Name: Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-14T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 12 s
Description: Scopri il tracciamento transsinaptico con virus pseudorabbia per mappare circuiti neurali premotori che regolano bersagli periferici. Questo metodo combina tecniche virali e tradizionali per identificare connessioni neuronali specifiche nel cervello.

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Ringraziamo il Dott Toshio Terashima di Università di Kobe, in Giappone, per l&#39;insegnamento della tecnica di chirurgia laringea, e il dottor Lynn Enquist della Princeton University per la fornitura di PRV-Bartha. La ricerca è stata sostenuta da premio pioniere NIH DP1 OD000448 Erich D. Jarvis e un premio NSF Graduate Research Fellowship a Gustavo Arriaga. Le cifre precedente lavoro opportunamente accreditati sono utilizzati sotto la PLoS ONE accesso aperto licenza Creative Commons (CC-BY) in accordo con le politiche editoriali della rivista.

NOTA: Tutte le procedure sugli animali sono stati esaminati e approvati dal Istituzionale Cura e uso di animali Comitato Duke University. 1. Memorizzazione Pseudorabies Virus <ol><li> Otteniamo virus vivo (PRV152) dal laboratorio del Dr. Lynn Enquist alla Princeton University in un titolo di 1 x 10 9 pfu / m. Il protocollo per generare il virus è stato pubblicato 2. </li><li> Aliquota il virus a 20 ml per tubo all&#39;interno di un armadietto BSL-2 biosicurezza e conservare a -80 ° C in adeguate condizioni di biosicurezza. </li><li> Scongelare una aliquota di PRV immediatamente prima di iniettare. </li></ol> 2. Preparazione chirurgica per iniezioni nel muscolo <ol><li> Un&#39;anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano. </li><li> Proteggere le cornee con un unguento oftalmico. </li><li> Preparare tegli sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito chirurgico con alternanza di macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli). Assicurarsi di utilizzare teli sterili per coprire aree chirurgiche. Assicurati di rispettare tecniche sterili durante tutta la procedura. </li><li> Fare un incisione cutanea e rivelare il muscolo di interesse. Ad esempio, per accedere al muscolo laringea cricotiroidea è necessario prima rimuovere la parte sovrastante del muscolo sternoioideo. </li><li> Sigillare eventuali muscoli sezionati con adesivo tessuto Vetbond. </li></ol> 3. Iniezione di PRV in muscolare <ol><li> Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con una soluzione PRV appena scongelato, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e montare con cautela sul dispositivo stereotassico. </li><li> Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione esce dalla punta microsiringa. Smaltire come rifiuto liquido bioharzard. </li><li> Utilizzando un microP stereotassicadispositivo ositioning posizionare con cura la punta microsiringa nel muscolo di interesse e lentamente riempire il muscolo fino a leggero gonfiore è visibile. La velocità di iniezione varierà a seconda della dimensione del muscolo e del volume da iniettare. Ad esempio, cinque iniezioni di 200 nl (1 ml totale) ad una velocità di 4 nl / sec devono essere effettuate 1 min a parte nello stesso sito per riempire il muscolo cricotiroideo. Spostare la siringa al prossimo muscolo di interesse (il cricoarytenoid laterale in questo caso) e ripetere la procedura di iniezione. Solo puntura ogni muscolo una volta. </li><li> Ritrarre la microsiringa dopo cinque minuti. </li><li> Sigillare la pausa nella fascia con adesivo tessuto Vetbond. </li><li> Dopo che tutte le iniezioni sono state completate, chiudere la ferita con adesivo tessuto Vetbond. A seconda delle linee guida locali institional uso animale, suture o clip ferita