Name: Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis /i (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-04T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 53 s
Description: Impara la registrazione intracellulare, la mappatura dei campi sensoriali e la coltura di neuroni identificati in Hirudo medicinalis. Questi metodi elettrofisiologici permettono di studiare i principi neurali fondamentali applicabili ai sistemi nervosi più complessi.

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1. Preparazione di elettrodi e soluzione salina <ol><li> Preparare salina fisiologica e elettrodi prima che l&#39;animale è sezionato. La soluzione di Leech Ringer è costituito dai seguenti: 115,3 mM NaCl, 1,8 mM CaCl 2, KCl 4,0 mM, Tris 10 mM / acido maleico o HEPES. Regolare il pH a 7,4. </li><li> Preparare un filo di Ag-Cl immergendo un filo d&#39;argento pulito in una piccola quantità di candeggina per 20 minuti o fino a quando il filo ha una finitura liscia grigio scuro. Lavare il filo con acqua distillata prima dell&#39;uso. Quindi, posizionare il filo in un supporto micropipetta che si collega l&#39;amplificatore. </li><li> Preparare un elettrodo di vetro tagliente di vetro borosilicato con un estrattore pipetta. La resistenza dell&#39;elettrodo dovrebbe essere dell&#39;ordine di 20 mW. </li><li> Backfill la pipetta con 3 M di acetato di potassio e inserire in nel supporto micropipetta. </li><li> Per un elettrodo extracellulare preparare una pipetta di vetro tagliente come descritto sopra, rompere la punta indietro distrofinando un altro acuto pipetta vicino al bordo tagliente. Poi il fuoco lucidare la punta in modo che non si strappi i connettivi. Elettrodi extracellulari di plastica potranno anche funzionare finché ci sia un buon contatto tra l&#39;elettrodo e il nervo. </li><li> Inserire l&#39;elettrodo extracellulare registrazione in un supporto micropipetta (con filo di Ag-Cl) che è dotato di un tubo di gomma e siringa per aspirazione. Usare la siringa per disegnare salina nel elettrodo almeno al livello del filo d&#39;argento. </li><li> Impostare l&#39;hardware (amplificatore e stimolo isolatore) e parametri di registrazione software seguendo il manuale per l&#39;unità di registrazione segnale specifico. Vedere Leksrisawat et al. 22 per vedere i dettagli sulle apparecchiature utilizzate negli esperimenti descritti di seguito. </li></ol> 2. Ventrale Ganglio Dissection <ol><li> Sezionare la sanguisuga in un grande piatto foderato elastomero di silicone con soluzione di Ringer sanguisuga. Se l&#39;animale è allungata longitudinalmente saràpiù facile rimuovere il cordone nervoso ventrale (vedere Figura 1A). </li><li> Con # 10 o # 11 dimensioni bisturi, fare una incisione longitudinale con tagli molto superficiali nella linea mediana ventrale. Circa la metà 2/3rd del taglio ventrale è mostrato in Figura 1B. Cercate di non tagliare la calza nera (ventrale seno sangue) fino a quando l&#39;animale è completamente aperto e il seno sangue è allungata senza pieghe. Questo sinusale sangue corre lungo l&#39;animale lungo la linea mediana ventrale. Il VNC è contenuto all&#39;interno di questo vaso sanguigno. </li><li> Dopo che la pelle è stata tagliata la lunghezza dell&#39;animale usare le forbici iris fine per nick seno sangue (Figura 2). Infilare una lama delle forbici iris belle sotto il seno e sollevare leggermente la lama per separarlo dal tessuto nervoso. Tagliare il seno la lunghezza del VNC evitando le radici nervose, nervi segmentale, o le connessioni tra gangli. </li><li> Quindi, rimuovere una parte del cordone nervoso ventrale datagliare le radici distali per cui il vaso sanguigno unisce le radici. Ripetere questo processo per ciascun ganglio lungo la lunghezza del cordone nervoso ventrale. </li><li> Trasferire un segmento di uno o due gangli di una piastra di Petri minore. Il gangli o il singolo ganglio deve essere appuntato teso con un certo gioco. </li><li> Pin i connettivi e le radici in modo che la guaina ganglio gliale è leggermente allungato per evitare che i corpi cellulari dei neuroni di muoversi quando impalare attraverso la guaina gliale e nel neurone di interesse. I perni devono essere posizionati attraverso il seno nero per le radici e nel mezzo dei due connettivi per minimizzare i danni degli assoni (Figura 3). </li><li> Porre la capsula Petri con preparato al microscopio e fissarlo con cera sul fondo del piatto per impedire il movimento. </li><li> Concentrarsi attentamente fascio luminoso utilizzando uno specchio e condensatore luce per vedere i neuroni come nella Figura 4A (schematicamente illustrato in Figura 4B </strong&gt;). Notare le due grandi cellule Retzius nel centro del ganglio. </li><li> Per effettuare la registrazione intracellulare del Rz, T, P e N neuroni, posizionare accuratamente la punta dell&#39;elettrodo sopra la cella di interesse e delicatamente abbassare la punta fino una fossetta è visto nella guaina gliale. </li><li> Toccare il titolare elettrodo o manipolatore (con molta attenzione) in modo che la