2.10: Purificazione del gel

La purificazione su gel è una procedura standard eseguita per recuperare i frammenti di DNA desiderati dai gel di agarosio dopo la separazione elettroforetica. Dopo aver sciolto il frammento di gel e averlo fatto passare attraverso un filtro specializzato, questa procedura produce DNA liberato da impurità come sali, nucleotidi liberi ed enzimi, adatto per applicazioni a valle.

Il principio di base alla base del recupero del DNA dal gel di agarosio prevede una sequenza di passaggi di legame, lavaggio ed eluizione. Una volta che il gel è nel tampone solubilizzante, viene applicato su una "colonna di rotazione", ? che, dopo la centrifugazione, consente alle molecole di DNA di legarsi selettivamente a un filtro di silice mentre le impurità fluiscono in una provetta di raccolta.

Il DNA è in grado di legarsi alla silice grazie ad un'elevata concentrazione di sale nel tampone di solubilizzazione del gel. Si ritiene che questo tampone interrompa la struttura di idratazione attorno al filtro e crei un ponte salino cationico tra le forti cariche negative sul filtro e le cariche negative sul DNA. Le impurità residue vengono rimosse mediante lavaggio con etanolo.

L'acqua o il tampone a basso contenuto di sale vengono aggiunti alla colonna e ?eluiranno,? o liberare, il DNA da esso, presumibilmente interrompendo il ponte cationico. Il DNA è ora purificato dal gel.

La prima fase della procedura di purificazione del gel prevede la colata del gel di agarosio e l'esecuzione dell'elettroforesi dei campioni di DNA. Una volta completata la corsa al gel, i frammenti di DNA desiderati vengono visualizzati in base alla luce UV e i frammenti vengono selezionati dopo il confronto con uno standard di peso molecolare.

Se il gel non è colorato, la posizione della banda può essere determinata approssimativamente sulla base di un confronto con la scala del DNA. Mentre si taglia il gel con una lama di rasoio, bisogna fare attenzione a recuperare quanto più DNA possibile con meno agarosio possibile.

Quando si maneggiano gel colorati con bromuro di etidio e si lavora davanti alla luce UV, è necessario utilizzare guanti e occhiali protettivi. Dopo aver tagliato il DNA desiderato dal gel, smaltire correttamente il gel e il tampone di funzionamento, in conformità con i protocolli di sicurezza istituzionali.

Una volta isolato, il pezzo di gel viene posto in una provetta per microfuge e pesato su una bilancia. Usando l'approssimazione che 100 mg di gel occupano 100 l, al pezzo di gel viene aggiunto un volume di tampone di solubilizzazione pari a 4 volte il peso del gel. Dopo essere stato posto in tampone, il pezzo di gel viene incubato a circa 50 C per sciogliere l'agarosio.

Una volta fuso, il gel solubilizzato viene aggiunto su una colonna di centrifugazione e la soluzione viene centrifugata, il che farà sì che tutto il DNA e le altre particelle si attacchino al filtro.

Successivamente, il DNA legato viene lavato aggiungendo etanolo al 70% al filtro, seguito dalla centrifugazione, che rimuoverà le impurità residue dal filtro. Il flusso viene eliminato e questa fase di lavaggio viene generalmente ripetuta fino a tre volte. Il filtro vuoto viene fatto girare di nuovo per rimuovere l'etanolo residuo e il filtro di silice viene lasciato asciugare a temperatura ambiente. Al filtro viene aggiunta acqua o tampone di eluizione e, con un altro ciclo di centrifugazione, il DNA purificato viene raccolto sul fondo della provetta.

Il metodo che hai appena visto si applica alla purificazione su gel con filtri a colonna di centrifuga in silice. Esistono altri metodi che utilizzano gli stessi principi di base del legame del DNA con la silice, seguiti dalle fasi di lavaggio e di eluizione. Ad esempio, la silice può essere mescolata con il DNA in una sospensione chiamata "glassmilk", ? che può essere pellettato e lavato, e successivamente eluito. Inoltre, l'aspirazione può essere utilizzata per estrarre il DNA attraverso filtri di silice e, successivamente, eluirlo. Assicurati di comprendere le procedure di purificazione dei gel del tuo laboratorio.

Ora che hai imparato come recuperare il DNA dai gel di agarosio, esaminiamo alcune applicazioni a valle che utilizzano il DNA ottenuto dalla purificazione del gel.

Ad esempio, la purificazione su gel è una fase intermedia dell'immunoprecipitazione della cromatina, una tecnica che mira a isolare le proteine regolatrici che raggruppano il DNA genomico, al fine di identificare quali sequenze vengono regolate. I frammenti isolati vengono purificati e sequenziati con gel, per essere mappati sulle singole regioni cromosomiche.

Il subclonaggio, il processo di spostamento di un gene da un vettore all'altro, può comportare la purificazione del gel. Ad esempio, le sequenze geniche di un vettore possono essere digerite da un costrutto e assemblate in sequenze chimeriche tramite PCR, dopodiché vengono purificate su gel e inserite in altri costrutti.

Forse l'applicazione più semplice della purificazione in gel è il suo utilizzo dopo una conservazione a lungo termine a -80 ? C di bande di DNA asportate dopo elettroforesi.

Ora hai imparato come estrarre frammenti di DNA dal gel di agarosio, le variazioni delle procedure di legame, lavaggio ed eluizione seguite secondo le preferenze dell'utente individuale e, infine, alcune delle possibili applicazioni a valle di questo metodo. Come sempre, grazie per aver guardato.