può essere utilizzato. </li><li> Monitorare l&#39;animale fino decubito sternale e fornire l&#39;analgesia, cibo, acqua, e la cura come richiesto da yle nostre linee guida sull&#39;uso degli animali istituzionali. </li><li> Dopo il tempo di sopravvivenza determinato sperimentalmente (in questo caso, 90 hr etichettare 2 ° ordine dei neuroni corticali), sacrificare l&#39;animale da sovradosaggio pentobarbital e nei profumi transcardially con soluzione fisiologica 0,9% seguita da 4% di formaldeide in PBS 0,1 M. </li><li> Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore. </li><li> Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore. </li></ol> 4. immunochimica Rilevamento di eGFP <ol><li> Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo a slitta e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS. Sezioni più sottili, ad esempio 30 micron, possono essere utilizzate quando colorazione sezioni montate. </li><li> Placare le sezioni per 30 min a 0,3% H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce. </li><li> Bloccare antigeni non specifici nelle sezioni per 30 min in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di capra dal Kit Vectastain Elite (VE kit). </li><li&gt; Incubare bloccato sezioni per 3,5 ore in coniglio anti-eGFP (1: 1.000) a temperatura ambiente. </li><li> Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di capra anti-coniglio dalla VE kit a RT. </li><li> Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC dal VE kit a RT. </li><li> Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) e 0,015% H 2 O 2. </li><li> Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno). </li><li> Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount. </li><li> Immagine sezioni montati su un microscopio. Il prodotto di reazione DAB inside le cellule dovrebbero apparire marrone. Immagini digitalizzate possono essere colore invertito per evidenziare i processi sottili. </li></ol> 5. Preparazione chirurgica per iniezione di traccianti in regioni cerebrali Scoperto da PRV Tracing <ol><li> Un&#39;anestesia generale per iniezione intramuscolare di ketamina-xilazina (100 mg / kg ketamina; 10 mg / kg xilazina) e mantenere un piano anestetico appropriato utilizzando isofluorano. </li><li> Proteggere le cornee con un unguento oftalmico. </li><li> Fissare la testa in un telaio stereotassico appropriata. </li><li> Preparare il sito chirurgico secondo la tecnica asettica da taglio capelli e disinfezione del sito con alternanza macchie di Betadine e il 70% di alcol (almeno 3 cicli). </li><li> Effettuare una incisione del cuoio capelluto e ritrarre la pelle sopra la regione del cervello di interesse. </li><li> Eseguire una piccola craniotomia alle opportune coordinate stereotassica. Ad esempio, le coordinate per corteccia motoria laryngeally collegato individuato da PRV tracciando in unn topo adulto sono 1,2 millimetri laterale e 0,2 mm rostrale a Bregma. </li></ol> 6. L&#39;iniezione di Biotinylated Destrano ammine in Cervello <ol><li> Preparare 7,5% ammine destrano biotinilati (BDA) sciogliendo 25 mg di BDA (10.000 MW) in 333 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Caricare il sistema micropipetta Nanoject II con la soluzione BDA sufficiente per le iniezioni pianificate. </li><li> Lentamente liberare lo spazio morto e verificare che la soluzione sta per uscire dal punta micropipetta. </li><li> Utilizzando un dispositivo microposizionamento stereotassico abbassare con attenzione la punta micropipetta nella regione del cervello di interesse e iniettare lentamente BDA. Regolare la velocità di iniezione in funzione della dimensione della regione da etichettare. Ad esempio, 12 iniezioni di 4,6 nl dovrebbero essere fatto in quattro sedi diverse 0,2 millimetri