La stampa termosensibile Stampi inversa per la Creazione di Patterned idrogeli a due componenti per coltura cellulare 3D

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di stampare uno stampo inverso per creare idrogel bicomponenti modellati per colture cellulari 3D. Ciò si ottiene stampando prima uno stampo inverso da un polimero termoreversibile, che è un liquido a quattro gradi Celsius, ma un gel morbido a temperatura ambiente. Questo stampo inverso può essere successivamente eluso.

Il secondo passo consiste nel riempire lo stampo inverso con un biopolimero a scelta. Qui abbiamo usato aros. Il biopolimero può essere reticolato mediante reticolazione enzimatica, UV o termica.

Successivamente, lo stampo inverso è El alluso immergendo lo stampo in acqua fredda. Dopo questo passaggio, lo stampo AROS risultante è pronto per ulteriori lavorazioni. Il passaggio finale consiste nel riempire i vuoti con un secondo biopolimero, che potrebbe contenere cellule e può essere reticolato per mezzo di enzimi, luce UV o temperatura.

In definitiva, abbiamo stabilito un metodo riproducibile per creare scaffold di coltura cellulare organizzati spazialmente in D. Abbiamo avuto l'idea di questo metodo per la prima volta quando un collega ci ha suggerito di sfruttare le proprietà termoreattive dell'Oxr utilizzandolo come stampo sacrificale. A dimostrare la procedura sarà Misha Muah, uno studente laureato del mio laboratorio.

Per iniziare, aggiungere 60 millilitri di soluzione di PBS ghiacciata in una bottiglia di vetro e mescolare energicamente con un mescolatore magnetico. Quindi pesare 24,5 grammi di Paul ER e aggiungerlo in piccole quantità al PBS freddo. Attendi che il Paul Oxr si sia parzialmente dissolto nel PBS prima di aggiungerne altro.

Continuare ad agitare la soluzione fino a quando tutto Paul Oxr non si sarà sciolto. Successivamente, aggiungere altro PBS ghiacciato fino a raggiungere un volume finale di 100 millilitri, producendo una concentrazione finale del 24,5% in peso per volume. Quindi mescola il composto fino a quando non è ben amalgamato.

Smetti di mescolare la soluzione e lasciala riposare a quattro gradi Celsius durante la notte fino a quando le bolle e la schiuma nella soluzione non saranno scomparse. Le bolle intrappolate all'interno del gel vengono trasferite alla cartuccia della stampante e porteranno a difetti negli stampi sacrificali stampati. Sterile Filtrare la soluzione direttamente nella cartuccia di stampa utilizzando un filtro di pre-raffreddamento per rimuovere eventuali particelle indesiderate che potrebbero ostruire l'ago.

Conservare la cartuccia a quattro gradi Celsius fino a 30 minuti prima dell'esperimento. Preparare l'elettrovalvola e l'ago per la stampa mettendoli in provette separate da microcentrifuga da 1,5 millilitri riempite con acqua ultrapura e sindacandoli per 30 minuti. Quindi sciacquare le valvole pulite con etanolo e asciugarle con una pistola ad azoto.

Quindi, installare l'elettrovalvola e l'ago puliti nella stampante. Inoltre, installare una cartuccia di stampa vuota e pulita per testare il sistema. Applicare una pressione di tre bar al sistema ed espellere eventuali liquidi residui dalla valvola installata e dallo spillo con aria compressa.

Per aghi di piccolo diametro. Installare un filtro all'uscita dell'aria compressa per evitare l'ingresso di piccole particelle che potrebbero ostruire l'ago. Quindi disattivare la pressione.

Quando la pressione è scesa a zero, installare la cartuccia precaricata con il poly oxr. La cartuccia deve essere tolta dal frigorifero circa 30 minuti prima di montare la cartuccia in modo che il poly oxr ancora liquido possa raggiungere la temperatura ambiente e il gel prima della stampa. Controllare se il poly oxr è gelificato capovolgendo la cartuccia.

Quindi, applicare tre bar di pressione al sistema ed erogare Paul Emer fino a raggiungere la punta dell'ago e viene estruso in un filo continuo. Utilizzando il software bio CAD, disegnare una singola linea della stessa lunghezza della struttura che si intende stampare nel menu delle impostazioni del software della stampante. Impostare l'elettrovalvola a una frequenza elevata di 50 hertz nella sezione dei parametri e regolare manualmente l'impostazione dell'alta pressione su tre bar.

Quindi, posiziona un microscopio di vetro, fai scorrere la stampante e fissala in posizione accendendo l'aspirapolvere. Quindi stampa uno strato di una singola linea con una velocità del tavolino di 300 millimetri al minuto. Ottenere la larghezza di linea desiderata riducendo manualmente la pressione e le impostazioni di frequenza nel software per ogni nuova linea, assicurarsi che la linea rimanga continua.

