Name: Un In-vitro Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-07T12:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Impara a isolare neuroni e glia funzionali dal plesso mienterico del topo adulto mediante digestione enzimatica e coltura cellulare. Questo metodo consente studi elettrofisiologici e analisi delle interazioni neuronali.

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National Institute of Health di Grant DA024009, DK046367 &amp; T32DA007027.

Tutto cura degli animali e le procedure sperimentali sono stati in conformità con e approvati dalla cura degli animali e del Comitato Istituzionale Usa presso la Virginia Commonwealth University. 1. Preparazione di sterili vetrini poli-D-lisina e laminina-rivestite in piastre da 24 pozzetti <ol><li> Tutte le procedure di passaggio 1 sono eseguite in condizioni sterili, sotto cappa, e con reagenti sterili. Vetrini e doppia acqua deionizzata (DDH 2 O) devono essere sterilizzati in anticipo. Preparazione delle lastre può essere fatto fino a due settimane prima dell&#39;isolamento neurone. </li><li> Sotto il cofano, utilizzare pinze sterili per posizionare vetrini autoclave a 12 pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. </li><li> Preparare azione poli-D-lisina prima del tempo. Aggiungere 50 ml di ddH2O sterile a 5 mg di poli-D-lisina. Vortex e conservare in 3 ml aliquote a -20 ° C. Scongelare aliquote prima dell&#39;uso. </li><li> Per una concentrazione finale di 1 ml di brodo di poli-D-lisina ogni 25 cm 2: pipetta 80 microlitridi azione poli-D-lisina in cima ad ogni vetrino vetro (2 cm 2). Lasciare riposare la soluzione per 10 minuti. </li><li> Rimuovere poli-D-lisina usando il vuoto e sciacquare coprioggetto 3x con sterile DDH 2 O. </li><li> Lasciare le piastre ad asciugare per almeno 2 ore sotto il cofano. </li><li> Piastre possono essere conservati a 4 ° C o - 20 ° C prima di procedere al rivestimento laminina. </li><li> Preparare laminina magazzino prima del tempo. Scongelare laminina su ghiaccio e tenere in ghiaccio durante l&#39;uso. Diluire ad una concentrazione di 50 ug / ml; prestare attenzione alla concentrazione lot; ogni lotto sarà diverso. A seconda della concentrazione molto, circa 20 ml di DDH 2 O sarà aggiunto ad ogni flacone di laminina. Aliquota (5 ml) e conservare a -80 ° C. Scongelare aliquote sul ghiaccio prima dell&#39;uso. </li><li> Coprioggetto Cappotto con 5 mg / cm 2 laminina; pipetta 200 ml di magazzino laminina su ogni vetrino. </li><li> Incubare soluzione laminina su vetrini per 1 ora. </li><li> Aspirare rimanente soluzione laminina e risciacquare coprioggetto una volta conDDH 2 O. Evitare di raschiare superficie del coprioggetto. </li><li> Conservare le piastre a 4 ° C per un massimo di due settimane. </li></ol> 2. Preparazione anticipo di Neuron Isolation Solutions <ol><li> Preparare la soluzione di Krebs (in mM: 118 NaCl, 4.6 KCl, 1.3 NaH 2 PO 4, 1.2 MgSO4, 25 NaHCO 3, 11 di glucosio, e 2,5 CaCl 2). Luogo 13,79 g di NaCl (FW 58.44), 0,686 g di KCl (FW 74.55), 0,312 g NaH 2 PO 4 (FW 120), .289 g MgSO4 (FW 120,4), 4,20 g NaHCO3 (FW 84.01), 3,96 g di glucosio (FW 180,2), e 0,555 g di CaCl 2 (FW 111) in 2 L DDH 2 0. Raffreddare a 4 ° C. </li><li> Preparare sciacquare i media (F12 media con il 10% di siero fetale bovino (FBS) e antibiotico / antimicotico): Per una bottiglia da 500 ml di F12 media, aggiungere 50 ml di FBS e 5 ml di antibiotico / antimicotica Liquid 100x (Gibco). </li><li> Preparare enterico neurone multimediale (Neurobasal Un supporto con B-27, 2 mM L-glutammina, 1% FBS, 10 ng / ml, Glial Neurotr DerivatoFattore ophic (GDNF), e antibiotica / antimicotica Liquid 100x). Per rendere GDNF magazzino, aggiungere 1 ml ddH2O a 10 mcg GDNF e congelare di nuovo in aliquote di 50 microlitri, conservare a -80 ° C. Per un ml fiala di supporto dei neuroni completi 50, combinare 47,5 ml Neurobasal Un supporto, 1 ml di B-27 (50x), 500 ml di FBS, 500 microlitri 200 mM L-glutammina (Gibco) 50 microlitri magazzino GDNF e 500 microlitri antibiotici / antimicotico Liquid 100x. Supporto è realizzato in piccoli lotti 50 ml per assicurare freschezza di GDNF e per evitare la contaminazione di grandi quantità di questa miscela costosi supporti cella. </li></ol> 3. Harvest longitudinale del muscolo / plesso mienterico (LMMP) Preparazione di topi <ol><li> Etici nazionali e istituzionali dovrebbero essere a posto prima di effettuare esperimenti su animali. Adulti svizzeri Webster topi di peso superiore a 25 g (in genere più di 8 settimane