Name: Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-19T14:10:00.000+00:00
Duration: 13 min 33 s
Description: Impara il protocollo Infinium per la genotipizzazione su larga scala di milioni di SNP in centinaia di campioni di DNA. Questo metodo facilita gli studi di associazione alle malattie con risultati affidabili.

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Il finanziamento per questo lavoro è stato fornito dal NIH P20 GM103456, NIH RC2 AR058959, e NIH R56 AI063274

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Gli autori di questo articolo non hanno concorrenti interessi finanziari da dichiarare.

Sono state utilizzate applicazioni di genotipizzazione su larga scala per comprendere meglio il meccanismo genetico alla base di molte malattie umane. La scoperta di una variante significativa attraverso un&#39;analisi di associazione genome-wide in grado di contrassegnare una regione candidato per ulteriori studi. Inoltre, i dati genotipo è un buon strumento per il controllo di qualità su progetti di sequenziamento. Per ottimizzare la velocità di campionamento, più lastre di esempio possono essere amplificati e conservati nei loro frammentati, stati risospeso. Otto piastre possono essere amplificati in un solo giorno, combinando la prima 24 ore di protocollo per più lotti e di fornire materiale sufficiente per ~ 2-8 giorni di chip di elaborazione. Se le piastre amplificati sono stoccate in anticipo, e se i nuovi campioni sono ibridate al chip subito dopo la scansione comincia in fuga precedente, trasformazione possono funzionare in continuo senza la necessità di una pausa per la preparazione del campione aggiuntivo. Pertanto, anche se i campioni avranno tre giorni per sottoporsi alla completasaggio, i dati possono essere generati giornalmente. Chip Assuming24 sono trattati ogni giorno, una settimana lavorativa di cinque giorni consente da oltre 1.000 campioni di DNA da eseguire su un chip tallone 12 campioni. Se un passaggio o reagente è venuto meno, tuttavia, più batch potrebbero essere a rischio per scarso rendimento prima di qualsiasi correzione può essere applicata. Gli errori possono sfuggire avviso fino a quando gli array sono scansionati o analizzati, pertanto, se la velocità è massimizzata, centinaia di campioni in varie fasi del protocollo potrebbero essere già ricevuto lo stesso trattamento difettoso al momento della scoperta. Come reagenti e dati persi non possono essere recuperati, l&#39;utente deve soppesare i rischi contro la necessità di un flusso di lavoro accelerato. Il software di analisi GenomeStudio è la prima occasione per misurare realmente il successo del processo di genotipizzazione. Se la norma-R vs Norm-Theta trame intensità siano correttamente raggruppati, il tasso medio di chiamata (per cento del totale SNPs digitato correttamente) dei campioni dovrebbe avvicinarsi al 99%, anche se questo valore varia slightly a seconda del tipo di matrice. I dati da qualsiasi campione con un tasso di chiamata inferiore al 85-90% non è affidabile e devono essere eliminati. Ai fini del controllo di qualità, i risultati devono essere confrontati con eventuali genotipi quando possibile già noti. Se non esistono tali dati, intenzionale duplicazione del campione è uno strumento utile per la verifica della targa o matrice posizionamenti. Queste coppie duplicati dovrebbero essere immessi sul chip separati, piatti, lotti, o progetti, i loro genotipi controllati dopo generazione. Mentre specifici vincoli QC variano a seconda della preferenza del ricercatore, i vincoli comuni SNP sono basati sul successo chiamata di esempio, Hardy-Weinberg, o dati mancanti tra casi e controlli, mentre i vincoli del campione comuni si basano sui tassi di chiamata, incoerenze mendeliana o riferimenti incrociati del cromosoma X eterozigosi ai dati clinici di genere [13]. Se qualunque problema si pone, Dashboard Controls, che si trova nella suite di analisi, può essere presentata alazienda al fine di determinare la causa. Questi controlli possono spesso restringere la questione alla fase più probabile o il fallimento del reagente. Se qualche SNPs di interesse possono essere individuate attraverso un esperimento di genotipizzazione Infinium, le loro trame intensità dovrebbero essere controllate in GenomeStudio per errori di clustering prima di un ulteriore ricerca è condotta. Un esperimento di genotipizzazione Infinium fallito è probabilmente dovuto a un errore umano o di trasformazione del DNA di ingresso di scarsa qualità. Esempio di quantificazione deve essere accurata e precisa. Per ottenere i migliori risultati, eventuali reagenti aggiunti a qualsiasi campione o chip devono essere dispensati al volume stabilito dal protocollo. Le pipette devono essere opportunamente tarati. I reagenti non devono essere eseguiti dopo la scadenza e non devono essere ricongelati una volta scongelati, tranne che per il reagente RA1. Al fine di minimizzare i possibili errori di colorazione e di estensione, la miscela formammide / EDTA deve essere preparato fresco ogni mese. Tutti i -20 ° C i reagenti devono essere conservati solo in congelatori manuale sbrinamento. Tutte le attrezzature utilizzate nel stAining, ampliamento e lavaggio parti del protocollo devono essere risciacquati abbondantemente con acqua e detergente neutro immediatamente dopo disuso. I serbatoi umidificazione nella camera hyb dovrebbero essere abbattuti con un pennello provetta e un detergente delicato. I vetrini devono essere lavati con candeggina al 10%, come indicato dal loro manuali d&#39;uso, una volta a settimana.