punta dell&#39;elettrodo &quot;pop&quot; nella cella di interesse. </li><li> Iniettare impulsi brevi (30-40 msec) di corrente positiva (1-10 nA) nella cella di evocare potenziali d&#39;azione. </li></ol> 3. Coltura neuroni del ganglio Preparazione ventrale <ol><li> Pin il lato ventrale gangli in un piatto pulito contenente L-15 con siero di vitello fetale (FCS) (Figura 3). Pin le radici in modo che i gangli sono leggermente allungato come fatto in precedenza per le registrazioni intracellulari. Con forbici pregiati, nick capsula gliale ad una estremità, slip una lama forbici sotto la capsula, poi tagliare la capsula glialecome mostrato in figura 5A. </li><li> Aggiungere 100 microlitri aliquota di Collagenase / dispasi al piatto e posto su un agitatore per 15 minuti. Esaminare cellule spostando il terreno di coltura attorno ai corpi cellulari esposte. Ritorno alle cellule di shaker per altri 15 minuti o più a lungo fino a quando le cellule escono con aspirazione minima. </li><li> Utilizzare una pipetta attaccato ad una siringa per estrarre delicatamente le cellule dal ganglio. Fuoco lucidare la punta della pipetta in modo che sia leggermente più grande del diametro del corpo cellulare. Per le cellule Rz in una sanguisuga adulta, il diametro dovrebbe essere di circa 50 micron. </li><li> Preparare una varietà di pipette con diversi diametri senza filamento, questo diminuisce le probabilità di cellule sporgenti all&#39;interno della pipetta. Conservare le pipette in un flacone contenente 80% di etanolo (EtOH) utilizzando un batuffolo di cotone sul fondo per proteggere le punte da scheggiature. Ricordati di lavare il EtOH fuori della pipetta con il mezzo prima aspirazione cellule. </li><li> Dopo il trattamento enzimatico, lavare la-enzima contenente terreno con L-15 (con FCS) 2x. Identificare le cellule di interesse e aspirare lentamente nella pipetta tirando la siringa (Figura 6A). Scarico le cellule aspirati in un altro piatto che contiene L-15 (con FCS). </li><li> Fino ad ora, tutte le procedure erano non-sterile. Effettuare le seguenti operazioni in una cappa sterile. Mettere 3-4 grosse gocce di sterile L-15 (con FCS) in luoghi diversi all&#39;interno di una piastra di Petri sterile. </li><li> Pipettare le cellule in una delle gocce prima citati, soffiando loro intorno nella goccia per lavarli. Ripetere questo in serie in 3 o 4 gocce di mezzo. </li><li> Posizionare cellule in una capsula di Petri pulita riempita con L-15 (con FCS). </li><li> Incubare le cellule per 1-24 ore a temperatura ambiente. Successivamente le cellule pulite possono essere placcati. Lasciando le cellule per poche ore o durante la notte la matrice extracellulare viene via facilmente. Plate subito le celle per generare processi più lunghi. </li><li> Utilizzare substrato sterile per rivestire un micropozzetti di<html> sh e lasciarlo asciugare completamente (durante la notte), prima coltura esperimenti. </li><li> Dopo il piatto è stato rivestito, lavare il piatto delicatamente con acqua sterile e poi con una piccola quantità di mezzo L-15. Ricordarsi di utilizzare la soluzione di L-15 senza FCS memo per consentire alle cellule di aderire al piatto. Il terreno può essere leggermente modificata in L-15 con FCS dopo che le cellule hanno aderito al substrato. Se le cellule devono essere utilizzati poche ore dopo la placcatura, poi passare il mezzo di L-15 con FCS non è necessario. </li><li> Posizionare le cellule accanto all&#39;altro al momento della placcatura di indurre una rapida sinaptogenesi (Figura 6B). Dopo 24 ore provvedimento attività fisiologica in abbinamenti di neuroni. </li><li> Utilizzare tecniche elettrofisiologiche intracellulari di registrare RP o risposte sinaptiche in coppie in coltura di cellule (stimolare 1 neurone attraverso un intracellulari elettrodi e registrare le risposte dal cellulare accoppiato con un secondo elettrodo intracellulare). </li></ol>title &quot;&gt; 4. Ganglion corpo Preparazione parete <ol><li> Pin il lato sanguisuga dorsale verso il basso in un piatto foderato elastomero come descritto sopra. </li><li> Pin la pelle di un lato con radici sull&#39;altro lato del ganglio mozzata (Figura 7A, ingrandita nella Figura 7B) o fare una finestra sulla parte ventrale della sanguisuga su un ganglio (Figura 7C) con tutte le radici al corpo muro intatto. </li><li> Dopo aver ottenuto una registrazione intracellulare stabile in una delle celle sensoriali (T, p, n) utilizzare una piccola bacchetta di vetro che è stato lucidato fuoco a toccare leggermente la pelle nello stesso segmento. Se il neurone che viene registrato è una cella N quindi più pressione dovrà essere applicato sulla pelle. Nella maggior parte dei casi, la cella N risponderà soltanto se la pelle viene pizzicato con le pinzette. Per questo motivo tali cellule dovrebbero essere processati ultimo come si potrebbe danneggiare la pelle o spostare la ricodifica intracellulare disturbando il preparato in un modo. </li><li> Uno dovrebbe esseregrado di delineare rapidamente la pelle e ganglio con dettagli