di età) sono alloggiati in gruppi di 6 prima di esperimenti. I tessuti di due topi sono utilizzati per l&#39;isolamento dei neuroni enterici ileali e glia e tre topi sono utilizzati perisolamento di cellule del colon. </li><li> Preparare area chirurgica. Raccogliere piccole forbici chirurgiche, pinze angolate, tamponi di cotone, tre bicchieri di vetro 200 ml, e una bacchetta di vetro / plastica (pennello). Assicurarsi che tutte le forniture vengono accuratamente lavati e risciacquati prima di utilizzare per ridurre al minimo la contaminazione. Questa fase può essere eseguita il giorno prima dell&#39;esperimento. </li><li> Collocare soluzione di Krebs su ghiaccio e bolla con carbogeno (95% di ossigeno, 5% CO 2) per almeno 30 minuti per stabilizzare il pH. </li><li> Accendere varie attrezzature e prodotti chimici caldi per stabilizzarsi a temperature desiderate; bagnomaria caldo (s) a 37 ° C, centrifuga raffreddare a 4 ° C, luogo soluzione salina bilanciata di Hank (HBSS) e il 0,5% tripsina a bagnomaria (37 ° C ). Supporti neurone completi e risciacquare media dovrebbero rimanere refrigerato. </li><li> Posto 150 ml di ghiaccio freddo gorgogliare Krebs in tre bicchieri di vetro 200 ml etichettate &#39;sporco&#39;, &#39;pulito&#39;, e &#39;LMMP&#39;. Coppa Bubble etichettato &#39;LMMP&#39; con CARBOGEN. </li><li> A seguito di approvazione da parte del comitato etico, eutanasia mouse per dislocazione cervicale o CO 2 asfissia. </li><li> Posizionare il mouse in recumbence dorsale sulla superficie chirurgica, pelle pulita con il 70% EtOH, e sollevare la pelle addominale con pinze. Utilizzando le forbici, cavità addominale aperta e rivelare organi digestivi interni. </li><li> Rimuovere la lunghezza del tratto gastrointestinale sollevando una sezione di ileo e rivelando il suo mesentere. Snip attraverso mesentere con le forbici per rimuovere delicatamente e svelare ileo e colon, facendo attenzione a non tirare dal mesentere dell&#39;ileo / colon. </li><li> Dopo la lunghezza dell&#39;intestino viene dispiegato, rimuovere l&#39;ileo tagliando attraverso l&#39;intestino distale allo stomaco e prossimale al cieco. Nota: questa procedura può anche essere eseguita con tessuto colico rimuovendo il colon da distale a cieco al prossimale l&#39;ano. </li><li> I tessuti possono essere ulteriormente suddivisi tra colon prossimale e distale, e jejenum, e ileo. Il resto di questa procedura farà riferimento all&#39;isolamento dell&#39;ileo; tegli procedura è la stessa per l&#39;isolamento di LMMP colon. Porre l&#39;intero ileo in un contenitore di vetro con ghiaccio freddo Krebs segnato &#39;sporca&#39;. </li><li> Creare uno strumento per pulire l&#39;ileo, smussato un grosso ago 20 G con una pietra deposito e collegarlo a una grossa siringa (10 ml) contenente ghiaccio freddo Krebs. </li><li> Pulire materia fecale dal ileo sezionando l&#39;ileo in tre o più pezzi di grandi dimensioni. Rimuovere una sezione ileale dal bicchiere e posizionare l&#39;ago smussato nell&#39;estremità di un pezzo ileale. </li><li> Eseguire delicatamente Krebs attraverso la sezione dell&#39;intestino fino a quando tutta la materia fecale è rimosso in un contenitore dei rifiuti. Posizionare la sezione pulita nel contenitore di Krebs marcato &#39;pulito&#39;. Ripetere fino a quando tutta l&#39;ileo è pulito. </li><li> Per rimuovere il LMMP, tagliare l&#39;ileo in piccoli segmenti, di circa 2-4 cm. Posizionare un segmento di ileo su una bacchetta di vetro o plastica; ileo dovrebbe adattarsi snuggly ma non essere allentato o teso (~ 2 mm). Inizia la rimozione del LMMP rimuovendo delicatamente bit di mesentere ancora attachpostazioni per l&#39;(GI) del tratto gastrointestinale con una pinza. Prevenire il tratto GI di ruotare intorno canna da appuntare delicatamente il tubo per l&#39;asta con il pollice. </li><li> Separare il LMMP dal muscolo circolare sottostante; prima strofinare delicatamente il bordo della pinza lungo l&#39;intera linea in cui è stato attaccato il mesentere, da cima a fondo del segmento, creando delicatamente una lacuna nel muscolo longitudinale. Poi stuzzicare delicatamente via il muscolo longitudinale utilizzando un batuffolo di cotone imbevuto di Krebs. </li><li> Inizia nella parte superiore del gap nel muscolo longitudinale e stuzzicare distanza utilizzando il più leggero tratto orizzontale mentre si applica una pressione molto leggera finché il muscolo longitudinale comincia soltanto a separare dal muscolo circolare; farlo cadere l&#39;intero striscia sul punto