Digitando polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) è un metodo fondamentale per identificare varianti di rischio connessi con la malattia. Storicamente, l&#39;ambito di esperimenti di genotipizzazione è stata limitata dalla tecnologia disponibile. Metodi di genotipizzazione basati su elettroforesi su gel sono limitati in-campione e SNP-capacità [1]. Lo sviluppo di questi saggi, spesso può essere alta intensità di lavoro, basandosi sulla composizione e la struttura della regione circostante la variante per l&#39;ottimizzazione [1]. Saggi TaqMan genotipizzazione, sviluppati da Life Technologies, possono eseguire un gran numero di campioni in modo rapido e con minimo coinvolgimento tecnico [2], ma restrizioni SNP multiplexing continuano a limitare il numero totale di genotipi di ben inferiore a un milione al giorno [3,4 ]. Piattaforma IPLEX di Sequenom può anche eseguire molti campioni in una sola volta, ma, come meno di un centinaio di SNPs possono essere multiplexati insieme, il throughput è relativamente basso nel complesso [5]. La tecnologia streaming SNP di Beckman Coulterpotrebbe teoricamente produrre oltre tre milioni di genotipi al giorno, ma questo intervallo progetto limiti tecnologici, fino ad un massimo di soli quarantotto SNPs per reazione [4,6]. Mentre il test GoldenGate in grado di elaborare quasi duecento campioni di DNA ogni giorno centinaia o migliaia di SNPs per campione, il prezzo per genotipo non è competitivo con tecniche ultra-high-throughput avanzate durante la digitazione di oltre tremila SNPs in una sola volta [4,7 ]. Al fine di elaborare diversi milioni di genotipi al giorno, la scala necessaria per i grandi studi di associazione genome-wide, saggi di array-ibridazione sono diventati l&#39;opzione più conveniente sul mercato. La linea di Affymetrix di array di ibridazione e la linea di Illumina di array-based Infinium consentono potenzialmente centinaia di campioni da digitate su centinaia di migliaia o milioni di SNPs in parallelo [4,8]. Questi SNPs possono essere sparsi su tutto il genoma, localizzata nelle regioni di interesse, come la exOMES, o personalizzato per preferenze dell&#39;utente. Queste matrici hanno il vantaggio non solo di essere in grado di genotipo con precisione un milione di SNPs per ogni campione in una volta, ma anche per misurare il numero di copie di variazione, anomalie cromosomiche potenzialmente svelare. Infinium-allineati array OMNI BeadChip attualmente hanno la capacità di genotipo fino a quasi cinque milioni di marcatori per campione, tra cui mezzo milione loci personalizzato, su un massimo di quasi un centinaio di campioni di ogni giorno. Poiché la maggior parte delle malattie hanno una componente genetica, questi esperimenti su larga scala possono essere cruciali nella ricerca di geni associati con la malattia. High-throughput genotipizzazione consente per la generazione di genotipo efficiente esempio imposta abbastanza grande per rilevare in maniera convincente associazione genetica a basse frequenze alleliche minori. Progetti di genotipizzazione intero genoma possono essere utilizzati per individuare le regioni con statisticamente significativa frequenza dell&#39;allele caso-controllo o le differenze del numero di copie [9,10,11]. Secondo il National Ge umanoNome Research Institute, studi di associazione genome-wide che hanno portato a 1.490 pubblicazioni separate tra 25 novembre 2008 e 25 gennaio 2013, derivanti dalla scoperta di 8.283 SNP con un p-value inferiore a 1 x 10 -5 (vedi http:// www.genome.gov/gwastudies/). Questi studi, che le condizioni che vanno da un&#39;altezza di cancro ai testicoli, ha beneficiato l&#39;approccio generale offerta da una analisi genome-wide ricercato. In casi come questi, intere regioni di interesse potrebbero essere sfuggito aveva lo scopo di battitura stato troppo restrittiva. Così, per le analisi di associazione su larga scala, una tecnica di genotipizzazione genoma di ampiezza è la tecnica di scelta. Esistono diverse versioni del saggio Infinium, ciascuno destinato all&#39;uso con specifici tipi di matrici. Il saggio InfiniumUltra, discusso in profondità sotto, è appropriato per molti 12 - o 24-chip matrice del campione. Questi spesso genotipo oltre un centinaio di migliaia di SNPs per ogni campione di DNA e concentrarsi su tregioni argeted, come ad esempio su pannelli exome o personalizzati. Altre versioni di saggio possono essere richieste per altri tipi di chip, come le matrici di genotipizzazione intero genoma. Tuttavia, come tutti i saggi Infinium condividono una base comune e differiscono principalmente solo dai nomi dei reagenti, i volumi di reagente, o l&#39;esatta procedura di reagente di colorazione, tecniche perfezionate su una versione test possono spesso essere universalmente applicata. Altri array, come array di metilazione, potrebbe utilizzare un protocollo pressoché identiche, pure. Bisogna fare attenzione a utilizzare solo la versione di dosaggio richiesto per il tipo di chip in uso. Alcuni tipi, come ad esempio quelli che misurano il livello di espressione genica, potrebbero richiedere l&#39;uso di un protocollo nonInfinium. I campioni devono essere elaborati in batch. Ad esempio, con il dosaggio InfiniumUltra, tubi dei reagenti prehybridization contengono un volume sufficiente per eseguire 96 campioni, ed i tubi non possono essere ricongelati. Pertanto, i campioni devono essere eseguiti in lotti di 96 campioni alla volta. I campioni saranno amplificati sui abetit giorno. Dopo circa 1 ora di benchwork, i campioni devono essere riscaldati in forno ventilato per 20-24 ore. Il giorno seguente, quasi 4 ore sarà speso la frammentazione, la precipitazione, e risospendere i campioni, al punto che i campioni possono sia essere congelati per un uso futuro o ibridati al chip. Caricamento chip prende quasi 2 ore, dopo di che i campioni saranno ibridati notte per 16-24 ore. Il terzo giorno, la fase di colorazione e l&#39;estensione prende ~ 4 ore. Un ulteriore ora saranno spesi lavaggio, verniciatura e l&#39;essiccazione le patatine. Infine, le matrici vengono analizzati, che può richiedere 15-60 min / chiave, a seconda del tipo utilizzato. Si applicano le misure di sicurezza di laboratorio e di pulizia standard. Sebbene non si basa PCR-amplificazione, sono necessarie postazioni separate per la pre-e postamplification procedure per ridurre al minimo la probabilità di contaminazione. Il numero di identificazione di ogni reagente kit fornito in uso deve essere registrato su un foglio di tracking. Reagenti Scongelare immediatamente prima dell&#39;uso e invertiti diverse volte prima erogazione. Il DNA deve essere digitato deve essere DNA genomico di alta qualità (260/280 Rapporto di assorbanza di 1,6-2,0, 260/230 il rapporto di assorbanza di sotto di 3,0), isolati con metodi standard e quantificati con un fluorimetro. Degradazione del DNA è spesso un fattore che contribuisce a risultati del saggio di bassa qualità. Tipicamente, è richiesta 200 ng di DNA, se questa quantità può variare per alcuni tipi di chip. A Tecan-liquido gestione robot è in grado di automatizzare molte fasi del protocollo e ridurre al minimo l&#39;errore umano come fattore.