sufficienti che una mappa di dove si toccato può essere utilizzato per determinare il campo recettivo per un particolare neurone. Dopo la registrazione di come molte cellule T e P il più possibile su entrambi i lati di un ganglio provare le cellule N. </li><li> Per esaminare se i neuroni sensoriali hanno processi che viaggiano attraverso i connettivi in ​​modo rostrale o caudale e poi le radici nel segmento adiacente alla pelle, le connessioni tra gangli possono essere tagliati e campi recettivi riesaminati per quanto riguarda la diffusione di rilevamento. In sostanza si sta esaminando se vi è stata alcuna perdita nel settore ricettivo. </li></ol> 5. Iniezione tinture fluorescenti <ol><li> Preparare un ganglio sanguisuga come descritto sopra. </li><li> Riempire un microelettrodo con una soluzione di Lucifero giallo-CH (3,0%) e cloruro di litio (300 mM). </li><li> Infilzare una delle celle o cellule sensoriali Rz sul lato ventrale del ganglio come descrittosopra. </li><li> Iniettare colorante nella cella facendo passare corrente negativa (3na) attraverso l&#39;elettrodo per 15 min. Impostare la durata dell&#39;impulso di 100 msec e la frequenza di 2 Hz. </li><li> Visualizzare i neuroni colorante riempito eccitando il colorante con una lampada al mercurio e un set di filtri FITC / GFP. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Lo scopo di questa serie di esperimenti era 1) per insegnare e esporre i principi fondamentali di registrazioni intracellulari da neuroni identificabili e 2) di riconoscere le forme caratteristiche dei segnali elettrici che possono derivare da questi tipi neuronali particolari utilizzando sanguisughe adulti. C&#39;è una storia ricca di indagini utilizzando la sanguisuga per le indagini neurofisiologiche e la ricerca è in corso per affrontare questioni di circuiti neurali e regolazione genica durante lo sviluppo, così come durante la riparazione e la rigenerazione 10 sinaptica. Neuromodulazione, soprattutto attraverso percorsi di ammine biogene, è stata anche una direzione di ricerca di successo nel sanguisuga. Con l&#39;aggiunta di dopamina e di altri agenti farmacologici per il sistema nervoso attraverso la soluzione salina, è stato dimostrato che la dopamina modula reti neurali coinvolti nel processo decisionale 23 e schemi motori per la scansione comportamento 24,25. Questo approccio sperimentale è un semple (e poco costoso) modo per incorporare la modulazione nel laboratorio didattico, e regolando la composizione ionica della soluzione salina è un modo efficace per insegnare le equazioni di Nernst e di Goldman-Hodgkin-Katz. Per avere successo con i preparativi gangliari è importante avere il ganglio teso prima di tentare di colpire un soma con un elettrodo intracellulare. Altrimenti il ​​soma si sposterà quando si spinge verso il basso sul pacchetto gliali. Inoltre, quando desheathing ganglio della rimozione di neuroni per cultura, evitare la regione di interesse durante il taglio di tutti i ganglio così somas non siano danneggiati mentre sono rimossi. Inoltre, l&#39;eccessiva incubazione nella enzimi può causare neuroni troppo fragile per essere rimosso. Si richiede alcuni tentativi per ottenere un tempo di incubazione ideale perché ogni serie di enzimi è leggermente diverso nelle loro azioni. Ulteriori indagini per ottimizzare cultura dei media potrebbe migliorare questa tecnica. VariDIVERSI fattori, quali la presenza di insulina, zuccheri, o fattori di crescita possono essere esaminati per più il mantenimento di colture. Per determinare se le cellule mantengono la loro capacità di sintetizzare trasmettitori, come la sintesi della serotonina nelle cellule Rz, colorazione rosso neutro può essere applicato per etichettare processi serotoninergici. Invasione della microglia anche tessuto danneggiato e rigenerante può essere quantificato macchie nucleari giorni dopo un infortunio. Anche se questa preparazione ha molti vantaggi da offrire in esame rigenerazione e la riparazione, nonché circuiti neurali, l&#39;identificazione farmacologico e molecolare dei vari sottotipi recettoriali a livello delle sinapsi non sono state pienamente caratterizzato. Una libreria di tag di sequenze espresse è disponibile 26, e la sanguisuga medicinale genoma è attualmente in fase di montaggio 27, ma la limitazione principale sanguisuga rispetto ad alcune preparazioni modello è la possibilità di modificare il genoma di geni selettivi in tipi cellulari specifici. In embrioni tla sua limitazione è stata affrontata mediante iniezione di DNA o dsRNA per regolare l&#39;espressione genica 28. La tecnica di pistola gene è stato recentemente utilizzato per esprimere la connessina invertebrato (innexin) proteine ​​nei neuroni sanguisuga. Espressione di un innexin da Hirudo verbana (Hve-inx6) è sufficiente per la formazione di giunzioni ectopiche nel sanguisuga medicinale 29. Il-sanguisuga o medicinali H. verbena per così dire 30 è sicuro di avanzare la nostra comprensione della fisiologia e l&#39;evoluzione delle sinapsi elettriche nei prossimi anni.

