugare le proteine della matrice extracellulare all'impalcatura di poli(glicole etilenico) (PEG) migliorano le prestazioni delle cellule Huh-7.5.

Fabbricazione di invertito colloidale cristallo poli (glicole etilenico) Scaffold: una piattaforma Cell Culture tridimensionale per il fegato Tissue Engineering

Qui, descriviamo un protocollo rapido e flessibile per la formazione di sferoidi cellulari 3D attraverso l'aggregazione cellulare. Questo è facilmente adattabile a più tipi di cellule ed è adatto per l'uso in una varietà di applicazioni, tra cui la migrazione cellulare, l'invasione o i saggi anoikis e per l'imaging e la quantificazione delle interazioni cellula-matrice.

Un metodo delle celle di aggregazione efficiente e flessibile per il 3D Spheroid Produzione

Qui, presentiamo un protocollo per ottenere sistemi 3D-cultura in auto-assemblanti peptide impalcature per promuovere la differenziazione dei chondrocytes articolari umani dedifferentiated in cartilagine-come il tessuto.

Coltura di cellule di mammifero in scaffold tridimensionale Peptide

Questo documento elenca i passaggi necessari per seminare linee cellulari di neuroblastoma su scaffold tridimensionali a base di collagene precedentemente descritti, mantenere la crescita cellulare per un periodo di tempo predeterminato e recuperare scaffold per diverse analisi della crescita cellulare e del comportamento cellulare e applicazioni a valle, adattabili per soddisfare una serie di obiettivi sperimentali.

Modello biomimetico tridimensionale in vitro di neuroblastoma utilizzando scaffold a base di collagene

Questo protocollo descrive in dettaglio un metodo per la produzione di tre diversi tipi di sferoidi in un modo che li rende adatti per lo screening e l'analisi ad alto contenuto su larga scala. Inoltre, vengono presentati esempi che mostrano come possono essere analizzati a livello sferoidale e di singole cellule.

Un metodo robusto per la produzione su larga scala di sferoidi per applicazioni di screening e analisi ad alto contenuto

Ridurre al minimo la variabilità della frazione di particelle all'interno di scaffold granulari facilita la sperimentazione riproducibile. Questo lavoro descrive i metodi per generare scaffold granulari con frazioni di particelle controllate per applicazioni di ingegneria tissutale in vitro .

Controllo della frazione di particelle in scaffold di particelle ricotto microporose per colture cellulari 3D

Presentiamo un protocollo per la coltivazione di sferoidi ad alta riproducibilità e la loro caratterizzazione fenotipica utilizzando l'acquisizione di immagini e la proteomica.

Analisi fenotipica semi-automatizzata di colture cellulari sferoidi 3D funzionali

Gli sferoidi cellulari sono stati considerati un potenziale modello nel campo delle applicazioni biologiche. Questo articolo descrive i protocolli per la generazione scalabile di sferoidi cellulari utilizzando un dispositivo di assemblaggio acustico 3D, che fornisce un metodo efficiente per la fabbricazione robusta e rapida di sferoidi cellulari uniformi.

Dispositivo di assemblaggio acustico tridimensionale per la produzione di massa di sferoidi cellulari

C'è un bisogno critico di modelli di cancro 3D che catturino il crosstalk eterocellulare per studiare le metastasi del cancro. Il nostro studio presenta la generazione di epiteliali stromali eteromulticellulari in un ambiente privo di scaffold e scaffold che può essere utilizzato per studiare l'invasione e le distribuzioni spaziali cellulari.

Cellule stromali eteromulticellulari in colture 3D prive di scaffold di cellule tumorali epiteliali per guidare l'invasione

Impara a creare nanosensori pH reattivi e ponteggi self-reporting in PLGA per il monitoraggio in tempo reale delle condizioni microambientali durante la coltura cellulare tridimensionale.

Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

Esplora altri video