<table><tbody><tr><td>Materiale di consumo o attrezzatura</td><td>Produttore</td><td>Numero di parte</td><td>Minimo richiesto per 96 campioni</td></tr><tr><td>0,8 ml Piastra a pozzetti profondi</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0765</td><td>1</td></tr><tr><td>Piastre Tappetini</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0674</td><td>2</td></tr><tr><td>Bacino di reagenti</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-681-502</td><td>9</td></tr><tr><td>Fogli termosaldanti</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0559</td><td>1</td></tr><tr><td>Distanziatore a flusso continuo</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9563984</td><td>6</td></tr><tr><td>Puntali per pipette - 200 &mu; l</td><td>Puntali per pipette Rainin</td><td>GP-L200F</td><td>192</td></tr><tr><td>- 10 &mu; l</td><td>Rainin</td><td>GP-L10F</td><td>16</td></tr><tr><td>puntali per pipette - 1.000 &00 &; l</td>. <td>Rainin</td><td>GP-L1000F</td><td>16</td></tr><tr><td>DNA sospensione tampone</td><td>Teknova</td><td>T0220</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>0,1 N NaOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>AC12419-0010</td><td>0,5 ml</td></tr><tr><td>Isopropanolo (grado HPLC)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A451</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>Etanolo (200-proof)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>459836</td><td>330 ml</td></tr><tr><td>Formamide (100%)</td><td>Thomas Scientific</td><td>C001K38</td><td>15 ml</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M)</td><td>Amresco</td><td>E177</td><td>0,2 ml</td></tr><tr><td>10 &mu; l Pipetta a 8 canali</td><td>Rainin</td><td>L8-10XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>200 &mu; l Pipetta a 8 canali</td><td>Rainin</td><td>L8-200XLS</td><td>2</td></tr><tr><td>1.000 &mu; l Pipetta monocanale</td><td>Rainin</td><td>L-1000XLS</td><td>1</td></tr><tr><td>Agitatore per micropiastre</td><td>VWR</td><td>13500-890</td><td>1</td></tr><tr><td>Centrifuga per micropiastre</td><td>refrigerata VWR</td><td>BK369434</td><td>1</td></tr><tr><td>Forno di ibridazione</td><td>Illumina</td><td>SE-901-1001</td><td>1</td></tr><tr><td>Incubatore per microcampioni Hybex</td><td>SciGene</td><td>1057-30-0</td><td>1</td></tr><tr><td>Inserto</td> <td>per blocchi termici MIDI HybexIllumina</td><td>BD-60-601</td><td>1</td></tr><tr><td>Termosigillatrice</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-0384</td><td>1</td></tr><tr><td>Camera Hyb con inserto e tappetino</td><td>Illumina</td><td>BD-60-402</td><td>2</td></tr><tr><td>Forbici chirurgiche</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-804-20</td><td>1</td></tr><tr><td>Flusso attraverso le parti di assemblaggio</td><td>Illumina</td><td>WG-10-202</td><td>8</td></tr><tr><td>Stendibiancheria e piatto</td><td>Illumina</td><td>BD-60-450</td><td>1</td></tr><tr><td>Genepaint Rack per camera</td><td>Tecan</td><td>760-800</td><td>1</td></tr><tr><td>sonda di temperatura</td><td>Illumina</td><td>A1-99-109</td><td>1</td></tr><tr><td>rack e piatto di colorazione</td><td>Illumina</td><td>WG-10-207</td><td>1</td></tr><tr><td>pinzetta a chiusura automatica</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>5374-NM</td><td>1</td></tr><tr><td>collettore per vuoto</td><td>Ted Pella, Inc</td><td>2240</td><td>1</td></tr><tr><td>iScan o HiScan</td><td>Illumina</td><td>- </td><td>1</td></tr></tbody></table>