La preparazione sanguisuga è utile per studiare la funzione di identificabile (sensoriali, motori e inter-neuroni all&#39;interno del sistema nervoso centrale dell&#39;animale (CNS). La proprietà utile di neuroni sanguisuga è che la forma dei loro potenziali d&#39;azione e le proprietà biofisiche sono caratteristici di dato tipo di cellula (cioè P, N, T, Rz). neuroni Inoltre possono essere rimossi dall&#39;animale e coltivate in un mezzo adeguato nel quale le cellule mantengono le loro caratteristiche elettriche per finchè 45 giorni 1,2. Un vantaggio del ganglio sanguisuga per imparare a fare registrazioni elettrofisiologiche è che le cellule sono tipicamente disposti in modo affidabile e ganglio in un modello che consente l&#39;identificazione di tipi cellulari distinti dal ganglio ganglio e da un animale all&#39;altro. La posizione unica e la morfologia dei neuroni in gangli sanguisuga sono stati notati da Retzius già nel 1891 3. Conoscenza del secoloe l&#39;identità e la funzione di un neurone è vantaggioso per indagare circuiti neurali e per fare esperimenti con un dato tipo di cellula. A causa della relativamente grande somata dei neuroni all&#39;interno di un ganglio sono visibili con un microscopio da dissezione, e la somata possono essere selettivamente infilzati con microelettrodi per registrare le loro proprietà elettriche. Coloranti e grandi molecole possono essere iniettati nelle cellule individuali e proprietà del canale studiati da patch clamp. Correnti ioniche che danno origine alle varie forme delle caratteristiche potenziali di azione in vari neuroni sono stati individuati 4-7. Dalle indagini nel modello di innervazione e la ramificazione dei neuroni individuali all&#39;interno del sistema nervoso centrale, le connessioni sinaptiche sono state riprodotte in coltura con neuroni identificati 2,8. Studi nei gangli sanguisuga hanno fornito sull&#39;attuale sviluppo di circuiti funzionali che può essere misurata con elettrofisiologia nonché con Whole comportamento animale studi. La sanguisuga CNS ha anche servito come preparazione prezioso per indagare i meccanismi coinvolti con la riparazione e la rigenerazione neuronale in tutto l&#39;animale e nella cultura 4-6,9-12. Nel cervello dei mammiferi si tratta di un compito arduo per spiegare il comportamento in termini di proprietà e collegamenti di singoli neuroni identificati. In linea di principio si può sperare che lo studio dei sistemi meno complessi come la sanguisuga potrebbe contribuire a definire meccanismi di base utilizzati negli animali superiori. Le connessioni che vengono utilizzati che sottendono un modello nuotata 13,14 e ritmicità del cuore 15 sono stati ben caratterizzati nel sanguisuga. La capacità di alcuni neuroni sanguisuga per formare sia la comunicazione elettrica e chimica è intrigante. Alcune connessioni sono bidirezionali, mentre altri sono unidirezionali chimicamente ma bidirezionale elettricamente 7. Comprendere le connessioni sinaptiche all&#39;interno l&#39;animale così come ricreare lo stesso tipe di connessioni in una capsula di Petri sono strumenti potenti per indagare synaptogenesis 16-18 nonché profilazione farmacologico delle sinapsi 19. Le tecniche di registrazione e stimolazione intracellulari qui descritti forniscono una base per test farmacologici e ricerche in neuroetologia e sviluppo. Inoltre, il cordone nervoso ventrale segmentale può essere sezionato con una zona di pelle innervato. Con la capacità di mantenere una zona di pelle e neuroni vivi, campi recettivi sensoriali possono essere sondati registrando segnali elettrici dal corpo cellulare (cioè soma) dei neuroni sensoriali all&#39;interno rispettiva ganglio addominale nel SNC. In tal modo si può valutare la sensibilità delle terminazioni sensoriali applicando vari gradi di forza sulla pelle e mappare i campi recettivi: tocco leggero, pressione e nocivi (doloroso) stimoli 20,21. Un vantaggio di questa sanguisuga preparazione ganglio-pelle è che una can disegnare anatomicamente il campo cartina ricettivo e tracciare i processi neuronali al neurone identificato una volta che le risposte elettriche vengono registrate. I tre esperimenti sanguisuga descritte di seguito possono essere completati più volte con un solo esemplare, che rende questo un modulo didattico conveniente per laboratori accademici.

<table><tbody><tr><td>Sylgard</td><td>Dow Corning</td><td>kit per silicone 182</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5670</td><td></td></tr><tr><td>Tris/acido malico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Candeggina&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Per clorurare il filo d'argento</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>221465</td><td>Per regolare il pH</td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758</td><td>Per regolare il pH</td></tr><tr><td>Collagenasi/Dispasi</td><td>Boehringer Mannheim</td><td>269-638</td><td></td></tr><tr><td>Leibovitz L-15 con L-Glutammina</td><td>Gibco</td><td>041-01415H</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Ready Systems Ag</td><td></td><td></td></tr><tr><td>04-001</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>D-Glucosio-Monoidrato</td><td>Merck</td><td>8342</td><td></td></tr><tr><td>Solfato di gentamicina&amp;nbsp;</td><td>qualsiasi fornitore</td><td></td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td>Glutammina</td><td>Gibco</td><td>043-0503H</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma</td><td>3375</td><td>Acido libero, cristallino</td></tr><tr><td>Concanavalina A Tipo IV</td><td>Sigma</td><td>C 2010</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina Bromidrato</td><td>Sigma</td><td>P 7890</td><td>MW 15-30.000</td></tr><tr><td>&amp;nbsp;Piastra a micropozzetti, 60 x 10 &amp;mu;l</td><td>Falcon</td><td>3034</td><td>Fondo piatto, 10 per confezione</td></tr><tr><td>Strumenti per dissezione</td><td>World Precision Instruments</td><td>assortimento</td><td></td></tr><tr><td>Prova elettrodo intracellulare</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gabbia di Faraday</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spilli per insetti</td><td>Fine Science Tools, Inc</td><td>26001-60</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio stereoscopico (100X)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lampada a fibra ottica</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Specchio regolabile piccolo</td><td></td><td></td><td>Per dirigere il fascio luminoso verso il preparato.