Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura
14 settembre 2015
Il tracciamento transsinaptico è diventato un potente strumento per analizzare gli efferenti centrali che regolano i bersagli periferici attraverso circuiti multisinaptici. Qui presentiamo un protocollo che sfrutta il virus della pseudorabbia transsinaptica per identificare e localizzare un circuito cerebrale funzionale, seguito da tecniche classiche di tracciamento del tratto per convalidare connessioni specifiche nel circuito tra gruppi di neuroni identificati.
L'obiettivo generale di questa procedura è scoprire la rete premotoria centrale di cellule distribuite che incidono su uno specifico bersaglio periferico e quindi confermare le connessioni specifiche tra quelle cellule nel cervello. Ciò si ottiene infettando per la prima volta i circuiti premotori con un vettore virale transsinaptico che viene consegnato perifericamente attraverso il muscolo. Il secondo passo della procedura consiste nel visualizzare le cellule infette con la microscopia a fluorescenza ottica.
Il terzo passo consiste nel confermare connessioni specifiche nel cervello iniettando traccianti sinaptici monos mirati a nodi precedentemente identificati in un circuito pre-motorio. In definitiva, i risultati possono mostrare come le cellule in una rete pre-motoria distribuita siano collegate tra loro attraverso una combinazione di tracciamento virale transsinaptico e tecniche neuroanatomiche monosinaptiche tradizionali. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come il tradizionale neuro tracing sinaptico monos, è che i nodi di una rete neurologica distribuita possono essere identificati e le connessioni specifiche tra le cellule in quella rete possono essere risolte su un topo anestetizzato.
Preparare il sito chirurgico tagliando i peli e disinfettando la pelle con almeno tre scrub alternati di Betadine e alcol al 70%. Ora fai un'incisione cutanea nella zona della gola e rivela il muscolo di interesse. Ad esempio, per accedere al muscolo laringeo cricotiroideo, è necessario prima rimuovere la parte sovrastante del muscolo ioide sternico sigillare tutti i muscoli sezionati con adesivo tissutale vet bond.
Successivamente, caricare il sistema di micro siringhe nano fill da 10 microlitri con la soluzione PR RV appena scongelata. Eliminare lentamente lo spazio morto e verificare che la soluzione esca dalla punta della micro siringa. Smaltire il fluido come rifiuto a rischio biologico e montarlo con cura sul dispositivo stereotassico.
Utilizzando il dispositivo di microposizionamento, posizionare con cautela la punta dell'ago nel muscolo di interesse. Quindi riempire lentamente il muscolo fino a quando non è visibile un leggero gonfiore. Ora sposta la siringa sul muscolo successivo di interesse, il cricoaritenoide laterale in questo caso e ripeti.
La procedura di iniezione perfora solo ogni muscolo. Una volta che la velocità di iniezione varierà a seconda delle dimensioni del muscolo e del volume da iniettare. Ad esempio, cinque iniezioni di 200 nanolitri a una velocità di quattro nanolitri al secondo dovrebbero essere effettuate a distanza di un minuto nello stesso sito per riempire il muscolo cricotiroideo.
Dopo aver ritirato la micro siringa, sigillare la rottura nella fascia utilizzando l'adesivo per tessuti vet bond. Una volta terminate tutte le iniezioni, chiudere la ferita utilizzando l'adesivo per tessuti vet bond. Monitorare l'animale fino a quando non mostra la posizione sdraiata sternale.
Quindi fornisci analgesia, cibo, acqua e cure come richiesto dal tuo animale istituzionale. Utilizzare le linee guida. La procedura per analizzare l'espressione di EGFP e i neuroni infetti da PRV è trattata in dettaglio nel protocollo di testo.
Il processamento dei tessuti è molto simile a quello trattato più avanti in questo video. Inizia anestetizzando un topo adulto proteggendo i suoi occhi e fissando la posizione della sua testa. Preparare quindi il sito chirurgico come descritto in precedenza con scrub alternati di Betadine e alcool al 70%.
Ora fai un'incisione del cuoio capelluto e ritrai il cuoio capelluto sopra il cervello. Regione di interesse. Eseguire una piccola craniotomia con il trapano alle coordinate stereotassiche appropriate.