di attacco mesentere. </li><li> Poi iniziare delicatamente per aggirare il tubo GI; muovendo dall&#39;alto verso il basso e indietro come il muscolo longitudinale viene lentamente separato dal muscolo circolare tutto intorno al tubo. Al termine, ilLMMP sarà naturalmente venire fuori il resto del tubo GI. </li><li> Posizionare la striscia sottile risultante di muscolo longitudinale nel bicchiere marcato &#39;LMMP&#39;. Ripetere per tutti i segmenti. </li><li> Dopo che tutte le strisce di LMMP sono state raccolte da un topo, ripetere la procedura per eventuali altri topi utilizzati. Sciacquare bene i bicchieri &#39;sporchi&#39; e &#39;pulito&#39; prima del riutilizzo. </li><li> Sciacquare il LMMP 3x per rimuovere la contaminazione biologica. Riempire tre 2 ml provette Eppendorf con ghiaccio freddo Krebs. Mettere le strisce LMMP nella prima provetta e centrifugare per 30 sec a 356 xg in una centrifuga refrigerata a 4 ° C. Rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e spostare le strisce LMMP al prossimo pulita Krebs tubo pieno. Ripetere questa procedura per ciascun tubo rimanente. </li></ol> 4. Digest LMMP <ol><li> Preparare la soluzione digestione ponendo 13 mg collagenasi di tipo 2 e 3 mg in 10 ml BSA carbogeno-gorgogliare soluzione di Krebs. </li><li> Luogo segmenti di LMMP sciacquato in soluzione di digestione e di uso SICsori desiderate ricavare LMMP in piccoli pezzi. </li><li> Digest LMMP per 60 min a 37 ° C in bagno d&#39;acqua con agitatore mentre viene delicatamente gorgogliare carbogeno. </li><li> Dopo la digestione è completa, raccogliere le cellule per centrifugazione per 8 min a 356 xg in centrifuga refrigerata a 4 ° C. </li><li> Da questo punto in avanti tutte le procedure devono essere eseguite in condizioni sterili in una cappa di coltura cellulare! Tutti i reagenti ei contenitori devono essere sterilizzati prima dell&#39;uso. </li><li> Durante la centrifugazione, preparare la soluzione tripsina 0,05% disponendo 1 ml riscaldato 0,25% tripsina e 4 ml di HBSS riscaldato in una provetta sterile da 50 ml di coltura cellulare. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Non utilizzare un vuoto; questo probabilmente aspirare il pellet cellulare dovuto basse velocità di centrifugazione. Rimuovere con attenzione il pellet e il luogo in provetta pulita con 5 ml di soluzione di tripsina 0,05%. </li><li> Digerire cellule in soluzione tripsina 0,05% a 37 ° C bagnomaria con agitazione per 7 min. Non superare i 7 min di trattamento tripsina totale o neuroni perirà. </li><li> Neutralizzare la tripsina con 10 ml di risciacquo freddo media dopo 7 minuti di trattamento con tripsina. </li><li> Centrifugare le cellule per 8 min a 356 x g. Rimuovere ed eliminare i media. </li><li> Durante la centrifugazione, bilanciare un tratto di rete Nitex sterilizzato in cima ad una provetta sterile 15 ml di coltura cellulare. </li><li> Dopo la centrifugazione, rimuovere e scartare il surnatante. Delicatamente miscela di cellule risospendere triturando in 3 ml mezzi neuroni completi. Evitare la generazione di bolle d&#39;aria durante questa fase e tutti i futuri passi in cui miscela di cellule viene triturato. Tutti Triturazioni dovrebbe essere fatto molto delicatamente. Soluzione cella filtrante attraverso Nitex maglia in clean 15 ml di tubo di coltura cellulare. </li><li> Opzione: cella Cap tubo cultura e luogo in mixer Hula refrigerata (o qualsiasi mixer che fornisce la rotazione) con rollio delicato e ribaltamento per 30 min. Questo passaggio è facoltativo ma consigliato. </li><li> Opzionale: Dopo mixer Hula, aggiungere 2 ml di risciacquo freddo media per lavare le cellule. </li><li> Raccogliere le cellule per centrifugazione (8 min, 356 xg). Rimuovere e scartare il surnatante. </li><li> Risospendere le cellule in 1.200 microlitri mezzi neuroni completi. Triturare le cellule delicatamente usando 1 ml di punta della pipetta di plastica. Non generare bolle d&#39;aria. Pipettare lentamente e delicatamente fino a quando la maggior parte dei pezzi sono interrotte e le cellule sono sospese in un liquido. </li><li> Aggiungere 750 ml di mezzi completi per ciascuno dei 12 pozzetti contenenti un vetrino di vetro pre-rivestito e aggiungere 100 microlitri della soluzione di cellule triturato. </li><li> Incubare neuroni in coltura cellulare incubatore a 37 ° C con 5% di CO 2. </li><li> Cambiare metà dei mezzi cellulari ogni 2 giorni. </li><li> I neuroni sono pronti per le registrazioni elettrofisiologiche dopo 1-2 giorni di coltura. </li></ol>