</td></tr><tr><td>Elettrodi in vetro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CLS7095B5X</td><td>Confezione da 200, elettrodi a sifone</td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>World Precision Instruments</td><td>MD4-M3-R</td><td>&amp;nbsp;Adattabile alla base o a un’asta metallica</td></tr><tr><td>Supporto rialzato per preparati</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filo d'argento (10/1.000 pollice)</td><td>A-M Systems</td><td>782500</td><td></td></tr><tr><td>Computer</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amplificatore differenziale AC/DC</td><td>A-M Systems</td><td>Modello 3000</td><td></td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td>27T</td><td></td></tr><tr><td>Testa amplificatrice</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td>Fornita insieme all'amplificatore AC/DC</td></tr><tr><td>LabChart7</td><td><a href="http://www.adinstruments.com/" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> AD Instruments</a></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Connettori elettrici</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Strumenti in vetro&amp;nbsp;</td><td>autocostruiti</td><td></td><td>Per manipolare i nervi</td></tr><tr><td>Cavi e connettori</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pipette con pallina&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-711-7</td><td>Confezione da 500</td></tr><tr><td>Beccherini</td><td>qualsiasi azienda</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cera o argilla modellabile</td><td>qualsiasi azienda o negozio locale</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stimolatore</td><td>Grass Instruments</td><td>SD9 o S88</td><td></td></tr><tr><td>Punta in plastica per elettrodo a sifone</td><td>negozio di ferramenta locale (marca Watt&amp;rsquo;s)</td><td>&amp;frac14; pollice di diametro esterno x 0,170 pollici di diametro interno</td><td>Tagliare in piccoli pezzi. Tirare leggermente al calore della fiamma e tagliare la punta alla dimensione corretta.</td></tr></tbody></table>

intracellulare di registrazione, sensoriale campo mapping, e la coltura neuroni identificata nel leech, hirudo medicinalis</i

Intracellular Recording, Sensory Field Mapping, and Culturing Identified Neurons in the Leech, Hirudo medicinalis

La sanguisuga d&#39;acqua dolce, Hirudo medicinalis, è un organismo modello versatile che è stato usato per affrontare le questioni scientifiche nei campi della neurofisiologia, neuroetologia e biologia dello sviluppo. L&#39;obiettivo di questa relazione è quello di consolidare tecniche sperimentali dal sistema sanguisuga in un unico articolo che sarà utile a fisiologi con esperienza in altre preparazioni del sistema nervoso, o agli studenti di biologia con poca o nessuna esperienza di elettrofisiologia. Dimostriamo come sezionare la sanguisuga per la registrazione intracellulare dai circuiti neurali individuate nel ganglio. Successivo mostriamo come cellule individuali di funzione nota possono essere rimossi dal ganglio essere coltivate in una piastra di Petri e come registrare da quei neuroni in coltura. Allora dimostriamo come preparare una zona di pelle innervata da utilizzare per la mappatura campi sensoriali o motorie. Queste preparazioni sanguisuga sono ancora ampiamente utilizzati per affrontare le proprietà elettriche di base di networ neuraleks, il comportamento, sinaptogenesi, e lo sviluppo. Sono anche un modulo di formazione adeguata per le neuroscienze o fisiologia laboratori didattici.

Registrazioni intracellulari da neuroni sensoriali del ganglio sanguisuga si caratterizzano per le loro distinte tracce di tensione-tempo mostrati in figura 4C. Il potenziale di membrana cellulare nelle cellule gangliari sanguisuga sani è -45 a -60 mV. Se potenzialità sono più piccoli (meno negativo) si deve cambiare l&#39;elettrodo di vetro, o se il potenziale è ancora bassa, passare ad un altro segmento del cordone nervoso. Potenziali d&#39;azione spontanei con piccola ampiezza possono indicare che l&#39;elettrodo è in un motoneurone. Se questo accade nella parete ganglio-corpo di iniezione di corrente può essere utilizzata per determinare se il neurone innerva qualsiasi muscoli ancora attaccato alla pelle. Il motoneurone anello erettore (AE) si trova sul lato ventrale del ganglio (Figura 4B) e farà sì che il annuli (creste o segmenti) a salire attivando il muscolo erettore anello. Iniettando corrente nelle cellule sensoriali dovrebbe evocare potenziale d&#39;aziones con le forme d&#39;onda caratteristiche mostrate nella Figura 4C. Se le forme d&#39;onda aspetto diverso potrebbe essere dovuto ad un ponte sbilanciato o risarcimento capacità offset. Si dovrebbe consultare il manuale che accompagna l&#39;unità di acquisizione del segnale per i dettagli su come bilanciare il ponte all&#39;interno di una cella. Notate i manufatti di stimolo all&#39;inizio e alla fine degli impulsi di corrente in figura 4C. In questo modo i manufatti guardare quando il ponte è bilanciato. Colture primarie di neuroni del ganglio sanguisuga formano sinapsi elettriche e chimiche nel piatto. Inizialmente le proprietà elettriche delle cellule coltivate non sono esattamente le stesse come siano in vivo. Tuttavia dopo pochi giorni gli impulsi sono quasi indistinguibili da quelli registrati nel ganglio. Questo è dimostrato in Figura 6C con una coppia di celle Rz. Dopo 7 ore nella cultura l&#39;ampiezza dei potenziali sinaptici era 1-2 mV. Dopo 56 ore di cultura sypotenziali naptic erano più grandi di 10 mV (top tracce nella Figura 6C). La forma del potenziale d&#39;azione cambia anche dopo 56hr in coltura. Nelle condizioni descritte queste cellule sono vitali per diversi giorni. Comunicazione intercellulare può essere dimostrata stimolando le radici nervose o connettivi e registrazione da neuroni nel ganglio. Stimolare questi nervi genera potenziali sinaptici robusti e potenziali di azione in diverse cellule gangliari. Tracce in Figura 8B sono stati registrati da una cella Retzius in un ganglio che era stato rimosso dall&#39;animale e riposto in un piatto. La traccia nera era evocato da uno stimolo sottosoglia applicato con un elettrodo extracellulare al connettivo. Aumentando la tensione di stimolo causato la cella di sparare un potenziale di azione (traccia rossa). Coloranti o perossidasi di rafano fluorescente può essere iniettato queste cellule per studiare la loro morfologia. Lucifero giallo è stato iniettato in un Rzneurone facendo passare una corrente attraverso l&#39;elettrodo negativo. Un&#39;alternativa è quella di iniettare il colorante utilizzando sbuffi di pressione dell&#39;aria. Figura 9A mostra il colorante poco dopo l&#39;inizio della iniezione. Trenta minuti dopo la tintura era già diffuso nelle radici nervose (Figura 9B). Il tipo di colorante dipende dall&#39;applicazione, ad esempio, piccoli coloranti peso molecolare che possono passare attraverso giunzioni gap sono utilizzati per identificare sinapsi elettriche. