Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di produrre nanosensori sensibili al pH e scaffold auto-segnalanti che possono essere monitorati in tempo reale e in situ al fine di aiutare con la comprensione delle condizioni che influenzano la crescita cellulare. Ciò si ottiene preparando prima nanosensori biocompatibili sensibili all'analita, in grado di monitorare il pH attraverso uscite di fluorescenza. Come seconda fase, i nanosensori sensibili al pH sono incorporati in scaffold polimerici elettrofilati che formano un ambiente 3D su cui le cellule possono essere coltivate e monitorate.

Successivamente, le cellule di mammifero vengono posizionate su scaffold elettrofilati e anche i nanosensori vengono inseriti nel loro ambiente intracellulare per monitorare il pH intracellulare. Durante la sperimentazione si ottengono risultati che mostrano la capacità dei nanosensori intracellulari e degli scaffold self-reporting di monitorare il pH all'interno di ambienti di ingegneria tissutale sulla base dei rapporti di fluorescenza acquisiti mediante microscopia confocale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di sonde elettroniche di pH, è che le misure possono essere eseguite in situ e in tempo reale senza dover disturbare la crescita cellulare.

Per iniziare, preparare i fluorofori sciogliendo 1,5 milligrammi di fam SE in un millilitro di dimetilformammide noto come DMF in un fondo rotondo. Flask sciogliere anche 1,5 milligrammi di Tamara SE in un millilitro di DMF in un secondo matrasso. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tre amminopropil trietile a ciascun pallone e mescolare continuamente al buio in un'atmosfera secca di azoto a 21 gradi Celsius per 24 ore.

Quindi, aggiungere 250 microlitri di entrambe le soluzioni coloranti a una miscela contenente sei millilitri di etanolo e quattro millilitri di idrossido di ammonio contenuti in un pallone a fondo rotondo. Mescola questa nuova miscela a 21 gradi Celsius dopo un'ora. Aggiungere lentamente 0,5 millilitri di silicato di tetraetilorto alla miscela e continuare a mescolare per altre due ore.

Durante questo periodo, aspettatevi che la miscela diventi torbida, quindi raccogliete i nanosensori mediante evaporazione rotativa e conservateli in una fiala di vetro a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Quindi, aggiungere i nanosensori di pH essiccati a cinque milligrammi per millilitro nei tamponi fosfato di Sorenson, che vanno da pH 5,5 a pH 7,5 con incrementi di pH 0,5. Risospendere i nanosensori facendo vorticare i campioni per tre minuti e poi sonicarli per cinque minuti o fino a quando la soluzione non diventa torbida.

Raccogli i dati di calibrazione misurando i campioni a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri per FAM e 568 nanometri. Per Tamara, raccogliere le emissioni a 500-530 nanometri per FAM e da 558 a 580 nanometri per Tamara e calcolare il rapporto tra i massimi di emissione prodotti a ciascun valore di pH. Quindi preparare il campione per l'imaging SEM posizionando un campione di nanosensori su un microscopio elettronico rivestito di carbonio, rivestire le particelle con oro per cinque minuti in un'atmosfera di argon.

Una volta rivestiti, posizionare i campioni nel microscopio elettronico e regolare la distanza di lavoro, la tensione e l'ingrandimento per ridurre al minimo la carica di elettroni e produrre le migliori immagini in una cappa aspirante. Preparare una soluzione di PLGA al 20% in clorometano con formiato di perineo all'1%. Caricare la soluzione in una siringa da 10 millilitri con un ago di riempimento smussato calibro 18 e inserirla saldamente su una pompa a siringa.

Questa soluzione verrà utilizzata per fare in modo che gli scaffold PLGA di controllo distanziano la punta dell'ago di 20 centimetri da una piastra di raccolta in alluminio di 20 x 15 centimetri e colleghino l'elettrodo di un alimentatore ad alta tensione alla punta della siringa e mettano a terra il filo alla piastra di raccolta in alluminio. Quindi, accendi l'alimentatore e regola la tensione a 12 kilovolt. Quindi accendere la pompa a siringa ed erogare la soluzione utilizzando una portata costante di 3,5 millilitri all'ora per due ore.

Ciò produrrà una profondità dell'impalcatura di circa 60 micron. Una volta terminato, spegnere l'apparecchiatura e lasciare il ponteggio nella cappa per 24 ore per consentire l'evaporazione del residuo di solvente. Per preparare gli scaffold incorporati con nanosensori sensibili al pH, preparare la soluzione PLGA come prima, ma questa volta aggiungere anche cinque milligrammi per millilitro di nanosensori.

Quindi elettrocentrifugare il pH reattivo utilizzando le stesse impostazioni di prima. Successivamente, calibrare la reattività al pH dello scaffold posizionando piccoli campioni dello scaffold essiccato con nanosensori incorporati in piastre di coltura da 35 millimetri e immergendoli in due millilitri di tamponi fosfato di sorensen tra pH 5,5 e 7,5 con incrementi di 0,5 su un microscopio confocale. Usa un laser ad argon da 488 nanometri per eccitare FAM e un laser a kripton da 568 nanometri per eccitare Tamara all'interno dei nanosensori.

Osservare l'emissione a 500-530 nanometri per FAM e da 558 a 580 nanometri per Tamara, quindi calcolare il rapporto tra i massimi di emissione prodotti a ciascun valore di pH. Innanzitutto, sterilizzare le superfici delle impalcature con una fonte di luce UV a una distanza di otto centimetri per 15 minuti su ciascun lato. Quindi trasferire sterilemente gli scaffold su una piastra di coltura a 12 pozzetti e posizionare un anello d'acciaio con un diametro interno di un centimetro e un diametro esterno di due centimetri sopra lo scaffold.