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Gli autori dichiarano che non esistono grandi interessi in competizione.

Animali utilizzati Questo protocollo è stato ottimizzato per Swiss Webster topi. Tuttavia, questo metodo è facilmente adattabile ad altri mammiferi di piccole dimensioni quali ratti e ad altri ceppi di topi. Abbiamo effettuato con successo isolamenti preliminari con i topi C57 e del recettore μ-oppioidi knock-out. Tuttavia, è anche possibile che altri ceppi di topi possono essere problematico a causa di variazioni morfologiche nel tratto GI. Inoltre, vi sono differenze note tra ceppi di topi (C...

Il sistema nervoso enterico (ENS) è vasta rete di nervi e glia che corre per tutta la lunghezza del tratto gastrointestinale (GI). L&#39;ENS controlla funzionalmente tutti gli aspetti della digestione, tra cui la peristalsi, l&#39;assorbimento di liquidi / secrezione, sensazione di stimoli, ecc (per una rassegna vedi 1). Esso contiene oltre 500 milioni di neuroni, più che trovato nel midollo spinale, e contiene ogni classe neurotrasmettitore presente nel cervello. Inoltre, l&#39;ENS è unico in quanto può funzionare senza riflesso input dal sistema nervoso centrale 2. Comprensione della ENS è cruciale, non solo per capire il suo normale ruolo fisiologico, ma per capire il suo coinvolgimento in una varietà di neuropatie che può essere congenito (malattia di Hirschsprung), acquisita (Chagas), secondaria a condizioni di malattia (gastroparesi diabetica), farmaco indotta (sindrome dell&#39;intestino oppiacei), oppure a causa di un infortunio (ileo postoperatorio) 1. Inoltre, i neuroni enterici possono essere un reservoir per infezioni virali (varicella zoster) 3. A causa delle sue somiglianze con il cervello e gli alti livelli di serotonina nell&#39;intestino, i farmaci volti a curare i difetti del sistema nervoso centrale spesso hanno effetti collaterali indesiderati sul ENS 2. Si osserva inoltre che molte neuropatie come il morbo di Alzheimer e morbo di Parkinson mostrano cambiamenti cellulari simili nei neuroni enterici lunghi prima della loro comparsa in neuroni centrali, rendendo l&#39;ENS un modello accessibile per studiare la patogenesi di queste malattie 4. Pertanto, una conoscenza approfondita della ENS è una necessità nel capire gli stati di malattia e la prevenzione / predire gli effetti collaterali farmacologici. I neuroni del ENS sono stati tradizionalmente studiati nella cavia utilizzando preparati wholemount 5-7 o neuroni in coltura 8. Nonostante la facilità con cui i neuroni possono essere studiate in questo grande animale, questo modello ha molti limiti compresimancanza di ceppi geneticamente modificati, la mancanza di reagenti specifici per questa specie, e l&#39;alto costo associato con l&#39;ordinazione e che ospita questi soggetti. Lo sviluppo di un modello di sistema nervoso enterico murino ha il vantaggio unico di vari sistemi knock out, una vasta gamma di altre metodologie consolidate che possono essere utilizzati in combinazione con la tecnica di coltura cellulare, e la capacità di fornire una convalida per il modello cavia . L&#39;ENS è contenuto tre plessi che corrono la lunghezza del tratto gastrointestinale: l&#39;esterno myenteric plesso (tra il muscolo longitudinale e circolare) che è principalmente responsabile per le azioni peristaltici dell&#39;intestino, così come la mucosa e della sottomucosa plessi, ( trovato sotto e all&#39;interno della mucosa, rispettivamente) che controlla in gran parte l&#39;assorbimento di liquidi / secrezione e il rilevamento di uno stimolo. Questo metodo inizia con l&#39;isolamento del plesso (LMMP) preparazione muscolare / myenteric longitudinale mediante pelaturalo strato muscolare esterno del tratto GI. Questo riduce drasticamente il problema della contaminazione che sorgono quando lo strato di mucosa è coinvolta nel isolamento. Come risultato, questo processo è ideale per lo studio del controllo della motilità neuronale piuttosto che azioni secretori della ENS. Il metodo qui presentato risultati in una coltura mista dei neuroni enterici e glia. Almeno due diversi tipi di neuroni sono basate presenti sulle precedenti osservazioni elettrofisiologiche e immunocitochimica 9. La presenza di cellule gliali è estremamente vantaggiosa, in quanto non sono solo un tipo di cellula importante studiare nel loro diritto, ma contribuiscono alla sopravvivenza dei neuroni enterici 10 e di mantenere l&#39;espressione del recettore nativo sulla superficie delle cellule neuronali 11. Inoltre, carenze di glia enterica possono portare ad anomalie della motilità gastrointestinale stati di malattia, coniato 12 &#39;neuro-gliopathies&#39;. Pertanto, la cultura ENS presentata qui risultati in diversi tipi di cellule che sono maturi per le indagini. I vantaggi di questo metodo sono la facilità di isolamento, i requisiti di strumento poco costoso, e un breve periodo di tempo per padroneggiare la tecnica da parte di personale di laboratorio con esperienza. Limitazioni della metodologia includono bassa resa cella complessiva da elevati volumi di tessuto e l&#39;esclusione dei neuroni dell&#39;ENS di plexi mucosa e sottomucosa. Questa procedura sarà molto vantaggioso per gli studiosi specializzati in elettrofisiologia, immunoistochimica, PCR singola cellula, e altre metodologie.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>Fisherbrand Coverglass per Occhiali di Copertura per Crescita (diametro 12 mm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-545-82</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Poli-D-lisina</td><td>Sigma</td><td>P6407- 5 mg</td><td></td></tr><tr><td>piastra per coltura cellulare a 24 pozzetti</td><td>CELLTREAT</td><td>229124</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>BD Biosciences</td><td>354 232</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ddH2O</td><td></td><td></td><td>Può preparare in laboratorio&nbsp;</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga sterile da 15 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Provetta da centrifuga sterile da 50 ml</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP358-212</td><td>MW 58.44</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP366-500</td><td>MW 74.55</td></tr><tr><td>NaH2PO4 .2H2O</td><td>Fisher Chemicals</td><td>S369-3</td><td>MW137.99</td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M7506-500G</td><td>MW 120.4</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S6014-5KG</td><td>MW 84.01</td></tr><tr><td>glucosio</td><td>Fisher Chemicals</td><td>D16-1</td><td>MW 180.16</td></tr><tr><td>CaCl22H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C5080-500G</td><td>MW 147.02</td></tr><tr><td>F12 media</td><td>Gibco</td><td>11330</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Qualità del siero bovino fetale</td><td>Biological Inc.</td><td>110-001-101HI</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Antibiotico/antimicotico 100x liquido</td><td>Gibco</td><td>15240-062</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Neurobasale A media</td><td>Gibco</td><td>10888</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>200 mM di L-glutammina</td><td>Gibco</td><td>25030164</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Fattore neurotrofico derivato gliale (GDNF)</td><td>Neuromics</td><td>PR27022</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Forbici da dissezione a punta affilata</td><td>Fisher Scientific</td><td>8940</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Pinze per tessuti da dissezione</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-812-41</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-101</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Bicchiere in vetro graduato da 250 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-100-250</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>2 L Vetro Erlenmyer pallone</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB-500-2000</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Asta di plastica (pennello per bambini)</td><td>Crayola</td><td>05 3516</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Carbogen</td><td>Airgas</td><td>UN 3156</td><td>5% CO2</td></tr><tr><td>10 ml Siringa Leur-lock</td><td>Becton Dickinson</td><td>309604</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>21 G x 1 1/2 in. Ago ipodermico</td><td>Becton Dickinson</td><td>305167</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Collagenasi tipo 2</td><td>Worthington</td><td>LS004174</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td> American <td>Bioanalytical</td><td>AB00440</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>2 ml Microcentrifuga Eppendorf provette</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-864-252</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Nitrex Mesh 500 &micro; M</td><td>Elko Filtering Co</td><td>100560</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Set di pipette</td><td>Fisher Scientific</td><td>21-377-328</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Sharpeining Stone</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9681212</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>LabGard ES 425 Biological Safety Cabinet (cappa per colture cellulari)</td><td>Nuaire</td><td>NU-425-400</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>10 L Agitazione Waterbath</td><td>Edvotek</td><td>5027</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Microcentrifuga 5417R</td><td>Eppendorf</td><td>5417R</td><td>Può utilizzare una singola centrifuga più grande con adattatori di dimensioni</td></tr><tr><td>Allegra 6 Series Centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>366816</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>HuluMixer Sample Mixer</td><td>Invitrogen</td><td>15920D</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Incubatore a CO2 con camicia d'acqua AutoFlow</td><td>Nuiare</td><td>NU-4750</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr><tr><td>Bilancia analitica</td><td>Mettler Toledo</td><td>XS104</td><td>Può utilizzare qualsiasi marca</td></tr></tbody></table>