a parte (rostro-caudale direzione) per coprire la corteccia motoria laryngeally collegato in topi adulti. Il volume di iniezione finale dovrebbe essere regolata in base alle dimensioni della regione del cervello di interesse, Tenendo presente che l&#39;etichetta può diffondersi dal nucleo di iniezione per diffusione attraverso i tessuti cerebrali e lungo i processi di neuroni marcati. </li><li> Sigillare la craniotomia con cemento dentale, e chiudere la ferita del cuoio capelluto con adesivo tessuto Vetbond. </li><li> Monitorare l&#39;animale fino decubito sternale e fornire l&#39;analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull&#39;uso degli animali istituzionali. </li></ol> 7. L&#39;iniezione di tossina colerica subunità b in muscolare <ol><li> Preparare 1% tossina colerica subunità b (CTB) sciogliendo 1 mg di CTB in 100 ml di soluzione fisiologica sterile. </li><li> Sei giorni dopo l&#39;iniezione BDA nel cervello, eseguire la preparazione chirurgica come descritto sopra per iniezioni PRV nel muscolo. </li><li> Caricare il 10 microlitri sistema Microsiringa NanoFil con la soluzione CTB, inserire un ago in acciaio inossidabile 34 G, e con attenzione montare sul dispositivo stereotassico. </li><li> Eseguire le microiniezioni nel muscolo (s) di interesse come precedentemente dedescritto per PRV. </li><li> Monitorare l&#39;animale fino decubito sternale e fornire l&#39;analgesia, cibo, acqua, e alle cure richieste dalle vostre linee guida sull&#39;uso degli animali istituzionali. </li><li> Tre giorni dopo l&#39;iniezione CTB, sacrifica l&#39;animale per overdose pentobarbital e profumato transcardiaca con soluzione fisiologica 0,9% seguito dal 4% di formaldeide in 0,1 M PBS. </li><li> Rimuovere e post-fissare il cervello in 4% di formaldeide per 24 ore. </li><li> Cryoprotect cervello in tampone fosfato contenente il 30% di saccarosio per almeno 48 ore. </li></ol> 8. Individuazione di BDA e CTB nelle stesse sezioni <ol><li> Tagliare sezioni a 40 micron su un microtomo e salvare sezioni galleggianti in 0.1M PBS. </li><li> Placare le sezioni per 30 min a 0,3% H 2 O 2 in PBS al riparo dalla luce. </li><li> Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 1 ora in soluzione ABC a RT. </li&gt; <li> Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare per 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina), 0,015% H 2 O 2, e 0,05% di cloruro di nichel. Il prodotto di reazione DAB all&#39;interno delle cellule dovrebbe apparire nero. </li><li> Sezioni di blocco per 30 minuti in PBS contenente 0,3% Tween 20 con siero normale di coniglio dal Kit Vectastain Elite. </li><li> Incubare bloccato sezioni per 2 ore in capra anti-CTB (1: 10.000) a temperatura ambiente. </li><li> Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi incubare per 1 ora in anticorpo secondario di coniglio anti-capra dalla VE kit a RT. </li><li> Preparare la soluzione ABC dal VE kit secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Lavare sezioni tre volte in PBS per 5 minuti, poi reagire per 30 min in soluzione ABC a RT. </li><li> Lavare sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 min, e sviluppare fino a 8 min in tampone fosfato, pH 7,4, contenente lo 0,05% DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidine) e 0,015% H 2 O 2. Il prodotto di reazione DAB all&#39;interno delle cellule dovrebbe apparire marrone. </li><li> Montare sezioni su vetrini SuperFrost Plus e li disidratano attraverso una serie graduata alcol (70%, 95%, 100% e 100% per 5 minuti ciascuno). </li><li> Cancellare sezioni attraverso due lavaggi xilene (5 min ciascuno) e applicare il coprioggetto i vetrini con mezzo di montaggio Permount. </li><li> Immagine sezioni montati su un microscopio. </li></ol>