Quindi, aggiungere PBS con una striscia di penna al 5% all'interno e all'esterno dell'anello d'acciaio e incubare i campioni durante la notte. Il giorno dopo. Rimuovere il PBS con il 5% di strep pen e lavare le impalcature con PBS.

Quindi aggiungere 500 microlitri di terreno di coltura cellulare all'interno e all'esterno dell'anello in acciaio e preriscaldare la piastra in un incubatore. Successivamente, raccogli le cellule di interesse e prepara una sospensione cellulare di una volta 10 per le sei cellule per millilitro. Quando le celle sono pronte, rimuovere il terreno dal pozzetto e aggiungere un millilitro di terreno fresco all'esterno dell'anello di acciaio.

Quindi aggiungere 300 microlitri di sospensione cellulare all'interno dell'anello d'acciaio e far oscillare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con il 5% di CO2 e incubare le cellule per tutto il tempo necessario. Rinfrescare il terreno ogni due o tre giorni seminare le cellule sugli scaffold come descritto nella sezione precedente e lasciarle crescere ininterrottamente per 72 ore.

Quindi sciacquare le cellule con PBS e aggiungere 500 microlitri di terreno privo di siero all'esterno dell'anello e 300 microlitri all'interno dell'anello. Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius durante l'incubazione. Preparare la soluzione A aggiungendo cinque milligrammi di nanosensori con 50 microlitri di optimum e fornicando brevemente.

Quindi miscelare la soluzione B aggiungendo cinque microlitri di lipectomia 2000 a 45 microlitri di Optum e lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Quindi, aggiungere la soluzione A alla miscela della soluzione B e quindi incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare la soluzione C, che è il complesso liposomico del nanosensore. Rimuovere la piastra dall'incubatrice e aggiungere 100 microlitri della soluzione complessa all'interno dell'anello d'acciaio.

Quindi riposizionare la piastra nell'incubatrice e incubare le cellule con i complessi di reagenti per lipectomia per tre ore dopo l'incubazione. Aspirare il terreno e lavare le celle due volte con PBS riscaldato prima di immergere l'impalcatura in celle in tamponi di phs diversi per monitorare la risposta dei nanosensori. Ora all'interno delle cellule, è possibile visualizzare le cellule utilizzando la microscopia confocale a fluorescenza per tracciare la posizione dei nanosensori all'interno delle cellule dei mammiferi.

In primo luogo, preparare e consegnare solo fam contenenti nanosensori alle cellule posizionate su scaffold PLGA. Quindi aggiungere due microlitri di 50 nano molari lyo tracker rosso a 300 microlitri di terreno e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius dopo il periodo di incubazione. Rimuovere il terreno e lavare le celle due volte con PBS.

Quindi aggiungere due microlitri di PBS o altri terreni privi di rosso fenolo per coprire le cellule durante l'imaging confocale. Successivamente, aggiungere cinque micromolari della colorazione nucleare, drac cinque al PBS e incubare con le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, rimuovere la piastra dall'incubatore e posizionarla sul tavolino confocale per l'immagine di imaging, gli organelli acidi e il nucleo dei nanosensori utilizzando varie lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione come descritto nel protocollo di testo allegato mentre si utilizza la scansione sequenziale per evitare la raccolta di lunghezze d'onda di eccitazione, la distribuzione dimensionale dei nanosensori sensibili al pH preparati è stata caratterizzata utilizzando SEM in cui la popolazione di nanosensori impersonati è stata misurata e si è scoperto che hanno dimensioni nanometriche nell'intervallo da 240 a 470 nanometri.

A sinistra è mostrata un'immagine di fibre PLGA filate con elettro e a destra ci sono fibre PLGA filate con nanosensori. Le micrografie SEM delle fibre forniscono la prova dell'associazione dei nanosensori sulla superficie delle fibre. Tuttavia, possono anche essere incorporati all'interno delle fibre dell'impalcatura.

Una volta che gli elettroni sono stati fatti girare, i nanosensori mantengono la loro capacità di rimanere otticamente e chimicamente attivi e sono qui mostrati associati alle fibre dell'impalcatura. A sinistra c'è il colorante fam mostrato in verde e a destra c'è il colorante Tamara mostrato in rosso. Il rapporto di intensità della fluorescenza produce una curva di calibrazione come mostrato qui.

I nanosensori valutati da soli e, quando incorporati in scaffold PLGA filati elettronicamente, si rispecchiavano a vicenda, dimostrando che i nanosensori mantengono la loro attività ottica dopo l'incorporazione negli scaffold. I nanosensori incorporati rispondono anche in modo reversibile ai valori di pH variabili, poiché il tampone è stato alternato tra un pH di 5,5 e 7,5. Il rapporto fam Tamra ha prevedibilmente risposto ogni volta che viene mostrato.

Ecco le immagini confocali dei fibroblasti con nanosensori erogati a livello intracellulare tramite reagente di trasfezione. La colocalizzazione puntuale dei coloranti fam e Tamara suggerisce che i coloranti siano rimasti intrappolati nella matrice nanosensoriale. La somministrazione intracellulare dei nanosensori può essere confermata misurando il rapporto fam Tamara delle cellule poste in vari tamponi.

Come si può vedere qui, il rapporto aumenta quando si misurano i nanosensori basati su scaffold , ma rimane stabile quando si misurano i sensori all'interno delle celle. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, i ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale possono studiare in situ e in tempo reale. Il pH intracellulare microambientale cambia all'interno dei costrutti cellulari 3D senza disturbare l'esperimento in corso.