Ad esempio, le coordinate per la corteccia motoria laringea connessa identificate dal tracciamento PRV in un topo adulto sono 1,2 millimetri lateralmente e 0,2 millimetri rostrali rispetto al bgma. Successivamente, preparare una soluzione al 7,5% di destrano biotinilato in acqua sterile. Quindi caricare il sistema di micropipette nano jet two con una quantità sufficiente di soluzione BDA per le iniezioni pianificate.
Eliminare lentamente lo spazio morto e verificare che la soluzione stia uscendo dal puntale della micropipetta. Utilizzando il dispositivo di microposizionamento, abbassare con cautela la punta della micropipetta nella regione cerebrale di interesse e iniettare lentamente la soluzione di BDA. Regolare la velocità in base alle dimensioni della regione da etichettare.
Ad esempio, 12 iniezioni di 4,6 nanolitri dovrebbero essere effettuate in quattro punti diversi. A 0,2 millimetri di distanza. Coccola stro per coprire la corteccia motoria collegata alla laringe in un topo adulto.
Il volume finale di iniezione deve essere regolato in base alle dimensioni della regione di interesse. Tenendo presente che l'etichetta può diffondersi dal nucleo dell'iniezione attraverso il tessuto cerebrale e lungo i processi dei neuroni marcati. Pulire e bagnare la craniotomia con soluzione fisiologica sterile e chiudere la ferita del cuoio capelluto utilizzando l'adesivo tissutale veterinario.
Monitorare l'animale fino a quando non mostra la posizione sdraiata sternale. Quindi fornisci analgesia, cibo, acqua e cure come richiesto dal tuo animale istituzionale. Utilizzare le linee guida.
Sei giorni dopo, la subunità B della tossina del colera può essere iniettata nel muscolo dell'animale. Quindi, in tre giorni, l'animale dovrebbe essere sacrificato per l'analisi. Tagliare le sezioni a 40 micron su un criostato e salvare le sezioni galleggianti in PBS 0,1 molare, spegnere le sezioni con perossido di idrogeno allo 0,3% in PBS per 30 minuti con agitazione e al riparo dalla luce.
Lavare le sezioni tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio. Quindi farli reagire per un'ora in una soluzione di A b, C appena preparata a temperatura ambiente. Ora lavare le sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 minuti per lavaggio.
Quindi sviluppare le sezioni per otto minuti con agitazione in tampone fosfato. pH 7,4 contenente DAB, perossido di idrogeno e cloruro di nichel. Il prodotto di reazione DAB all'interno delle celle dovrebbe apparire nero.
Successivamente, bloccare le sezioni agitando per 30 minuti in PBS contenente lo 0,3% di interpolazione 20 con il normale siero di coniglio del kit Vector Stain Elite. Successivamente, incubare le sezioni bloccate in capra anti CTB agitando per due ore a temperatura ambiente. Quindi lavare le sezioni altre tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio.
Applicare l'anticorpo secondario rabbit antigo del kit VE e incubare le sezioni agitando per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte in PBS per cinque minuti per lavaggio e poi farle reagire per 30 minuti in una soluzione A, b, C appena preparata a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 minuti e incubare le sezioni per otto minuti.
Nella soluzione di sviluppo, il prodotto di reazione DAB all'interno delle cellule dovrebbe apparire marrone. Montare ora le sezioni su super frost più vetrini sui vetrini, disidratare il tessuto attraverso serie di alcol graduato, seguite da due lavaggi di chiarificazione in xilene. Quindi slittare i vetrini con paramount e procedere con l'imaging.
La colorazione per EGFP dovrebbe iniziare a mostrare un segnale debole nei motoneuroni primari 72 ore dopo l'iniezione di P RV 1 52 con una colorazione che diventa robusta dopo 90 ore. Questo nucleo ambiguo, che ospita i motoneuroni laringei, è visibile 94 ore dopo l'iniezione di P RV 1 52 in due dei sette muscoli laringei. Perché il virus è entrato nel cervello attraverso i neuroni che innervano i muscoli infetti.
Altri pool di motoneuroni atori, come il nucleo ipoglosso, non esprimono EGFP dopo 90 ore. L'EGFP può essere visto nelle cellule di secondo ordine. Questi neuroni del tronco encefalico sono stati colorati in seguito all'infezione primaria nel nucleo ambiguo.