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Nessun conflitto di interessi dichiarato.

Ci sono una serie di questioni che devono essere presi in considerazione al momento di pianificare un esperimento utilizzando PRV152 4,21. Ancora più importante, il virus della pseudorabbia è letale. Come accennato in precedenza, le grandi scimmie, inclusi gli esseri umani non sono suscettibili alle infezioni, ma cure appropriate devono essere esercitati per proteggere gli altri animali. Topi adulti in genere sopravvivono cinque a sette giorni dopo l&#39;inoculazione con il ceppo PRV152 attenuato. Pertanto, P...

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello dei roditori utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV), in particolare il ceppo attenuato PRV-Bartha descritta per la prima nel 1961 12. Qui, vi presentiamo un protocollo per l&#39;identificazione della rappresentazione corticale motore dei muscoli specifici o gruppi muscolari con un ceppo virale pseudorabbia ricombinanti (PRV152) che esprime la proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter 2. Il metodo descritto sfrutta il comportamento dei virus neurotropi, che producono progenie infettiva che sinapsi trasversali ad infettare altri neuroni all&#39;interno di un circuito funzionale 3,4,13. PRV152, che è isogenic con PRV-Bartha, attraversa solo sinapsi retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 3,5 &lt;/ sup&gt;. Controllando il proprio sito periferico di infezione è possibile limitare l&#39;ingresso del virus nel cervello attraverso uno specifico sottoinsieme di neuroni motori. Come sequenzialmente virus infetta catene di neuroni collegati, il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello si risolverà la rete di neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Un ulteriore vantaggio di utilizzare virus per tracciamento neurale è l&#39;amplificazione della proteina reporter (eGFP in questo caso) all&#39;interno delle cellule infette. Questa amplificazione del segnale fornisce un livello di sensibilità che consente di rilevare anche proiezioni sparse. Ad esempio, una proiezione sparse dalla corteccia motoria vibrissa ai motoneuroni facciali che controllano i baffi è stato trovato in ratti utilizzando viralmente espresso proteina fluorescente verde 14; studi precedenti non sono riusciti a trovare questo proiezione utilizzando traccianti classici senza giornalista amplificazione del gene 11,15. purtroppo, Molti vettori virali tracing, come quello usato nello studio citato, non attraversano sinapsi, limitando così il loro uso per tracciare i circuiti multi-sinaptici. Pur presentando notevoli vantaggi per identificare la rete di cellule che partecipano a un circuito del motore, la natura distribuita transsynaptic tracciare con PRV-152 rende interpretazione collegamenti specifici all&#39;interno del circuito difficile. Pertanto, vi presentiamo un metodo semplice per la convalida collegamenti specifici all&#39;interno dei circuiti identificate utilizzando PRV-152 per doppia etichettatura con ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB). L&#39;uso combinato di BDA e CTB è un approccio consolidato per tracciare le connessioni tra specifici gruppi di neuroni 6-8,11. Quando usati insieme, queste due rivelatori possono essere visualizzati nella stessa sezione con un DAB due colori (3, 3&#39;-diaminobenzidina) Procedura 16. Alto peso molecolare BDA (BDA10kDa) è stato scelto per questo protocollo perché yields etichettatura dettagliata dei processi neuronali 6,7,9. Ulteriori vantaggi BDA10kDa includono quanto segue: è preferenzialmente trasportato nella direzione anterograda 6-8; può essere trasportato da iontoforetica o pressione di iniezione 6-8; può essere visualizzato da un semplice avidina-HRP biotinilato (ABC) Procedura 17; e può essere ripreso dalla luce o microscopia elettronica 6,7,18. Rilevazione immunochimica di CTB con perossidasi e DAB è stato scelto per l&#39;etichettatura retrograda dei motoneuroni, perché è efficace nel rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 10,19. Recentemente abbiamo usato questo approccio per identificare il percorso del motore vocale nei topi e per rivelare un collegamento sparse da corteccia motoria primaria per i motoneuroni laringei, che in precedenza era assume siano assenti 20.