un<em&gt; in-vitro</em&gt; preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

An In-vitro Preparation of Isolated Enteric Neurons and Glia from the Myenteric Plexus of the Adult Mouse

Il sistema nervoso enterico è una vasta rete di neuroni e glia funzionare la lunghezza del tratto gastrointestinale che controlla funzionalmente motilità gastrointestinale. Una procedura per l&#39;isolamento e la coltura di una popolazione mista di neuroni e glia dal plesso mienterico è descritto. Le colture primarie possono essere mantenuti per più di 7 giorni con connessioni di sviluppo tra i neuroni e glia. La striscia di muscolo longitudinale con l&#39;allegata mienterico plesso è spogliato dal muscolo circolare sottostante dell&#39;ileo mouse o del colon e sottoposto a digestione enzimatica. In condizioni di sterilità, l&#39;isolata popolazione neuronale e gliale sono conservati all&#39;interno del seguente centrifugazione pellet e placcato su vetrini. Entro 24-48 ore, si verifica crescita dei neuriti e neuroni può essere identificato da marcatori pan-neuronale. Dopo due giorni di cultura, isolati neuroni potenziali d&#39;azione di fuoco, come osservato da studi di patch clamp. Inoltre, glia enterica può anche essere indicanied di GFAP colorazione. Una rete di neuroni e glia in stretta apposizione forma entro 5 - 7 giorni. Neuroni enterici possono essere individualmente e direttamente studiati utilizzando metodi come l&#39;immunoistochimica, elettrofisiologia, imaging del calcio, e la PCR singola cellula. Inoltre, questa procedura può essere eseguita in animali geneticamente modificati. Questa metodologia è semplice da eseguire e poco costoso. Nel complesso, questo protocollo espone i componenti del sistema nervoso enterico in modo facilmente manipolata in modo da poter meglio scoprire la funzionalità del ENS in stati normali e malattie.