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. . Ventrale dissezione sanguisuga (A) L&#39;animale è completamente bloccato lato ventrale in un piatto foderato elastomero riempito con soluzione salina sanguisuga (B) A un&#39;incisione poco profonda che attraversa la parte anteriore:. L&#39;asse posteriore è fatta solo lateralmente alla linea mediana per evitare di danneggiare il nervo cavo. Il seno sangue nero (che contens il cordone nervoso ventrale) può essere facilmente visibile. Nota quello ganglio esposto che è bianco rispetto alla guaina. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Dissezione del seno nero. Vaso sanguigno (freccia) deve essere attentamente tagliato su un lato per esporre il cordone nervoso ventrale (doppia freccia). Lasciare segmenti del vaso sanguigno intatti intorno alle radici segmentale per l&#39;uso come maniglia per manipolare il cordone nervoso ventrale durante il trasferimento tra dissezione e piatti registrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3"fo: content-width = &quot;3tra&quot; src = &quot;/ files/ftp_upload/50631/50631fig3.jpg&quot; width = &quot;400px&quot; /&gt; Figura 3. Sezione isolata del cordone nervoso ventrale. Innesto del cordone nervoso ventrale dai frammenti dei vasi sanguigni rimanenti sulle radici segmentale e alle estremità dei connettivi segmentale espone gangli per registrazioni elettrofisiologiche. Un tesa stiramento dei gangli permette di vedere i corpi cellulari identificabili e permetterà una più facile penetrazione della guaina gliali con un elettrodo di vetro tagliente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4. Anatomia cellulare del ganglio sanguisuga. (A) Idealmente le cellule Retzius (R) e di altri organismi a grandi cellule (P-pressure, T-touch, N-nocicettivo, AE-anello erettore) sarà chiaramente visibile se il microscopio e il condensatore di luce siano impostate correttamente. (B) Rappresentazione schematica delle cellule del ganglio. Lievi differenze nella posizione dei somas avverrà in ogni ganglio a causa di come il ganglio è allungata e appuntato tesa. Potenziali (C) Azione registrati dalla soma di questi neuroni sono forme d&#39;onda caratteristici. Questi picchi sono stati evocati iniettando corrente positiva nella cella (impulso quadrato sovrapponendo la tensione in tempo le tracce). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Desheathing ganglio per rimuovere i corpi cellulari individuali. (A) La guaina glialedovrebbe essere attentamente tutto il taglio del ganglio per evitare di danneggiare le cellule di interesse. La linea rossa indica un taglio per evitare di colpire la soma dei neuroni Rz. Apertura della guaina dà gli enzimi digestivi accedere alla matrice del tessuto connettivo. (B) corpi cellulari sani sporgenza fuori del ganglio dopo la guaina gliale è stato aperto. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Coltura neuroni del ganglio sanguisuga. (A) Le cellule vengono aspirati dal ganglio utilizzando una micropipetta e trasferiti in un piatto contenente cultura mediatica. (B) Collocamento più celle uno vicino all&#39;altro aumenterà il tasso di synaptogenesis tra i neuroni identificabili. Qui la stumps di due neuroni hanno formato una sinapsi. (C) I neuroni in coltura mostrano leggermente diverse proprietà elettriche. Le prime tracce mostrano potenziali sinaptici evocati stimolando l&#39;adiacente cella di 7 ore e 56 ore dopo che le cellule sono state placcate. Le tracce peggiori sono stati evocati iniettando corrente direttamente in una delle celle Rz. Si noti l&#39;aumento di ampiezza potenziale sinaptica e cambiare nel potenziale della forma d&#39;onda azione dopo 56 ore di cultura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig7.jpg" width="600px" /> Figura 7. La sanguisuga ganglio-corpo la preparazione della parete per la mappatura campi recettivi. (A) Un approccio è quello di rimuovere un&#39;intera sezione della parete corpo con 1-3 gangli. Qui le radici da un lato hanno btaglio EEN e il ganglio è stato appuntato fuori al lato. (B) Un appuntato su ganglio a più alto ingrandimento. (C) Un altro approccio è quello di creare una piccola finestra nella parete del corpo e registrare dai gangli intatta, mentre la mappatura di un campo recettivo . (DG) Ciascuno dei neuroni sensoriali presenta una caratteristica di risposta ad uno stimolo meccanico. (D) Un tocco leggero evoca l&#39;attività delle cellule T ma non in P o N celle. (E) La risposta delle cellule T chiude in risposta alla forte stimoli, dando modo di attivazione della cellula P. Come lo stimolo diventa più forti le cellule N diventa attivo (FG). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig8.jpg" width="600px" /> Figure 8. evocato attività nel ganglio sanguisuga. stimolazione extracellulare dei connettivi può essere utilizzato per pilotare la trasmissione sinaptica nel cordone nervoso. (A) Questo viene fatto collegando un elettrodo di aspirazione ad uno dei connettivi e applicando una piccola tensione. L&#39;elettrodo di vetro tagliente (freccia) può essere visto impalare una cella Retzius nel ganglio. (B) tracce di tensione-tempo che mostra il manufatto stimolo seguita da un potenziale sinaptico (nero) e un potenziale d&#39;azione (rosso). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig8highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire immagine</a> . <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50631/50631fig9.jpg" width="600px" /> Figura 9. Iniezione di colorante in neuroni di sanguisuga. (A) Lucifero gialla può essere iniettato nel soma facendo passare corrente through il microelettrodo registrazione. Una lampada al mercurio e il filtro FITC insieme possono poi essere utilizzati per visualizzare la fluorescenza. (B) Dye ha diffuso nel Rz assoni circa 30 minuti dopo l&#39;iniezione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50631/50631fig9highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Questo articolo descrive tre preparati sistema nervoso utilizzando sanguisughe: la registrazione intracellulare dai neuroni in gangli ventrale, coltura neuroni dei gangli ventrale, e la registrazione da una zona di pelle innervata per mappare i campi sensoriali.