infinium assay per i grandi snp genotipizzazione applicazioni

Infinium Assay for Large-scale SNP Genotyping Applications

Varianti di genotipizzazione del genoma umano ha dimostrato di essere un metodo efficace per identificare associazioni genetiche con fenotipi. La distribuzione delle varianti all&#39;interno delle famiglie o delle popolazioni può facilitare l&#39;identificazione dei fattori genetici della malattia. Pannello di Illumina di BeadChips genotipizzazione consente agli investigatori di genotipo migliaia o milioni di polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) o per analizzare altre varianti genomiche, come numero di copie, attraverso un gran numero di campioni di DNA. Questi SNPs possono essere diffuse in tutto il genoma o mirati in regioni specifiche al fine di massimizzare il potenziale di scoperta. Il dosaggio Infinium è stato ottimizzato per produrre alta qualità, risultati precisi rapidamente. Con opportuna configurazione, un singolo tecnico può elaborare da poche centinaia a oltre mille campioni di DNA alla settimana, a seconda del tipo di matrice. Questo saggio guida gli utenti attraverso ogni passo, partendo con il DNA genomico e termina con la scansione della matrice. Utilizzo di correttezza Reagenti, i campioni sono amplificati, frammentato, precipitato, risospese, ibridata al chip, prorogato di un unico basamento, macchiato, e scansionata né su di un sistema di imaging ottico ad alta risoluzione iScan o Hi Scan. Un passo durante la notte è necessaria per amplificare il DNA. Il DNA è denaturato e isotermicamente amplificata da tutto il genoma di amplificazione, pertanto, non è richiesta alcuna PCR. I campioni sono ibridate agli array durante una seconda fase durante la notte. Entro il terzo giorno, i campioni sono pronti per essere analizzati e analizzati. DNA amplificato può essere stoccato in grandi quantità, consentendo matrici tallone da trasformare ogni giorno della settimana, in modo da massimizzare il throughput.

