Ponteggi self-reporting per coltura cellulare 3-Dimensional

L'obiettivo generale del seguente esperimento è produrre nanosensori sensibili al pH e scaffold autoreportanti che possono essere monitorati in tempo reale e in situ, al fine di facilitare la comprensione delle condizioni che influenzano la crescita cellulare. Questo risultato si ottiene innanzitutto preparando nanosensori biocompatibili sensibili all'analita, in grado di monitorare il pH attraverso segnali fluorescenti. In un secondo passaggio, i nanosensori sensibili al pH vengono incorporati in scaffold polimerici elettrofilati, creando un ambiente tridimensionale su cui coltivare e monitorare le cellule.

Successivamente, le cellule mammifere vengono seminate sui scaffold elettrotessuti e i nanosensori vengono inoltre consegnati nel loro ambiente intracellulare al fine di monitorare il pH intracellulare. Durante l'esperimento, si ottengono risultati che dimostrano la capacità dei nanosensori intracellulari e dei scaffold autorilevanti di monitorare il pH all'interno di ambienti ingegnerizzati di tessuto, basandosi sui rapporti di fluorescenza acquisiti mediante microscopia confocale. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'uso di sonde elettroniche per il pH, è che le misurazioni possono essere effettuate in situ e in tempo reale senza dover perturbare la crescita cellulare.

Per iniziare, preparare i fluorofori sciogliendo 1,5 milligrammi di fam SE in un millilitro di dimetilformammide, nota come DMF, in un pallone a fondo rotondo. Sciogliere anche 1,5 milligrammi di Tamara SE in un millilitro di DMF in un secondo pallone. Quindi aggiungere 1,5 millilitri di tre amino propil trietilossisilano a ciascun pallone e agitare continuamente al buio, sotto atmosfera di azoto secco, a 21 gradi Celsius per 24 ore.

Successivamente, aggiungere 250 microlitri di entrambe le soluzioni coloranti a una miscela contenente sei millilitri di etanolo e quattro millilitri di idrossido di ammonio contenuti in un pallone a fondo rotondo. Mescolare questa nuova miscela a 21 gradi Celsius dopo un'ora. Aggiungere lentamente 0,5 millilitri di tetraetilortosilicato alla miscela e continuare a mescolare per altre due ore.

In questo periodo, si prevede che la miscela diventi torbida; successivamente, raccogliere i nanosensori mediante evaporazione rotativa e conservarli in un vial di vetro a quattro gradi Celsius per un uso futuro. Successivamente, aggiungere i nanosensori per il pH essiccati a una concentrazione di cinque milligrammi per millilitro in tamponi fosfato di Sorenson, con valori di pH compresi tra 5,5 e 7,5 a intervalli di 0,5 unità di pH. Ri-sospendere i nanosensori agitando i campioni al vortex per tre minuti, quindi sottoporli a sonificazione per cinque minuti o fino a quando la soluzione non diventa torbida.

Raccogliere i dati di calibrazione misurando i campioni a una lunghezza d'onda di eccitazione di 488 nanometri per FAM e 568 nanometri per Tamara. Per Tamara, raccogliere le emissioni tra 500 e 530 nanometri per FAM e tra 558 e 580 nanometri per Tamara, e calcolare il rapporto tra i massimi di emissione prodotti a ciascun valore di pH. Quindi preparare il campione per l'immagine al microscopio elettronico a scansione (SEM) posizionando un campione di nanosensori su un portacampioni per microscopio elettronico rivestito in carbonio e ricoprendo i campioni con uno strato sottile di oro mediante sputtering per cinque minuti in atmosfera di argon.

Dopo aver rivestito, posizionare i campioni nel microscopio elettronico e regolare la distanza di lavoro, la tensione e l'ingrandimento per minimizzare la carica elettronica e ottenere le migliori immagini in una cappa chimica. Preparare una soluzione al 20% di PLGA in diclorometano con il 1% di formiato di perineo. Caricare la soluzione in una siringa da 10 millilitri con un ago da 18 gauge per riempimento ottuso e fissarla saldamente a una pompa per siringhe.