<html> Subito dopo l&#39;isolamento di cellule LMMP-derivati, i neuroni e altri tipi di cellule non sarà immediatamente evidente. Vivente, cellule rotonde di fenotipo indistinto può essere vista come detriti tessuto dai frammenti di tessuto non digeriti e tessuto connettivo. Questo relitto è di alcuna preoccupazione e sarà in gran parte rimossa con la prima variazione media in due giorni. Non tentare di pulire le diapositive prima di questo, come le cellule vitali sani saranno rimossi. Dopo u...

Dimostriamo un protocollo di coltura cellulare per lo studio diretto dei componenti neuronali e gliali del sistema nervoso enterico. Un neurone / cultura mista glia su vetrini è preparato dal plesso mienterico di topo adulto fornendo la possibilità di esaminare singolo neurone e la funzione glia di elettrofisiologia, immunoistochimica,<em&gt; Ecc</em&gt;.

Un<em&gt; In-vitro</em&gt; Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

The enteric nervous system is a vast network of neurons and glia running the length of the gastrointestinal tract that functionally controls ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare neuroni funzionalmente vitali e CLIA dal plesso mienterico del topo adulto. Questo viene ottenuto innanzitutto rivestendo la superficie sterile per colture cellulari con polilisina e laminina. Il secondo passaggio consiste nel preparare le soluzioni e l'area chirurgica per l'isolamento del plesso mienterico.Successivamente, rimuovere il tratto gastrointestinale e isolare la sezione desiderata per creare una preparazione del plesso mienterico del muscolo longitudinale. L'ultimo passaggio consiste nella digestione sequenziale del LMMP in collagenasi e tripsina, seguita dalla semina delle cellule su superfici di coltura cellulare pre-codificate. Infine, elettrofisiologia, immunoistochimica e PCR su singola cellula possono essere utilizzate per studiare gli effetti dei neuroni enterici, delle cellule gliali o dell'interazione tra questi due tipi cellulari.La procedura sarà dimostrata dalla dottoressa Trisha Har Smith, ricercatrice postdottoranda nel nostro laboratorio, e sarà assistita da Joy Gombe, dottoranda nel nostro laboratorio. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti è che i neuroni e le cellule gliali provengono da topo adulto. Ciò consente di ottenere neuroni e cellule gliali completamente funzionali, che potenzialmente possono derivare da animali geneticamente modificati.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle proprietà elettriche dei neuroni, può essere applicato anche ad altre metodologie come l'immunocitochimica, la PCR da singola cellula e l'imaging del calcio in tempo reale. Iniziare questa procedura posizionando un topo eutanasizzato in posizione recumbente dorsale sulla superficie chirurgica.Successivamente, pulire la cute addominale con etanolo al 70%. Quindi sollevarla con una pinzetta ed aprire la cavità addominale con le forbici per esporre gli organi digestivi interni. Dopo di che, sollevare un tratto di ileo per esporre il mesentere.Rimuovere il tratto gastrointestinale e tagliare il mesentere con le forbici. Quindi rimuovere delicatamente e srotolare l’ileo e il colon. Prestare attenzione a non tirare il mesentere dall’ileo e dal colon una volta srotolato l’intestino per tutta la sua lunghezza.Rimuovere l'ileo tagliando l'intestino a valle dello stomaco e a monte del cieco. Questa procedura può essere eseguita anche con un tessuto colico, rimuovendo il colon dalla regione distale al cieco fino a quella prossimale all'ano. Successivamente, suddividere l'ileo in tre o più pezzi di grandi dimensioni.Strofinare delicatamente la soluzione di Krebs attraverso il tratto intestinale finché tutti i residui fecali non vengono rimossi in un contenitore separato per rifiuti. Posizionare il tratto pulito nel contenitore di Krebs etichettato come pulito e ripetere le procedure finché tutto l’ileo non è stato pulito. Per rimuovere il LMMP, tagliare l’ileo in segmenti piccoli di due-quattro centimetri.In seguito, posizionare un segmento di ileo su un'asta di plastica o vetro. L'ileo deve aderire bene, senza essere né allentato né troppo teso. Evitare che il tratto gastrointestinale ruoti attorno all'asta premendo delicatamente con il pollice per fissare il tubo all'asta.Quindi rimuovere delicatamente con una pinza i residui di mesentere ancora attaccati al tratto gastrointestinale. Successivamente, separare il muscolo longitudinale della muscolaris mucosae (LMMP) dal muscolo circolare sottostante, strofinando delicatamente il bordo della pinza lungo tutta la linea in cui il mesentere era attaccato, dalla parte superiore a quella inferiore del segmento.Successivamente, creare delicatamente un'apertura nel muscolo longitudinale. Quindi, staccare con delicatezza il muscolo longitudinale utilizzando un bastoncino di ovatta imbevuto di creosoto, partendo dall'estremità superiore dell'apertura, eseguendo il movimento più leggero possibile in senso orizzontale e applicando una pressione molto lieve finché il muscolo longitudinale inizia appena a separarsi dal muscolo circolare. Ripetere l'operazione lungo l'intera striscia seguendo il punto di attacco del mesentere.Successivamente, procedere delicatamente lungo il tubo gastrointestinale muovendosi dall'alto verso il basso e viceversa, separando lentamente il muscolo longitudinale dal muscolo circolare lungo l'intera circonferenza del tubo. Al termine, il LMMP si staccherà naturalmente dal rimanente tubo gastrointestinale.Quindi posizionare la striscia sottile risultante di muscolo longitudinale nel becher etichettato LMMP e ripetere le procedure per tutti