Un chip tallone adeguatamente trasformati dovrebbe mostrare intensità della luce laser rosso e verde brillante e distinti durante la scansione. Nella Figura 6, il software di scansione iScan visualizza un campione di DNA genomico di serie ibridato con successo in una matrice di SNP genotipizzazione custom-panel. I nucleotidi marcati che sono stati attaccati durante le fasi di ampliamento e di colorazione fluorescenti sotto le luci dei due laser. Poiché questi nucleotidi selettivamente estendono catena oligonucleotide del tallone ibridato al filamento di DNA frammentato, e come le catene oligonucleotidiche sono progettati per terminare al sito della variante, il colore e l&#39;intensità del segnale risultante può essere utilizzato per determinare gli alleli presenti alla sito SNP. Un foglio user-generated campione che corrisponde ID dei campioni e le informazioni cliniche per ChipID e la posizione, e SNP manifesto specifico array, ottenuto direttamente dalla società, sono entrambi necessari per importare la scafile di output NNER nel software di analisi GenomeStudio. Fogli Esempio di esempio si possono trovare sul sito web della società. Una volta che il progetto GenomeStudio è costruito, genotipi possono essere ottenuti dai grappoli di intensità risultanti generati automaticamente dal software. Anche se esistono diverse opzioni di visualizzazione, la visualizzazione predefinita, Norm-R (un valore di intensità normalizzato) vs Norm-Theta (un rapporto di intensità allelica), è spesso la trama più semplice per distinguere tre gruppi distinti. La maggior parte degli SNPs dovrebbero mostrare una, due, o tre gruppi, a seconda della frequenza dell&#39;allele minore. I tre cluster rappresentano esempi che dimostrano AA, AB, o alleli BB (vedi Figura 7). Questi gruppi possono essere assegnati genotipi sia importando un modello di posizione di clustering di serie direttamente dalla società, selezionando &quot;cluster All SNPs&quot; dalla barra degli strumenti di analisi del software, o cliccando e trascinando i cerchi colorati nelle piazzole intensità di edi manualmente<html> t chiamate. Il colore del campione sul terreno intensità (rosso, viola o blu) indica la chiamata (AA, AB o BB, rispettivamente); nero indica nessuna chiamata. Scorrendo gli SNPs elencati nel riquadro Dati completa del software, il raggruppamento per ogni SNP può essere visualizzato o richiamato. Una volta che i grappoli vengono assegnati chiamate soddisfacenti, il riquadro Dati completi del software elenca i genotipi per ogni singolo campione a ogni particolare SNP. L&#39;opzione Scelta colonne sopra il tavolo può commutare formati di dati. I dati possono essere esportati tramite la barra degli strumenti di analisi o direttamente dalla tabella dei dati completi per un&#39;analisi approfondita. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig1.jpg" width="600px" /> Figura 1. Panoramica - Infinium Assay protocollo.683/50683fig1highres.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig2.jpg" width="600px" /> Figura 2. Completa Hyb Camera base e mat, più coperchio. [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig3.jpg" width="600px" /> Figura 3 Caricamento di un BeadChip -.. Versare il campione sulle porte di ingresso [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire</a><html> immagine. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig4.jpg" width="600px" /> Figura 4 Rimozione della BeadChip Coverseal -.. Afferrare la tenuta in un angolo e staccare delicatamente diagonale [12] <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig5.jpg" width="600px" /> Figura 5. Complete Assembly BeadChip Flow-through - Il BeadChip è separata da un vetrino con un distanziale e legato con fermagli.&gt; Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig6.jpg" width="600px" /> Figura 6. Successo Scan BeadChip - A) La BeadChip viene scansionato sia con un laser rosso e verde, i display software di scansione entrambi contemporaneamente. Le sezioni di passaggio QC intensità evidenzieranno verde sul display BeadChip a sinistra. Sezioni mancanza QC intensità si evidenziano rosso sul display BeadChip. B) Una volta completata la scansione, il software sovrapporre i display rosso e verde. Viene mostrato un immagine ingrandita. Il colore e l&#39;intensità di ogni singolo cordone indica l&#39;allele presente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50683/50683fig7.jpg" width="500px" /> Figura 7. SNP NORM-R vs NORM-THETA Profili cluster - A) Un valido SNP con tre gruppi distinti che rappresentano AA, AB, e genotipi BB, rosso, viola e blu colorato B) A SNP modifica richiede.. Il cluster centrale, che dovrebbe essere omozigote AB, viene lasciato un-chiamato. Il cluster BB è erroneamente chiamato AB. C) Un povero prestazioni SNP. Non genotipi possono essere ottenuti da questa trama di intensità, come non esistono gruppi distinti. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50683/50683fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita</a> .