<table><tbody><tr><td>Nome del reagente/materiale</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Commenti</td></tr><tr><td>Sistema di microiniezione NanoFil</td><td>World Precision Instruments</td><td>IO-Kit</td><td>34 G</td></tr><tr><td>opzione Telaio stereotassico</td><td>David Kopf Instruments</td><td>Modello 900</td><td></td></tr><tr><td>Iniettore di nanolitri automatico Nanoject II</td><td>Drummond Scientific Company</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>Microtomo scorrevole</td><td>Leica</td><td>SM2010 R</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">[header]</td></tr><tr><td>VetBond</td><td>3M</td><td>1469SB</td><td></td></tr><tr><td>Isofluorane (Forane)</td><td>Baxter&nbsp;</td><td></td><td></td>1001936060</tr><tr><td>Betadine Swab Stick Cardinal</td><td>Health</td><td>2130-01</td><td>200 conteggi</td></tr><tr><td>Permount Mounting Medium</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP15-500</td><td></td></tr><tr><td>SuperFrost Plus vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Destrano biotinilato ammine</td><td>Invitrogen</td><td>D-1956</td><td>10.000 MW</td></tr><tr><td>Virus della pseudorabbia</td><td>Laboratorio del Dr. Lynn Enquist (Università di Princeton)</td><td>PRV152</td><td>Titolo >1 x 107</td></tr><tr><td>Anti-subunità della tossina del colera B (capra)</td><td>Elenco dei laboratori biologici</td><td>703</td><td></td></tr><tr><td>Elenco delle subunità della tossina del colera B</td><td>Laboratori biologici</td><td>103B</td><td></td></tr><tr><td>Anti-eGFP</td><td>Open Biosystems</td><td>ABS4528</td><td></td></tr><tr><td>3, 3'-diaminobenzidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D5905</td><td>Compresse da 10 mg</td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td>200 proof</td></tr><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td>Diluire al 4%</td></tr><tr><td>Perossido di idrogeno</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3410</td><td>30%</td></tr><tr><td>Ketamina HCl & Xilazina HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K4138</td><td>80 mg/ml e 6 mg/ml</td></tr><tr><td>Cloruro di nichel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>339350</td><td></td></tr><tr><td>Tampone fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3619</td><td>1.0 M; pH 7.4</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P5493</td><td>10x; pH 7.4</td></tr><tr><td>Pentobarbital sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3761</td><td>50 mg/ml dose</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9378</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P1379</td><td></td></tr><tr><td>Xileni</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>534056</td><td>Grado istologico</td></tr><tr><td>VECTASTAIN Elite ABC Kit</td><td>Vector Laboratories</td><td>PK-6101 (coniglio); PK-6105 (capra)</td><td></td></tr><tr><td>Unguento oftalmico Optixcare</td><td>Vet Depot</td><td>1017992</td><td></td></tr></tbody></table>

transsynaptic tracing da obiettivi periferiche con pseudorabies virus seguito da tossina colerica e biotinilato dextran ammine doppia etichettatura

Transsynaptic Tracing from Peripheral Targets with Pseudorabies Virus Followed by Cholera Toxin and Biotinylated Dextran Amines Double Labeling

Tracing Transsynaptic è diventato un potente strumento utilizzato per analizzare efferenze centrali che regolano obiettivi periferici attraverso circuiti multi-sinaptici. Questo approccio è stato più ampiamente utilizzato nel cervello utilizzando virus pseudorabbia patogeno suina (PRV) 1. PRV non infetta grandi scimmie, inclusi gli esseri umani, per cui è più comunemente usato negli studi di piccoli mammiferi, in particolare roditori. Il PRV152 pseudorabbia ceppo esprime la maggiore proteina fluorescente verde (eGFP) gene reporter e attraversa solo sinapsi funzionali retrograda attraverso la sequenza gerarchica delle connessioni sinaptiche di distanza dal sito di infezione 2,3. Altri ceppi PRV sono distinte proprietà microbiologiche e possono essere trasportati in entrambe le direzioni (PRV-Becker e PRV-Kaplan) 4,5. Questo protocollo si occuperà esclusivamente di PRV152. Fornendo il virus in un sito periferico, come i muscoli, è possibile limitare l&#39;ingresso del virus in tha cervello attraverso un insieme specifico di neuroni. Il modello risultante segnale di eGFP in tutto il cervello quindi risolve i neuroni che sono collegati alle cellule infette inizialmente. Come la natura distribuita del tracciato transsynaptic con virus pseudorabbia fa interpretare i collegamenti specifici all&#39;interno di una rete identificata difficile, vi presentiamo un metodo sensibile e affidabile utilizzando ammine biotinilate destrano (BDA) e tossina del colera subunità b (CTB) per confermare le connessioni tra le cellule identificate utilizzando PRV152. Rilevazione immunochimica di BDA e CTB con perossidasi e DAB (3, 3&#39;-diaminobenzidina) è stato scelto perché sono efficaci a rivelare i processi cellulari tra cui dendriti distali 6-11.

Colorazione per eGFP dovrebbe cominciare mostrando segnale debole in neuroni motori primari di circa 72 ore dopo l&#39;iniezione PRV152 nel muscolo. La replica e il trasporto transsynaptic del virus sono titer- e dipendenti dal tempo 4. Circa 90 ore dopo l&#39;iniezione, eGFP colorazione rivelerà segnale più forte nelle cellule infettate ordine 2 nd. Tempi di sopravvivenza più lunghi rivelerà 3 ° e cellule di ordine superiore, ma i tempi di sopravvivenza sono limitati dalla letalità di P...