Questa soluzione verrà utilizzata per realizzare scaffold di controllo in PLGA posizionando la punta dell'ago a 20 centimetri da una piastra collettrice in alluminio di dimensioni 20 per 15 centimetri, collegando l'elettrodo di un alimentatore ad alta tensione alla punta della siringa e collegando a massa il filo sulla piastra collettrice in alluminio. Successivamente, accendere l'alimentatore e regolare la tensione a 12 chilovolt. Quindi, accendere la pompa per siringa ed erogare la soluzione con una portata costante di 3,5 millilitri all'ora per due ore.

Questo produrrà una profondità dello scaffold di circa 60 micrometri. Al termine, spegnere l'apparecchiatura e lasciare lo scaffold nell'abbattitore per 24 ore, in modo che i residui di solvente possano evaporare. Per preparare scaffold incorporati con nanosensori sensibili al pH, preparare la soluzione di PLGA come in precedenza, aggiungendo però questa volta cinque milligrammi per millilitro di nanosensori.

Quindi, eseguire l'elettrospinning del materiale sensibile al pH utilizzando le stesse impostazioni precedenti. Successivamente, calibrare la sensibilità al pH dell'impalcatura posizionando piccoli campioni dell'impalcatura essiccata, contenente nanosensori, in piastre di coltura da 35 millimetri e immergendoli in due millilitri di tamponi fosfato di Sørensen con pH compreso tra 5,5 e 7,5, a intervalli di 0,5, su un microscopio confocale. Utilizzare un laser ad argon da 488 nanometri per eccitare il FAM e un laser al cripto da 568 nanometri per eccitare Tamara all'interno dei nanosensori.

Osservare l'emissione da 500 a 530 nanometri per FAM e da 558 a 580 nanometri per Tamara, quindi calcolare il rapporto tra i massimi di emissione prodotti a ciascun valore di pH. Innanzitutto, sterilizzare le superfici dei supporti mediante sorgente di luce UV a una distanza di otto centimetri per 15 minuti su ciascun lato. Successivamente, trasferire in condizioni sterili i supporti in una piastra da coltura a 12 pozzetti e posizionare un anello di acciaio con diametro interno di un centimetro e diametro esterno di due centimetri sopra il supporto.

Successivamente, aggiungere PBS con 5%pen strip all'interno e all'esterno dell'anello di acciaio e incubare i campioni durante la notte. Il giorno successivo, rimuovere il PBS con 5%pen strep e lavare gli scaffold con PBS.

Quindi aggiungere 500 microlitri di mezzo di coltura cellulare all'interno e all'esterno dell'anello di acciaio e preriscaldare la piastra in un incubatore. Successivamente, raccogliere le cellule di interesse e preparare una sospensione cellulare di 1 × 10⁶ cellule per millilitro. Quando le cellule sono pronte, rimuovere il mezzo dal pozzetto e aggiungere un millilitro di mezzo fresco all'esterno dell'anello di acciaio.

Quindi aggiungere 300 microlitri della sospensione cellulare all'interno dell'anello di acciaio e agitare delicatamente la piastra per distribuire uniformemente le cellule. Posizionare la piastra in un incubatore a 37 gradi Celsius con 5%CO2 e incubare le cellule per il tempo necessario. Rinnovare il mezzo ogni due o tre giorni, seminando le cellule sui supporti come descritto nella sezione precedente, e lasciarle crescere ininterrottamente per 72 ore.

Quindi risciacquare le cellule con PBS e aggiungere 500 microlitri di mezzo privo di siero all'esterno dell'anello e 300 microlitri all'interno dell'anello. Incubare la piastra per un'ora a 37 gradi Celsius durante l'incubazione. Preparare la soluzione A aggiungendo cinque milligrammi dei nanosensori a 50 microlitri di OPTI-MEM e mescolando brevemente.

Quindi, preparare la soluzione B aggiungendo cinque microlitri di lipectomia 2000 a 45 microlitri di Optum e lasciare incubare la miscela a temperatura ambiente per cinque minuti. Successivamente, aggiungere la soluzione A alla miscela della soluzione B e quindi incubare a temperatura ambiente per 20 minuti per formare la soluzione C, ovvero il complesso di liposomi nanosensore. Rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere 100 microlitri della soluzione complessata all'interno dell'anello di acciaio.