Se la linea tracciata è spezzata, il limite inferiore è stato raggiunto. Una volta raggiunta una linea continua con la larghezza desiderata, determinare la velocità ottimale del tavolino e lo spessore dello strato verificando la presenza di difetti nei costrutti stampati. Per regolare con precisione lo spessore dello strato, potrebbe essere necessario regolare leggermente la pressione e la frequenza.

Per testare l'impostazione dello spessore dello strato, stampa diversi strati uno sopra l'altro e assicurati che l'ago sia nella posizione corretta sopra lo strato precedente. Regolare lo spessore dello strato in modo che ogni strato venga stampato direttamente sopra il precedente. Per ottimizzare la velocità del palco, iniziare diminuendo la velocità del palco da 300 millimetri al minuto in modo graduale, in modo che gli strati estrusi inizino e finiscano nelle stesse posizioni dei precedenti.

Se lo stage si muove troppo velocemente, sulla parte superiore del livello viene visualizzato un pattern ondulato. Per la stampa di strutture di pilastri, disegnare un singolo punto invece di una linea nel software CAD. Quindi regolare con precisione la pressione e la frequenza per regolare lo spessore dello strato e il diametro del pilastro e il tempo di passaggio della testina di stampa per massimizzare la velocità di stampa.

Una volta ottimizzati, salvare i parametri per un uso successivo. Per prima cosa, stampate la struttura interna, come questa matrice di pilastri, su un vetrino da microscopio e lasciatela asciugare. L'essiccazione notturna riduce le dimensioni e lo spessore delle strutture e fornisce una migliore adesione tra la struttura e il substrato.

Il giorno successivo, disegna una struttura che consiste in un muro esterno che circonda le strutture che intendi far eludere e riempire. La parete del polimero deve essere stampata ad almeno 3,5 millimetri di distanza dalle strutture interne a causa delle dimensioni dell'ago. Successivamente, preparare una miscela di aros all'1% in acqua deionizzata riscaldandola nel microonde una volta completamente sciolta.

Raffreddare la soluzione agro a una temperatura compresa tra 35 e 45 gradi Celsius. Quindi riempire lo stampo sacrificale con la soluzione agro utilizzando una pipetta. Questo dovrebbe essere fatto lentamente per evitare la distruzione della struttura all'interno del muro.

Una volta riempito, posizionare lo stampo a quattro gradi Celsius per solidificare il gel. Dopo circa 10 minuti, togliete il gel dal frigo e mettetelo in un bagno di ghiaccio per 10 minuti per eluire la struttura polimerica. Quindi rimuovere con cura la struttura e rimuovere l'acqua residua tamponandola con un fazzoletto di carta.

Premere con cautela la struttura su un nuovo vetrino da microscopio in vetro per creare una buona tenuta che impedisca la fuoriuscita del terzo idrogel. Successivamente, preparare una soluzione all'1% di alginato metacrilato in cloruro di sodio 0,15 molari. Agitare la soluzione per sciogliere l'alginato metacrilato.

Quindi aggiungi il 2,5% di volume a volume. Alexa, 4 88 fibrinogeno coniugato e 0,05% in peso per volume. Litio fenil 2 4 6 trimetilbenzoilfosfato per ottenere un terzo idrogel che può essere facilmente visualizzato tramite fluorescenza.

Inserire questa soluzione in una siringa da 0,3 millilitri dotata di un ago calibro 30. Quindi utilizzare la siringa per riempire i vuoti lasciati dal polimero eluso. Assicurati di riempire completamente ogni colonna espellendo il polimero mentre l'ago viene estratto da ogni colonna.

Infine, fotopolimerizzare il polimero iniettato con una lampada UV ad alta intensità per cinque minuti, quindi visualizzare il costrutto utilizzando un microscopio a epifluorescenza o confocale. Qui è mostrata una ricostruzione 3D di Zack di un costrutto simile a quello che è stato appena fabbricato, l'alginato marcato in fluorescenza utilizzato per il riempimento. Le forme dei pilastri appaiono come colonne verdi e la parte esterna del costrutto è trasparente.

Le tecniche mostrate in questo video sono ampiamente adattabili a molte diverse disposizioni 3D, come i cerchi concentrici mostrati qui. La risoluzione dipende dal diametro dell'ago. L'ago da 150 micron di diametro utilizzato per questo design può produrre filamenti di diametro compreso tra 120 e 200 micron.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione dei passaggi necessari per la stampa di oxr. Abbiamo dimostrato l'uso dell'oxr come stampo sacrificale per creare idrogel di modelli, ma l'oxr può anche essere stabilizzato ai raggi UV se viene utilizzata una versione del polimero correlata alla produzione.