Un protocollo è descritto che utilizza saggi di Illumina Infinium effettuare genotipizzazione su larga scala. Questi test possono genotipo affidabile milioni di SNPs su centinaia di singoli campioni di DNA in tre giorni. Una volta generata, questi genotipi possono essere usate per controllare le associazioni con una varietà di malattie o fenotipi differenti.

Infinium Assay per i grandi SNP genotipizzazione Applicazioni

Genotyping variants in the human genome has proven to be an efficient method to identify genetic associations with phenotypes. The distribution of ...

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare con successo il saggio Infinium per elaborare un chip genetico a perline. Questo viene realizzato innanzitutto amplificando, frammentando e isolando il DNA. Il secondo passaggio consiste nell'ibridare il filamento di DNA denaturato con oligonucleotidi legati a perline presenti nell'array. Successivamente, l'oligonucleotide legato alla perla viene colorato e allungato selettivamente di una base. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare le microperle per rilevare il nucleotide marcato. Infine, i risultati del genotipo vengono utilizzati per determinare gli alleli presenti nel sito di interesse.La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale perché molte delle fasi di colorazione e caricamento delle piastre per api sono difficili da apprendere. Numerose manovre non sono presenti in altri metodi di genotipizzazione e molti strumenti hanno nomi molto simili tra loro. Un giorno prima dell'amplificazione, preparare la dispensazione del DNA, aggiungendo 200 nanogrammi di DNA per pozzetto in una piastra campioni 96 pozzetti con pozzetti profondi.Devono essere piastrati almeno 96 campioni per garantire che nessun reagente venga sprecato. Etichettare la piastra con un'etichetta a codice a barre fornita dal kit e centrifugarla per normalizzare i volumi. Lasciare i campioni in un cassetto o in una cappa per tutta la notte per far evaporare il liquido.Coprire la piastra in modo lento con un coperchio o un tovagliolo di carta per proteggerla dalla polvere fino alla mattina seguente. Verificare che le pozzette siano asciutte. Utilizzare un serbatoio di reagente e una pipetta multicanale da 10 microlitri per dispensare quattro microlitri di tampone di risospensione del DNA in ogni pozzetta, al fine di reidratare i campioni. Se si fa attenzione a non toccare il liquido, non è necessario smaltire le punte della pipetta tra ogni colonna.Successivamente, dispensare 20 microlitri del reagente MA uno in ogni pozzetto della piastra utilizzando una pipetta a otto canali e un nuovo contenitore per reagenti. Coprire la piastra con un sigillo riutilizzabile, eseguire una breve centrifugazione e vorticare per un minuto a 1600 g su uno shaker per micropiastre, quindi incubare a temperatura ambiente per almeno 30 minuti. I passaggi rimanenti per l'amplificazione non verranno mostrati in questo video, ma il protocollo è disponibile nel manoscritto allegato.Dopo aver aggiunto tutti i reagenti, posizionare la piastra in un forno opportunamente calibrato impostato a 37 gradi Celsius per 20-24 ore. Dopo l'amplificazione, i campioni di DNA vengono frammentati e precipitati come descritto nel manoscritto, successivamente alla precipitazione in una centrifuga ad alta velocità. Ispezionare il fondo della piastra senza capovolgerla.Per confermare che i campioni siano precipitati in un pellet blu, rimuovere il coperchio e scartarlo, quindi eliminare rapidamente il liquido capovolgendo la piastra e battendola con forza sulla superficie del banco coperta con carta assorbente. Una volta capovolta la piastra, fare attenzione a non rimetterla in posizione originale. Finché rimane del liquido, battere ripetutamente la piastra contro il banco fino a quando tutto il liquido non è stato rimosso.Posizionare la piastra su un rack per provette capovolto per l'incubazione all'aria a temperatura ambiente per un'ora. Successivamente, il DNA viene risospeso per iniziare la procedura di ibridazione. Posizionare una piastra a 96 pozzetti contenente il DNA risospeso su un blocco termico a 95 gradi Celsius per 20 minuti.Per denaturare il DNA dopo 20 minuti, rimuovere la piastra del campione dal blocco termoregolato e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Mentre la piastra si raffredda, preparare la camera dell'alveare. Sarà necessaria una camera per ogni quattro chip per api