Quindi rimettere la piastra nell'incubatore e incubare le cellule con i complessi del reagente lipectomia per tre ore dopo l'incubazione. Aspirare il mezzo e lavare le cellule due volte con PBS riscaldato prima di immergere l'impalcatura cellulare in tamponi a diversi valori di pH per monitorare la risposta dei nanosensori. A questo punto, all'interno delle cellule, eseguire l'immagine delle cellule mediante microscopia confocale a fluorescenza per tracciare la localizzazione dei nanosensori all'interno delle cellule mammifere.

Prima di tutto, preparare e somministrare solo fam contenente nanosensori a cellule poste su scaffold in PLGA. Quindi aggiungere due microlitri di lyo tracker red a 50 nanomolar a 300 microlitri di terreno e incubare per un'ora a 37 gradi Celsius al termine del periodo di incubazione. Rimuovere il terreno e lavare le cellule due volte con PBS.

Quindi aggiungere due microlitri di PBS o di un altro mezzo privo di rosso fenolo per ricoprire le cellule durante l'acquisizione confocale. Successivamente, aggiungere cinque micromolari del colorante nucleare drac cinque al PBS e incubare con le cellule per tre minuti a 37 gradi Celsius. Dopo tre minuti, rimuovere la piastra dall'incubatore e posizionarla sul supporto confocale per l'acquisizione delle immagini, rilevando gli organuli acidi e il nucleo mediante diverse lunghezze d'onda di eccitazione e di emissione come descritto nel protocollo testuale allegato, utilizzando una scansione sequenziale per evitare la raccolta di segnali derivanti dalle lunghezze d'onda di eccitazione. La distribuzione dimensionale dei nanosensori sensibili al pH preparati è stata caratterizzata mediante microscopia elettronica a scansione (SEM), in cui la popolazione di nanosensori analizzati è stata misurata ed è risultata avere dimensioni nell'ordine dei nanometri, comprese tra 240 e 470 nanometri.

A sinistra è mostrata un'immagine di fibre di PLGA ottenute mediante elettrofilatura, mentre a destra sono mostrate fibre di PLGA ottenute mediante elettrofilatura con nanosensori. Le microfotografie al microscopio elettronico a scansione (SEM) delle fibre forniscono evidenza dell'associazione dei nanosensori sulla superficie delle fibre. Tuttavia, essi possono anche essere incorporati all'interno delle fibre della matrice.

Dopo la formazione mediante elettrofilatura, i nanosensori mantengono la capacità di rimanere otticamente e chimicamente attivi e sono qui mostrati associati alle fibre del supporto. A sinistra si trova il colorante fam, mostrato in verde, e a destra il colorante Tamara, mostrato in rosso. Il rapporto tra le intensità fluorescenti produce una curva di calibrazione come mostrato in questo caso.

I nanosensori valutati singolarmente e quando incorporati in scaffold elettrofilati in PLGA si sono comportati in modo simile, dimostrando che i nanosensori mantengono la loro attività ottica dopo l'incorporazione negli scaffold. I nanosensori incorporati rispondono inoltre in modo reversibile ai cambiamenti dei valori di pH quando il tampone viene alternato tra un pH di 5,5 e 7,5. Il rapporto fam Tamra ha risposto in modo prevedibile ogni volta mostrato.

Di seguito sono riportate immagini confocali di fibroblasti a cui sono stati somministrati nanosensori intracellularmente mediante reagente di trasfezione. La colocalizzazione puntiforme dei coloranti fam e Tamara suggerisce che i coloranti siano rimasti intrappolati nella matrice del nanosensore. La somministrazione intracellulare dei nanosensori può essere confermata misurando il rapporto fam/Tamara delle cellule poste in diversi tamponi.

Come è possibile osservare qui, il rapporto aumenta quando si misurano i nanosensori basati su scaffold, ma rimane costante quando si misurano i sensori all'interno delle cellule. Dopo lo sviluppo di questa tecnica, i ricercatori nel campo dell'ingegneria tissutale potranno indagare in situ e in tempo reale le variazioni di pH intracellulare nel microambiente all'interno di costrutti cellulari tridimensionali, senza perturbare l'esperimento in corso.