Il tracciamento transsinaptico è diventato un potente strumento per analizzare gli efferenti centrali che regolano i bersagli periferici attraverso circuiti multisinaptici. Qui presentiamo un protocollo che sfrutta il virus della pseudorabbia transsinaptica per identificare e localizzare un circuito cerebrale funzionale, seguito da tecniche classiche di tracciamento del tratto per convalidare connessioni specifiche nel circuito tra gruppi di neuroni identificati.

Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura

Transsynaptic tracing has become a powerful tool used to analyze central efferents that regulate peripheral targets through multi-synaptic circuits. This ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare la rete premotoria centrale composta da cellule distribuite che si connettono a un particolare bersaglio periferico e successivamente confermare le connessioni specifiche tra queste cellule nel cervello. Questo risultato si ottiene innanzitutto infettando retrogradamente i circuiti premotori con un vettore virale transsinaptico somministrato per via periferica attraverso il muscolo. Il secondo passaggio della procedura consiste nel visualizzare le cellule infette mediante microscopia fluorescente a luce. Il terzo passaggio consiste nel confermare le connessioni specifiche nel cervello iniettando traccianti monosinaptici mirati ai nodi precedentemente identificati in un circuito premotorio. In definitiva, i risultati possono mostrare come le cellule di una rete premotoria distribuita siano connesse tra loro attraverso una combinazione di tracciamento virale transsinaptico e tecniche neuroanatomiche tradizionali monosinaptiche. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come il tracciamento neuroanatomico monosinaptico tradizionale, è che i nodi di una rete neurale distribuita possono essere identificati e le connessioni specifiche tra le cellule di quella rete possono essere risolte in un topo anestetizzato.Preparare il sito chirurgico tagliando i peli e disinfettando la pelle con almeno tre passaggi alternati di Betadine e alcol al 70%. Effettuare ora un'incisione cutanea nella zona della gola ed esporre il muscolo di interesse. Ad esempio, per accedere al muscolo cricotiroideo laringeo, è necessario prima rimuovere la porzione sovrastante del muscolo sternoioideo, sigillando con colla tissutale Vet Bond eventuali muscoli sezionati.Successivamente, caricare il sistema di microsiringa nano fill da 10 microlitri con soluzione PR RV appena scongelata. Rimuovere lentamente lo spazio morto e verificare che la soluzione fuoriesca dalla punta della microsiringa. Smaltire il liquido come rifiuto biologico pericoloso e montare con attenzione la microsiringa sul dispositivo stereotassico.Utilizzando il dispositivo di micro-posizionamento, posizionare con attenzione la punta dell'ago nel muscolo di interesse. Successivamente, riempire lentamente il muscolo fino a quando non si osserva un lieve gonfiore. Spostare ora la siringa sul muscolo successivo di interesse, in questo caso il cricoaritenoideo laterale, e ripetere l'operazione.La procedura di iniezione perfora soltanto ciascun muscolo. La velocità di iniezione varierà a seconda delle dimensioni del muscolo e del volume da iniettare. Ad esempio, cinque iniezioni di 200 nanolitri a una velocità di quattro nanolitri al secondo devono essere effettuate a distanza di un minuto l'una dall'altra nello stesso sito per riempire il muscolo cricotiroideo.Dopo aver ritirato la siringa microscopica, sigillare la rottura nella fascia utilizzando l'adesivo tissutale vet bond. Una volta terminate tutte le iniezioni, chiudere la ferita utilizzando l'adesivo tissutale vet bond. Monitorare l'animale fino a quando non mostra decubito sternale.Quindi somministrare analgesia, cibo, acqua e cure secondo le linee guida del comitato istituzionale per la cura degli animali. La procedura per l'analisi dell'espressione di EGFP e dei neuroni infettati da PRV è descritta in dettaglio nel protocollo testuale.La lavorazione del tessuto è molto simile a quella illustrata successivamente in questo video. Iniziare anestetizzando un topo adulto, proteggendone gli occhi e fissando la posizione della testa. Quindi