processati. Posizionare un tappetino di gomma sulla parte superiore della base della camera dell'alveare, allineando il foro più spesso con la parte anteriore della base.Il simbolo del codice a barre inciso alla base dovrebbe essere ancora visibile. Utilizzando una pipetta da 1000 microlitri, distribuire 400 microlitri di reagente PB due in ciascuno degli otto serbatoi umidificatori ricavati alla base. Posizionare il coperchio della camera hi sulla base e chiudere entrambe le estremità posizionando due fermagli su lati diagonalmente opposti.Posizionare innanzitutto quattro inserti per camera Hi sul banco per ogni camera Hi utilizzata, subito prima del completamento dei 30 minuti di raffreddamento. Aprire le confezioni dei chip con perline argentate.Rimuovere le chip dalle loro custodie di plastica trasparente senza toccare le perle. Posizionare ogni chip per api su un inserto con camera alta. Orientare il codice a barre della chip in corrispondenza del simbolo del codice a barre inciso sulla superficie superiore dell'inserto.Il passaggio successivo, che consiste nel caricamento dei chip per api, potrebbe essere il passaggio più critico del protocollo. Per eseguirlo correttamente è necessario visualizzare in anticipo il trasferimento del campione dalla piastra del DNA al chip per api. Staccare e scartare il coperchio della piastra dei campioni. È possibile utilizzare una pipetta multicanale per dispensare il liquido sui chip, ma è fondamentale prevedere di aspirare soltanto il numero di campioni che possono essere posizionati in sicurezza sul chip per api, poiché il numero di righe su una piastra non corrisponde sempre al numero di righe su un chip.Prelevare 15 microlitri di campione dalla piastra dei campioni e dispensarli lentamente sull'ingresso dell'array. È necessario prestare una cura straordinaria per posizionare il campione corretto sul chip dell'ape corretto, nella posizione corrispondente al chip delle perline, secondo l'ordine registrato in precedenza.Aprire la camera hi e posizionare gli inserti sopra i serbatoi umidificatori. Il codice a barre del chip deve essere posizionato sopra l'incisione per il codice a barre presente alla base della camera hive. Rimettere il coperchio della camera hive e chiudere tutte e quattro le chiusure chiudendo prima quelle sui lati diagonalmente opposti.Per prima cosa, incubare la camera hi in un forno a 48 gradi Celsius per 16-24 ore. Al termine dell'ibridazione, rimuovere le camere hi dal forno e incubarle a temperatura ambiente per 25 minuti per farle raffreddare. Una volta raffreddate le camere hi, aprirne una. Rimuovere il sigillo di chiusura da un chip per api afferrando il sigillo in un angolo e staccandolo delicatamente in diagonale.Dopo aver rimosso il sigillo, posizionare immediatamente il chip su un vassoio per chip per api e immergerlo in PB1 senza toccare le perle. Ripetere fino a quando il vassoio è pieno di chip con perle, avendo cura di non far asciugare alcun chip.Agitare delicatamente il vassoio per rimuovere eventuali bolle e lasciare i campioni immersi per un minuto. Agitare nuovamente il vassoio. Spostare il vassoio con i campioni di ape in una seconda vaschetta di lavaggio riempita con PB. Agitare delicatamente e lasciare in ammollo per un minuto.Quindi agitare nuovamente nell'assemblaggio con flusso di liquido. Posizionare quattro supporti di flusso in plastica nera nelle scanalature. Riempire la stazione con PB uno alla volta, fino a quando il liquido non raggiunge quasi l'altezza degli otto supporti di assemblaggio.Rimuovere le chip con perline dal vassoio e posizionarle nella stazione di assemblaggio su un supporto plastico a flusso passante, in modo che il codice a barre della chip sia allineato sopra il simbolo del codice a barre inciso nella stazione di assemblaggio. Una volta posizionate quattro chip nella stazione di assemblaggio, apporre un distanziatore in plastica trasparente su ciascuna chip con perline. I bordi esterni del distanziatore devono circondare le staffe presenti all'interno della stazione di assemblaggio.Posizionare la barra di montaggio in plastica nella stazione di assemblaggio inserendola nelle scanalature. Posizionare delicatamente un vetrino sopra lo spaziatore in plastica spingendo l'estremità posteriore del vetrino contro la barra di montaggio e abbassando lentamente la parte anteriore nel liquido. La scanalatura sulla parte superiore del vetrino deve essere rivolta verso il