i segmenti in questo procedimento. Aggiungere il lavaggio ai segmenti LMMP nella soluzione di digestione. Quindi tagliare il LMMP in piccoli pezzi con le forbici.Successivamente, digerirli per 60 minuti in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con agitatore, insufflando delicatamente carbogeno. Al termine della digestione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per otto minuti a 356 G in una centrifuga, raffreddata a quattro gradi Celsius.Nel frattempo, preparare una soluzione di tripsina allo 0,05% in una cappa a flusso laminare aggiungendo un millilitro di tripsina allo 0,25% preriscaldato e quattro millilitri di HBSS preriscaldato in un tubo sterile da 50 millilitri per colture cellulari. Dopo la centrifugazione, eliminare con attenzione il soprannatante, rimuovere il pellet cellulare e trasferirlo in un tubo pulito contenente cinque millilitri di soluzione di tripsina allo 0,05%. Successivamente, digerire le cellule nella soluzione di tripsina allo 0,05% in un bagnomaria a 37 gradi Celsius con agitazione per sette minuti, quindi neutralizzare la tripsina aggiungendo 10 millilitri di mezzo di lavaggio freddo.Dopo sette minuti di trattamento con tripsina, centrifugare le cellule per otto minuti a 356 gs. Nel frattempo, posizionare un pezzo di rete TX sterilizzata su un tubo sterile per colture cellulari da 15 millilitri. Dopo la centrifugazione, eliminare il soprannatante e risospendere delicatamente il pellet cellulare agitando in tre millilitri.Mezzo neuronale completo. Tutte le modifiche devono essere eseguite con molta delicatezza per evitare la formazione di bolle d'aria, quindi filtrare la soluzione cellulare attraverso una maglia NYX in un tubo da coltura cellulare pulito da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per otto minuti a 356 ×g.Dopo di ciò, rimuovere e scartare il soprannatante. Ri-sospendere le cellule in 1200 microlitri di mezzo neuronale completo. Successivamente, pipettare delicatamente le cellule utilizzando una punta di pipetta di plastica da un millilitro.Attenzione a non generare bolle d'aria; pipettare lentamente e delicatamente fino a quando la maggior parte degli aggregati si è sciolta e le cellule sono sospese nel liquido. A questo punto, aggiungere 750 microlitri di terreno completo in ciascuna delle 12 pozzette contenenti un coprivetro pre-codificato. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione cellulare titolata.Incubare i neuroni in un'incubatrice per colture cellulari a 37 gradi Celsius con 5% di anidride carbonica, cambiando la metà del mezzo di coltura ogni due giorni. I neuroni sono pronti per le registrazioni elettrofisiologiche dopo uno o due giorni di coltura.Qui viene mostrata la caratterizzazione immunohistochemica dei neuroni enterici. Lea isolata dal topo. La microscopia confocale del muscolo longitudinale ha rivelato la colorazione specifica per la beta-tubulina III nei neuroni, nell'intero preparato del muscolo longitudinale ileale del topo.E queste sono le cellule isolate dai preparati LMMP, che contengono i neuroni positivi alla colorazione per il legame del cal e le cellule gliali Retin, qui visualizzate mediante il marcatore specifico per la glia GFAP. Tuttavia, nessuna colorazione è stata osservata in assenza dell'anticorpo primario. Qui sono mostrati i neuroni e la glia isolati dal muscolo longitudinale del topo, che crescono in prossimità l'uno all'altro.Le immagini di microscopia confocale indicano i neuroni verdi e il ggl rosso che crescono facilmente l'uno accanto all'altro e sembrano interagire in vitro. Questa figura mostra l'elettrofisiologia dei neuroni enterici coltivati e del CLIA in modalità di clampaggio della corrente. Tutti i neuroni hanno mostrato potenziali d'azione in seguito all'iniezione di corrente.I CLIA non presentano potenziali d'azione, ma mostrano ampi potenziali elettrotonici in risposta all'iniezione di corrente. I neuroni coltivati dall'ileo del mouse costituiscono una popolazione eterogenea dal punto di vista elettrofisiologico. In modalità di clampaggio della corrente, l'iniezione di una corrente di 0,09 nanoampere nei neuroni induce potenziali d'azione.I neuroni negativi per il potenziale di azione ritornano immediatamente al potenziale di membrana a riposo dopo la stimolazione. Mentre i neuroni positivi per il potenziale di azione mostrano un potenziale di azione successivo alla stimolazione, nel quale il potenziale di membrana a riposo scende al di sotto della linea di base prima di tornare lentamente al valore iniziale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se effettuata correttamente.Quando si esegue questa procedura, è importante ricordare di mantenere vetri e strumenti chirurgici il più puliti possibile. Inoltre, è necessario eseguire iterazioni e agitare delicatamente le cellule, sostituendo metà del mezzo di coltura cellulare ogni due giorni dopo questa procedura. Metodi come l'elettrofisiologia e l'immunocitochimica possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive, ad esempio su come i canali ionici dell'intestino rispondano al trattamento farmacologico, per studiare l'espressione delle proteine nei neuroni e nelle cellule gliali e per comprendere come l'interazione tra questi due tipi cellulari venga modificata da diversi trattamenti dopo il loro sviluppo.Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare le funzioni fondamentali delle neuropatie e delle neuropatie del sistema nervoso enterico in animali geneticamente modificati. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare neuroni e cellule gliali dal plesso TER del sistema nervoso enterico del topo adulto.