L'iniezione è stata unilaterale e il modello risultante di etichetta nel tronco encefalico mostra un'infezione del nucleo omolaterale. Anche gli interneuroni reticolari del nucleo ambiguo e solitario sono stati infettati e si colorano fortemente per l'EGFP. Questi interneuroni collegano varie strutture, tra cui i pool di motoneuroni atori e il nucleo controlaterale. Ambiguo.
Tuttavia, i loro bersagli efferenti rimangono non etichettati perché il virus si diffonde solo in direzione retrograda. Il tempo di sopravvivenza con PRV è limitato, ma può mostrare una colorazione dell'EGFP nelle cellule di terzo ordine e nei neuroni premotori infettati nella corteccia motoria che esprimevano EGFP controlaterale al sito periferico di iniezione. Presumibilmente solo la popolazione di cellule che componeva la rappresentazione corticale motoria della muscolatura laringea era infetta.
Gli assoni marcati con BDA a livello del nucleo ambiguo contrassegnato da punte di freccia, entrano in contatto con i motoneuroni CTB positivi marcati retrogradamente da iniezioni nei muscoli laringei visti in marrone gli assoni formano varici e putativi bastoni terminali vicino ai dendriti dei motoneuroni laringei e vicino al soma dei motoneuroni laringei. Sono necessari ulteriori esperimenti con la microscopia elettronica o l'elettrofisiologia per determinare se queste varicosità rappresentano sinaptiche. Un'iniezione bilaterale di BDA collocata nella corteccia motoria laringea collegata è visibile in nero perché il BDA non è direzionalmente specifico, sia le connessioni afferenti che efferenti possono essere etichettate.
Ad esempio, nel talamo si osservano sia un campo di proiezione dell'etichetta anterograda che corpi cellulari marcati in modo retrogrado. Le cellule talamiche sono identificate dalla punta della freccia e la capsula interna è etichettata per l'orientamento. Non dimenticare che lavorare con lo pseudo virus della rabbia e il DAB può essere estremamente pericoloso e precauzioni come la sterilizzazione.
Tutti i materiali che sono stati a contatto con PRV o DAB utilizzando una soluzione di candeggina al 10%. Durante l'esecuzione di questa procedura è necessario adottare sempre uno smaltimento appropriato dei rifiuti solidi e liquidi a rischio biologico secondo le normative del proprio istituto.
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Panoramica
Questo articolo presenta un protocollo per l'analisi di efferenze centrali che regolano bersagli periferici attraverso circuiti multisinaptici, utilizzando il tracciamento transsinaptico. Il metodo impiega un virus della rabbia pseudorabbia transsinaptico per identificare e localizzare i circuiti cerebrali, seguito da tecniche classiche di tracciamento dei tragitti per la validazione.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Neuroanatomia
- Tecniche di tracciamento virale
Sfondo
- Il tracciamento transsinaptico è uno strumento potente per la mappatura dei circuiti neurali.
- L'uso di vettori virali consente l'identificazione di reti neurali distribuite.
- Le tecniche classiche di tracciamento dei tragitti forniscono la validazione delle connessioni.
- Questo metodo migliora la comprensione delle reti premotorie e dei loro bersagli periferici.
Scopo dello studio
- Scoprire la rete premotoria centrale di cellule che innervano aree periferiche specifiche.
- Confermare connessioni specifiche tra neuroni identificati nel cervello.
- Utilizzare una combinazione di tracciamento virale e tecniche tradizionali per una mappatura completa.
Metodi Utilizzati
- Infezione retrograda di circuiti premotori mediante un vettore virale transsinaptico.
- Visualizzazione delle cellule infette mediante microscopia fluorescente in luce.
- Iniezione di traccianti monosinaptici per confermare le connessioni nel cervello.
- Analisi della connettività all'interno di una rete premotoria distribuita.
Risultati principali
- Identificazione dei nodi nella rete premotoria.
- Visualizzazione di connessioni specifiche tra neuroni.
- Dimostrazione dei vantaggi del tracciamento transsinaptico rispetto ai metodi tradizionali.
- Informazioni sull'organizzazione dei circuiti premotori che influenzano i bersagli periferici.
Conclusioni
- Il protocollo mappa efficacemente circuiti neurali complessi.
- Il tracciamento transsinaptico fornisce una comprensione più chiara della connettività neuronale.