Intracellulare di registrazione, sensoriale Campo Mapping, e la coltura neuroni identificata nel Leech, Hirudo medicinalis</i

The freshwater leech, Hirudo medicinalis, is a versatile model organism that has been used to address scientific questions in the fields of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è imparare come preparare il ganglio del leech per la registrazione intracellulare da singoli neuroni, come preparare una porzione di pelle per mappare un campo recettivo sensoriale e come coltivare neuroni del leech. Questo viene ottenuto utilizzando prima il ghiaccio per anestetizzare il leech e fissarlo in posizione con il lato ventrale rivolto verso l'alto. Il passo successivo consiste nell'isolare chirurgicamente circa tre gangli separati e distenderli per la registrazione.L'ultimo passaggio consiste nell'impalare i singoli neuroni e registrare i potenziali d'azione. Nel complesso, il comportamento della rete neurale può essere caratterizzato effettuando caratterizzazioni fisiologiche dei vari tipi cellulari in concomitanza con esperimenti. Il vantaggio principale dell'uso di leches rispetto ad altre preparazioni di invertebrati semplici come S slugs o crostacei è che i gangli possiedono poco più di 400 neuroni facilmente accessibili, e questi neuroni possono rimanere attivi in coltura per diversi giorni.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché la preparazione della pelle ed il prelievo di singoli neuroni sono difficili da apprendere. Si potrebbe facilmente danneggiare un ganglio che invade una porzione di pelle o danneggiare i neuroni durante la coltura. Una domanda che potreste naturalmente porvi sentendo che vedrete un filmato e leggerete un testo sul sistema nervoso della sanguisuga è: perché mai qualcuno dovrebbe lavorare sul cervello di un invertebrato quando il cervello umano è così molto più interessante?E se dovessi lavorare su un invertebrato, perché scegliere la sanguisuga, un animale orribile, sanguinolento, che segreta muco ed è disgustoso? Beh, ci sono diverse buone ragioni per farlo. La prima è che la sanguisuga ha un sistema nervoso estremamente semplice rispetto al nostro.E in esso è possibile studiare singole cellule nervose, osservare come sono connesse e comprendere come tali connessioni determinino il comportamento di un animale in un modo che non sarebbe assolutamente possibile in un animale più complesso. Un'altra ragione è che il Leach, introdotto per la prima volta nella neuroscienza nel 1960 da Stephen Koffler, offre opportunità per lo studio di problemi fondamentali, che in realtà sono rilevanti per il modo in cui funziona il nostro cervello. E ci sono molti esempi che potrei citare.Uno di questi è che la maggior parte delle cellule nel cervello, nei nostri cervelli, non sono cellule nervose, ma quelle che vengono chiamate cellule gliali, cellule satelliti, che sono state inizialmente studiate nella sanguisuga; una volta compreso il loro funzionamento in questo organismo, è stato possibile verificare se fossero simili nei nostri stessi cervelli, e lo sono, risultando così importanti anche per molteplici aspetti clinici. Ma il motivo principale per cui si lavora su questo animale, come vedrete nel filmato, è che possiede un sistema nervoso straordinario. Il sistema nervoso è costituito da una catena di gangli, gruppi di cellule nervose, in numero limitato.È possibile osservare tutte le cellule da cui è possibile effettuare registrazioni singolarmente. Si può scoprire come sono connesse, in modo simile allo studio di una mappa della metropolitana di Parigi. Ed è questa bellezza che rende il preparato così affascinante da utilizzare, unita alla possibilità di scoprire alcuni principi fondamentali prima di iniziare la dissezione.Assicurarsi innanzitutto di configurare il software di registrazione e l'elettrodo di registrazione. Prepararsi a dissezionare una sanguisuga in una grande capsula rivestita con elastomero di silicone riempita di soluzione di Ringer utilizzando dei perni. Stendere l'animale con il lato ventrale rivolto verso l'alto usando un bisturi numero 10 o numero 11.Eseguire un'incisione longitudinale con tagli molto superficiali lungo la linea mediana ventrale. Evitare di tagliare il seno ematico ventrale finché l'animale non è completamente aperto e il seno ematico è disteso senza pieghe. Il cordone nervoso ventrale è ora contenuto all'interno.Utilizzare forbici fini a iris per fare un'incisione nel seno venoso, inserendo una lama della forbice sotto il seno e sollevandola leggermente per separare il seno dal tessuto nervoso. Successivamente, tagliare il seno lungo tutta la lunghezza del cordone nervoso ventrale evitando le radici nervose, i nervi segmentali o i connettivi tra i gangli. Poi, rimuovere una parte del cordone nervoso ventrale tagliando le radici a valle del punto in cui il vaso sanguigno si unisce alle radici.Ora trasferisca il ganglio in una capsula pulita riempita con soluzione fisiologica e fissi il preparato ai nervi radicolari e ai connettivi. Utilizzi questo preparato per ottenere registrazioni intracellulari