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Neuroscience

Neuroscienze

Un modo alternativo di isolare motoneuroni embrionali di topo dal midollo spinale è descritto. Il metodo tiene conto del fatto che lectine possono legarsi a bassa affinità dei recettori nervosi p75NTR fattore di crescita. Questo lectina-based preplating permette una purificazione simile a quella con un anticorpo specifico contro il p75NTR.

Lectina a base di isolamento e la coltura del mouse motoneuroni embrionali

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria dell'intestino del topo. Delinea le fasi coinvolte nell'estrazione della sottomucosa e del tessuto della lamina propria, isolando le cellule gliali enteriche da esse e coltivando le cellule su una piastra a pozzetti rivestita per stabilire una coltura di cellule gliali enteriche.

Isolamento delle cellule gliali enteriche dalla sottomucosa e dalla lamina propria di un topo

Muscolari neuroni sensoriali sono coinvolti nella segnalazione propriocettiva e anche la relazione su eventi di stato e di pregiudizio legate metaboliche. Descriviamo un topo adulto in vitro preparazione muscolare-nervosa per gli studi sulla afferenze muscolari tratto attivato.

Un In Vitro Adult mouse per studiare le proprietà di cottura delle afferenze muscolari

Questo video dimostra un protocollo per condurre registrazioni elettrofisiologiche a fibra singola su un preparato di nervo colorettato di topo in vitro.

In vitro Caratterizzazione funzionale del topo colorettale Afferent Endings

Il sistema nervoso enterico (ENS) è una rete di neuroni e glia situata nella parete intestinale che controlla i riflessi intestinali. Questo protocollo descrive i metodi per registrare l'attività dei neuroni enterici e della glia in preparazioni vive di ENS utilizzando l'imaging Ca2+.

In Situ Ca 2+ Imaging del sistema nervoso enterico

Il sistema nervoso enterico è formato da cellule della cresta neurale che proliferano, migrano e colonizzano l'intestino. Le cellule della cresta neurale si differenziano in neuroni con marcatori specifici per il loro fenotipo di neurotrasmettitore. Questo protocollo descrive una tecnica per la dissezione, il fissaggio e l'immunocolorazione del tratto gastrointestinale embrionale murino per visualizzare l'espressione dei neurotrasmettitori del sistema nervoso enterico.

Immunostaining Per visualizzare Murine enterico nervoso Sistemi Di Sviluppo

Qui, descriviamo l'isolamento di cellule glial-enterico dal submucosa intestinale utilizzando le incubazioni EDTA sequenziale per chelare cationi bivalenti e quindi l'incubazione in soluzione di recupero delle cellule non-enzimatici. La sospensione cellulare risultante su poli-D-lisina e laminin di placcatura si traduce in una cultura altamente arricchita delle cellule glial submucosal per l'analisi funzionale.

Isolamento delle cellule Glial enteriche da Submucosa e Lamina Propria del topo adulto

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Qui presentiamo un protocollo per l'isolamento in vitro di più popolazioni di cellule gliali da un SNC di topo. Questo metodo consente la segregazione delle microglia regionali, delle cellule precursori degli oligodendrociti e degli astrociti per studiare i fenotipi di ciascuno in una varietà di sistemi di coltura.

Dissezione e isolamento della glia murina da più regioni del sistema nervoso centrale

Questo protocollo presenta un modo unico di generare colture cellulari del sistema nervoso centrale da cervelli di topo embrionali del giorno 17 per la ricerca neuro(immuno)logica. Questo modello può essere analizzato utilizzando varie tecniche sperimentali, tra cui RT-qPCR, microscopia, ELISA e citometria a flusso.

Stabilire colture cellulari miste neuronali e gliali da cervelli di topo embrionali per studiare l'infezione e l'immunità innata

Questo protocollo delinea l'isolamento di astrociti e microglia purificati dal midollo spinale del topo adulto, facilitando le successive applicazioni come l'analisi dell'RNA e la coltura cellulare. Include metodi e procedure dettagliati di dissociazione cellulare progettati per migliorare sia la qualità che la resa delle cellule isolate.

Isolamento di astrociti puri e microglia dal midollo spinale di topo adulto per saggi in vitro e studi trascrittomici

Impara a isolare neuroni e glia funzionali dal plesso mienterico del topo adulto mediante digestione enzimatica e coltura cellulare. Questo metodo consente studi elettrofisiologici e analisi delle interazioni neuronali.

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