- Questo approccio può essere applicato a vari studi sulle reti neurali.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
Questo protocollo consente ai ricercatori del settore biofarmaceutico di mappare reti premotorie distribuite che regolano bersagli periferici, supportando la validazione dei bersagli nella scoperta di neuroterapie. Combinando il tracciamento virale transsinaptico con la marcatura neuroanatomica classica, questo approccio migliora la riduzione del rischio meccanicistica delle ipotesi sui circuiti centrali che influenzano la fisiologia periferica. Il metodo aumenta la fiducia predittiva nelle fasi iniziali della scoperta, risolvendo la connettività sinaptica all'interno di reti funzionalmente definite.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Indaga ipotesi terapeutiche identificando i neuroni premotori centrali collegati sinapticamente ai siti effettori periferici.
- Valore operativo: Consente la validazione funzionale delle target attraverso tracciamento retrogrado transsinaptico da siti di iniezione muscolare periferica.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio chiarificando l'organizzazione gerarchica delle reti neurali distribuite che modulano la fisiologia periferica.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Prepara popolazioni neuronali validate per analisi successive di composti che influenzano la modulazione dei circuiti centrale-periferici.
- Valore operativo: Standardizza l'etichettatura specifica per connessione mediante doppia marcatura con BDA e CTb, migliorando la riproducibilità tra esperimenti.
- Scalabilità: Consente il riutilizzo della piattaforma per la mappatura di multipli bersagli periferici utilizzando flussi di lavoro di tracciamento identici.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la mappatura dei circuiti a stadio di scoperta alla validazione preclinica confermando le connessioni monosinaptiche tra i nodi premotori identificati e le relative destinazioni periferiche.
- De-risking Meccanicistico: Riduce l'ambiguità nei modelli dei circuiti centrali chiarificando se i neuroni marcati formano connessioni dirette o indirette con gli effettori periferici.
- Rilevanza per le Malattie: Supporta gli studi sui disturbi neuromuscolari, sulla disregolazione del sistema autonomo e sulle patologie del controllo motorio in cui l'integrità del circuito centrale-periferico è fondamentale.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dall'Early Discovery attraverso l'Identificazione del Lead fino alla validazione Preclinica, consentendo un affinamento iterativo di target nei circuiti centrali che modulano la fisiologia periferica.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi identificando reti premotorie distribuite mediante tracciamento virale transsinaptico retrogrado da siti periferici.
- Screening: Permette la preparazione del saggio attraverso un'etichettatura standardizzata e quantitativa delle connessioni sinaptiche utilizzando BDA e CTb con rilevamento DAB.
- Analisi: Genera letture multiplex (eGFP, BDA, CTb) che consentono l'analisi comparativa della forza e specificità delle connessioni in diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Collega i risultati del tracciamento virale alla continuità preclinica validando i collegamenti monosinaptici tra neuroni centrali e bersagli periferici.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità riutilizzabile per la mappatura di circuiti centro-periferici in diversi modelli di malattia e campagne di validazione di bersagli.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nella validazione dell'obiettivo riducendo l'ambiguità meccanicistica nelle relazioni tra circuiti centrali ed effettori periferici.
- Valore operativo: Migliora la standardizzazione e la riproducibilità attraverso la validazione con doppia etichettatura delle connessioni tracciate transsinapticamente.
- Valore strategico: Migliora le decisioni di avanzamento o interruzione progettuale fornendo una risoluzione a livello di circuito che riduce i rischi associati alle strategie di intervento su bersagli centrali.
- Impatto sul portafoglio: Consente la priorizzazione dei bersagli corretta in base al rischio, sulla base della forza e specificità della connettività centrale-periferica confermata.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze specifiche in neuroscienze virali, chirurgia stereotassica e tecniche di tracciamento neuroanatomico.
- Dipende da infrastrutture di biosicurezza per la manipolazione del PRV152 e delle chimiche di rilevamento pericolose a base di DAB.
- Necessita di protocolli standardizzati di perfusione, sezionamento e immunohistochimica tra diversi laboratori per ottenere risultati riproducibili.
- Comporta considerazioni di adattamento quando si estende a modelli non rodentici a causa delle limitazioni dell'ospite da parte del PRV.
- I limiti pratici includono i vincoli relativi al tempo di sopravvivenza con il PRV e la possibile marcatura aspecifica derivante dalla diffusione del BDA lungo i processi neuronali.