preparare il sito chirurgico come descritto in precedenza, eseguendo alternativamente lavaggi con Betadine e alcol al 70%.Ora effettuare un'incisione del cuoio capelluto e retrarre il cuoio capelluto sulla scatola cranica. Regione di interesse. Eseguire una piccola craniotomia con il trapano alle coordinate stereotassiche appropriate.Ad esempio, le coordinate per la corteccia motoria connessa alla laringe identificate mediante tracciamento con PRV in un topo adulto sono di 1,2 millimetri in senso laterale e di 0,2 millimetri in senso rostrale rispetto al bgma. Successivamente, preparare una soluzione al 7,5% di ammine di destrano biotinilata in acqua sterile. Quindi, caricare il sistema di micropipette NanoJet Two con una quantità sufficiente di soluzione BDA per le iniezioni previste.Eliminare lentamente lo spazio morto e verificare che la soluzione stia uscendo dalla punta della micropipetta. Utilizzando il dispositivo di posizionamento microscopico, abbassare con attenzione la punta della micropipetta nella regione cerebrale di interesse e iniettare lentamente la soluzione di BDA. Regolare la velocità in base alle dimensioni della regione da marcare.Ad esempio, devono essere effettuate 12 iniezioni di 4,6 nanolitri in quattro posizioni diverse, distanti 0,2 millimetri l'una dall'altra, per coprire la corteccia motoria connessa al laringeo in un topo adulto.Il volume finale dell'iniezione deve essere regolato in base alle dimensioni della regione di interesse. Si tenga presente che l'etichetta può diffondere dal punto di iniezione attraverso il tessuto cerebrale e lungo i prolungamenti dei neuroni marcati. Pulire e inumidire la craniotomia con soluzione salina sterile e chiudere la ferita del cuoio capelluto utilizzando l'adesivo tissutale vet bond.Monitorare l'animale fino a quando non mostra decubito sternale. Successivamente, somministrare analgesia, cibo, acqua e le cure richieste dalle linee guida del vostro ente per la cura degli animali.Sei giorni dopo, la subunità B della tossina colerica può essere iniettata nel muscolo dell'animale. Quindi, dopo tre giorni, l'animale deve essere sacrificato per l'analisi. Tagliare sezioni di 40 micron al criostato e conservare le sezioni galleggianti in PBS 0,1 molare. Spegnere le sezioni con perossido di idrogeno al 0,3% in PBS per 30 minuti sotto agitazione e al riparo dalla luce.Lavare le sezioni tre volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio. Quindi farle reagire per un'ora in soluzione A b, C appena preparata a temperatura ambiente. Lavare ora le sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 minuti per ogni lavaggio.Sviluppare quindi le sezioni per otto minuti con agitazione in tampone fosfato, pH 7,4, contenente perossido di idrogeno DAB e cloruro di nichel. Il prodotto della reazione DAB all'interno delle cellule deve apparire nero.Successivamente, bloccare le sezioni agitando per 30 minuti in PBS contenente 0,3% di tween 20 con siero di coniglio normale proveniente dal kit Vector Stain Elite. Successivamente, incubare le sezioni bloccate con anticorpo caprino anti-CTB agitando per due ore a temperatura ambiente. Quindi, lavare le sezioni altre tre volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio.Applicare l'anticorpo secondario anticoniglio del kit VE e incubare le sezioni sotto agitazione per un'ora a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte in PBS per cinque minuti per ogni lavaggio, quindi farle reagire per 30 minuti in soluzione A, b, C appena preparata a temperatura ambiente. Lavare le sezioni tre volte in tampone fosfato per 10 minuti e incubarle per otto minuti.Nella soluzione di sviluppo, il prodotto della reazione DAB all'interno delle cellule deve apparire marrone. Ora montare le sezioni su vetrini super frosts plus, disidratare il tessuto mediante una serie alcolica progressiva, seguita da due lavaggi di chiarificazione in xilene. Quindi coprire i vetrini con paramount ed eseguire l'acquisizione delle immagini.La colorazione per EGFP dovrebbe iniziare a mostrare un segnale debole nei neuroni motori primari 72 ore dopo l'iniezione di P RV 1 52, con la colorazione che diventa intensa dopo 90 ore. Questo nucleo ambiguo, che ospita i neuroni motori