basso, direttamente sopra il codice a barre del chip, lasciando un'intercapedine tra il chip per api e il vetrino all'estremità del codice a barre.Dopo aver verificato che non ci siano bolle d'aria tra il chip e il vetrino, agganciare due fermagli metallici intorno al vetro. Farne scivolare uno verso l'estremità del codice a barre e l'altro verso la parte posteriore. I bordi dei fermagli in plastica devono afferrare la staffa di passaggio in plastica situata sotto il chip.Questo schema mostra un diagramma completo dell'assemblaggio del flusso in uscita. Una volta che tutte le perline sono inserite nei rispettivi assemblaggi del flusso in uscita, prendere un paio di forbici chirurgiche e tagliare entrambe le estremità dello spaziatore il più vicino possibile alla lamella di vetro. Quando il supporto della camera raggiunge i 44 gradi, iniziare questa procedura posizionando un assemblaggio del flusso in uscita del chip per api sul supporto della camera, facendo scorrere l'assemblaggio verso il basso e agganciando il puntello nella parte superiore. La parte posteriore del chip per api deve essere a contatto con il supporto della camera.Il vetrino deve essere rivolto verso l'esterno con la scanalatura in alto per formare un serbatoio per il reagente. Una volta posizionati tutti gli assemblaggi del chip per api sul supporto della camera, utilizzare una pipetta da 200 microlitri per aggiungere 150 microlitri del reagente RA one agli assemblaggi a flusso. Erogando il liquido nel serbatoio di vetro, il reagente scorre naturalmente lungo il vetrino e fuoriesce alla base dell'assemblaggio, consentendo ai reagenti successivi di essere aggiunti direttamente nel serbatoio.I passaggi rimanenti per la colorazione di un'estensione non verranno mostrati. Si prega di fare riferimento al protocollo nel manoscritto allegato al termine della colorazione e dell'estensione. Smontare il sistema di flusso inserendo un'asta metallica sottile tra le fibbie e il supporto.Quindi pivotare. Mettere da parte il vetrino e rimuovere immediatamente il chip con l'ape, posizionando il chip in un vassoio verticale per chip con api e immergendolo in PB1, ripetere per ogni assemblaggio con flusso in continuo. Avere cura di orientare ogni chip con l'ape nella stessa direzione e minimizzare l'esposizione all'aria.Completare successivamente questa procedura. Secondo il protocollo descritto nel testo allegato, un chip per api correttamente processato dovrebbe mostrare intensità luminose e distinte di luce laser rossa e verde quando viene scansionato, poiché i nucleotidi marcati che si sono legati durante i passaggi di estensione e colorazione emettono fluorescenza sotto le luci dei due laser. Qui viene mostrato un campione standard di DNA genomico ibridato con successo a sezioni di un array personalizzato per il genotipaggio di SNP che superano l'intensità richiesta.Il controllo qualità mostrerà in verde sul display del chip per api le sezioni a sinistra. Intensità insufficiente. Il controllo qualità mostrerà in rosso sul display del chip per api.Al termine della scansione, verranno sovrapposti i display rosso e verde. Viene mostrata qui un'immagine ingrandita, poiché questi nucleotidi estendono selettivamente la catena di oligonucleotidi legata alle perle, ibridata al frammento di DNA. E poiché le catene di nucleotidi sono progettate per terminare nel sito della variante, il colore e l'intensità del segnale risultante possono essere utilizzati per determinare gli alleli presenti nel sito del polimorfismo a singolo nucleotide (SNP).I file di output dello scanner vengono importati nel software di analisi Genome Studio, che genera profili di cluster. Questo è un esempio di un SNP valido con tre cluster distinti che rappresentano i genotipi aa, A, B e B, B, colorati rispettivamente di rosso, viola e blu. Questo grafico di intensità mostra l'SNP che richiedeva la modifica del cluster centrale nero, che dovrebbe essere omozigote.AB viene lasciato senza chiamata. L'ammasso BB viene erroneamente chiamato ab. L'ultimo grafico di intensità mostra un SNP con prestazioni scadenti.Non è possibile ottenere genotipi da questo grafico di intensità poiché non esistono cluster distinti. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di processare rapidamente le piastre per api. Non esporle all'aria per periodi prolungati.

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Biologia

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