dai corpi cellulari dei neuroni sensoriali. Fissi i gangli con la faccia ventrale rivolta verso l'alto in una capsula pulita contenente L 15.Con FCS fetale, le radici devono essere leggermente allungate con forbici fini. Incidere la capsula gliale a un'estremità, inserire una lama della forbice sotto la capsula e attraversarla. Successivamente, aggiungere 100 microlitri di collagenasi al piatto e porre il piatto su un agitatore per 15 minuti; in seguito, esaminare le cellule muovendo il mezzo di coltura attorno ai corpi cellulari esposti.Riposizionare le cellule sullo shaker per altri 15 minuti o più, fino a quando è possibile prelevarle dal ganglio utilizzando una minima aspirazione con una pipetta a bocca lucidata con diametro interno di circa 50 micron, leggermente superiore al diametro corporeo. Per rilasciare l'ECM delle cellule, aggiungere alcune gocce di mezzo L 15 con FCS alle cellule e incubarle per alcune ore fino a 24 ore a temperatura ambiente. Quando sono pronte, piastrare le cellule una accanto all'altra in una piastra a pozzetti rivestita con substrato.Con mezzo L 15. Non utilizzare FCS. Dopo 24 ore, saranno pronti per l'elettrofisiologia e rimarranno vitali per diversi giorni.Inizialmente, le proprietà elettriche non sono esattamente identiche a quelle di un preparato in vivo. Tuttavia, dopo alcuni giorni, gli impulsi sono quasi indistinguibili. Fissare la sanguisuga con il lato dorsale verso il basso in una piastra rivestita di elastomero, come descritto in precedenza.Successivamente, fissare la pelle da un lato con le radici sull'altro lato del ganglio reciso. In alternativa, creare una finestra sulla faccia ventrale del lembo sopra un ganglio, mantenendo tutte le radici verso la parete corporea integre. Dopo aver ottenuto una registrazione intracellulare stabile in una delle cellule sensoriali, utilizzare una piccola bacchetta leggermente arrotondata alla fiamma per toccare delicatamente la pelle nello stesso segmento con le cellule t e p.Il semplice contatto con la pelle genererà una risposta elettrica. Nel caso delle cellule di tipo end, sarà necessaria una pressione maggiore da parte della bacchetta, e nella maggior parte dei casi una cellula end risponderà soltanto se la pelle viene pizzicata con una pinzetta. Pertanto, per ridurre al minimo il potenziale danno ai tessuti, registrare per ultime le cellule di tipo N al fine di determinare se i neuroni esaminati presentano prolungamenti in determinate localizzazioni.I connettivi tra i gangli possono essere recisi e i campi recettivi possono essere riesaminati per eventuali perdite. Le registrazioni intracellulari dai neuroni sensoriali nel ganglio della sanguisuga si caratterizzano per i loro tracciati temporali distinti. Il loro potenziale di riposo è compreso tra -45 e -60 millivolt.Se la misurazione è inferiore, si dovrebbe utilizzare una nuova sonda di vetro o una nuova preparazione. Potenziali d'azione spontanei con una piccola ampiezza indicano che la cellula potrebbe essere un neurone motorio. Nella preparazione della parete corporea del ganglio, un'iniezione di corrente può essere utilizzata per determinare se il neurone innerva eventuali muscoli ancora attaccati.Ad esempio, il neurone motore dell'annulus erector sul lato ventrale del ganglio provoca l'elevazione dell'occhio ann. Se dopo l'iniezione di corrente si osserva un'onda anomala, ciò potrebbe essere dovuto a un bilanciamento inadeguato del ponte o a una compensazione insufficiente della capacità parassita. Quando il ponte è bilanciato, gli artefatti di stimolo sono visibili all'inizio e alla fine degli impulsi di corrente dopo sette ore.In coltura primaria, le misurazioni sono state effettuate su una coppia di cellule retiali. L'ampiezza dei potenziali sinaptici era di circa uno-due millivolt. Dopo 56 ore in coltura, i potenziali sinaptici erano superiori a 10 millivolt.La forma del potenziale d'azione è cambiata anche. Nella stessa preparazione, sono state stimolate le radici nervose o i connettivi. Il tracciato nero è stato evocato da uno stimolo sub-liminare applicato con un elettrodo extracellulare al connettivo.Il tracciato rosso mostra come l'aumento della tensione dello stimolo abbia indotto la cellula a generare un potenziale d'azione. È stata effettuata un'iniezione di giallo di Lucifera in una cellula retinica passando una corrente negativa attraverso l'elettrodo. Poco dopo l'iniezione, il colorante è rimasto localizzato nel soma.Mezz'ora dopo, il colorante si era già diffuso nelle radici nervose dopo il suo sviluppo. Questa tecnica aiuta i ricercatori nel campo della neurobiologia a esplorare il meccanismo alla base della forma dei potenziali d'azione e a indagare ulteriormente la circolarità neuronale. Inoltre, favorisce la comprensione della rigenerazione e della riparazione nei neuroni identificabili.Questo video illustra una serie di tecniche sperimentali. L'utilizzo del leach potrebbe essere applicato alla sinaptogenesi, alla neuromodulazione o ad aspetti fondamentali della neurofisiologia.

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