laringei, è visibile 94 ore dopo l'iniezione di P RV 1 52 in due dei sette muscoli laringei. Poiché il virus è entrato nel cervello attraverso neuroni che innervano i muscoli infetti.Altri gruppi di motoneuroni come il nucleo ipoglosso non esprimono EGFP dopo 90 ore. L'EGFP può essere osservato nelle cellule del secondo ordine. Questi neuroni del tronco encefalico sono stati colorati successivamente all'infezione primaria nel nucleo ambiguo.L'iniezione è stata unilaterale e il modello risultante di marcatura nel tronco encefalico mostra un'infezione del nucleo controlaterale. Anche i neuroni intercalati del nucleo ambiguo e del nucleo del tratto solitario erano infetti e mostravano una marcatura intensa per EGFP. Questi neuroni intercalati collegano diverse strutture, tra cui i pool di motoneuroni somatici e il nucleo ambiguo controlaterale.Tuttavia, le loro proiezioni efferenti rimangono non marcate poiché il virus si diffonde solo in direzione retrograda. Il tempo di sopravvivenza con il PRV è limitato, ma può mostrare una colorazione EGFP in cellule di terzo ordine e di ordine superiore. I neuroni premotori infetti nella corteccia motoria esprimevano EGFP controlateralmente al sito di iniezione periferica. Presumibilmente, solo la popolazione di cellule che costituiva la rappresentazione corticale motoria della muscolatura laringea era stata infettata.Axoni marcati con BDA a livello del nucleo ambiguo, indicato dalle frecce, entrano in contatto con i motoneuroni positivi al CTB, marcati retrogradamente mediante iniezioni nei muscoli laringei (visibili in marrone); gli assoni formano varicosità e presunti bastoncelli terminali vicino alle dendriti dei motoneuroni laringei e in prossimità del soma dei motoneuroni laringei. Sono necessari ulteriori esperimenti mediante microscopia elettronica o elettrofisiologia per determinare se tali varicosità rappresentino sinapsi. Un'iniezione bilaterale di BDA effettuata nella corteccia motoria connessa alla laringe è visibile in nero; poiché il BDA non è direzionalmente specifico, possono essere marcate sia le connessioni afferenti che quelle efferenti.Ad esempio, sia un campo di proiezione con marcatura anterograda sia corpi cellulari marcati retrogradamente sono visibili nel talamo. Le cellule talamiche sono identificate dalla freccia e la capsula interna è marcata per orientamento. Non dimenticare che lavorare con il virus della rabbia pseudorabbia e DAB può essere estremamente pericoloso e richiede precauzioni come la sterilizzazione.Tutti i materiali che sono stati a contatto con PRV o DAB devono essere trattati con una soluzione di candeggina al 10%. È sempre necessario adottare un'idonea gestione dello smaltimento dei rifiuti solidi e liquidi a rischio biologico, in conformità con le normative della propria istituzione, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Viral Tracciamento di geneticamente definito circuiti neurali

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Condizionale genetica Transsynaptic Tracing nel cervello embrionali di topo

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Simultanea a due fotoni<em&gt; In Vivo</em&gt; Imaging di Synaptic ingressi e degli obiettivi postsinaptici nella corteccia mouse retrosplenial

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Ricostruzioni su larga scala e indipendente, imparziale Clustering Sulla base morfologici metrica per classificare i neuroni in selettivi Popolazioni

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Migliorare l'applicazione di alto peso molecolare del dextrano Biotinylated ammina per proiezione Thalamocortical traccia nel ratto

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Scopri il tracciamento transsinaptico con virus pseudorabbia per mappare circuiti neurali premotori che regolano bersagli periferici. Questo metodo combina tecniche virali e tradizionali per identificare connessioni neuronali specifiche nel cervello.

Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura (Video) | JoVE Journal

Transsynaptic Tracing da obiettivi periferiche con Pseudorabies virus seguito da tossina colerica e Biotinilato Dextran ammine doppia etichettatura

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