Un In-vitro Preparazione dei neuroni enterici isolati e glia dal plesso mienterico del topo adulto

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare i neuroni funzionalmente vitali e la CLIA dal plesso mienterico del topo adulto. Ciò si ottiene rivestendo prima la superficie di coltura cellulare sterile con polilisina e laminina. Il secondo passo consiste nel preparare le soluzioni e l'area chirurgica per l'isolamento del plesso mioenterico.

Successivamente, rimuovere il tratto gastrointestinale e isolare la sezione desiderata per creare una preparazione del plesso mienterico muscolare longitudinale. Il passaggio finale consiste nel digerire in sequenza l'LMMP in collagenasi e tripsina, seguito dalla placcatura delle cellule sulle superfici di coltura cellulare precodificate. In definitiva, l'elettrofisiologia, l'immunocitochimica e la PCR a singola cellula possono essere utilizzate per studiare gli effetti dei neuroni enterici, della glia o dell'interazione tra questi due tipi di cellule.

A dimostrare la procedura sarà la dottoressa Trisha Har Smith, borsista post-dottorato in tutti i laboratori, e ad assisterla sarà Joy Gombe, dottoranda in tutti i laboratori. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti è che i neuroni e la glia provengono dal topo adulto. Ciò consente di avere neuroni e glia completamente funzionali, che possono potenzialmente provenire da animali geneticamente modificati.

Anche se questo metodo può fornire informazioni sulle proprietà elettriche dei neuroni. Può anche essere applicato ad altre metodologie come l'immunocitochimica, la PCR su singola cellula e l'imaging del calcio in tempo reale. Inizia questa procedura posizionando un topo soppresso in sdraiato dorsale sulla superficie chirurgica.

Successivamente, pulire la pelle addominale con etanolo al 70%. Quindi sollevalo con un paio di pinze e apri la cavità addominale con le forbici per rivelare gli organi digestivi interni. Dopodiché, solleva una sezione di ileo per rivelare il mesentario.

Rimuovere il tratto gastrointestinale e tagliare il mesentere con le forbici. Quindi rimuovere delicatamente e sbrogliare l'ileo e il colon. Fare attenzione a non estrarre il mesentere dall'ileo e dal colon dopo che l'intestino è stato sbrogliato.

Rimuovere l'ileo tagliando l'intestino distalmente allo stomaco e prossimalmente al cieco. Questa procedura può essere eseguita anche con un tessuto del colon rimuovendo il colon dal distale al cieco fino al prossimale all'ano. Quindi seziona l'ileo in tre o più pezzi grandi.

Strofinare delicatamente la soluzione di kreb attraverso la sezione intestinale fino a quando tutta la materia fecale non viene rimossa in un contenitore per rifiuti separato. Posizionare la sezione pulita nel contenitore di Krebs etichettato come pulito e ripetere le procedure fino a quando l'intero ileo non viene pulito. Per rimuovere l'LMMP, tagliare l'ileo in piccoli segmenti da due a quattro centimetri.

Successivamente, posiziona un segmento di ileo su un'asta di plastica o di vetro. L'ileo dovrebbe adattarsi perfettamente ma non allentato o teso. Evitare che il tratto gastrointestinale ruoti attorno all'asta fissando delicatamente il tubo all'asta con il pollice.

Quindi rimuovere delicatamente i pezzi di mesentere che sono ancora attaccati al tratto gastrointestinale con una pinza. Successivamente, separare l'LMMP dal muscolo circolare sottostante. Strofinando prima delicatamente il bordo della pinza lungo l'intera linea in cui era attaccato il mesentere dall'alto verso il basso del segmento.

Successivamente, creare delicatamente uno spazio nel muscolo longitudinale. Quindi stuzzicare delicatamente il muscolo longitudinale usando un batuffolo di cotone unito a crebs iniziando dalla parte superiore dello spazio, usando il tratto orizzontale più leggero mentre si applica una pressione molto leggera fino a quando il muscolo longitudinale inizia a separarsi dal muscolo circolare. Fallo lungo l'intera striscia lungo il punto di attacco del mesenario.

Quindi, lavora delicatamente intorno al tubo gastrointestinale spostandoti dall'alto verso il basso e indietro. Poiché il muscolo longitudinale viene lentamente separato dal muscolo circolare tutto intorno al tubo. Al termine, l'LMMP si staccherà naturalmente dal tubo gastrointestinale rimanente.

Quindi posizionare la sottile striscia di muscolo longitudinale risultante nel becher etichettato LMMP e ripetere le procedure per tutti i segmenti in questa procedura. Posizionare il risciacquo sui segmenti LMMP nella soluzione di digestione. Quindi taglia l'LMMP in piccoli pezzi con le forbici.

Quindi, digeriscili per 60 minuti. In un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius con uno shaker mentre viene delicatamente bollito con carbogeno. Al termine della digestione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione per otto minuti a 356 Gs in una centrifuga, raffreddare a quattro gradi Celsius.

Nel frattempo, preparare una soluzione di tripsina allo 0,05% in una cappa per colture cellulari aggiungendo un millilitro di tripsina riscaldata allo 0,25% e quattro millilitri di HBSS riscaldato in una provetta sterile da 50 millilitri. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante, rimuovere con cura il pellet cellulare e metterlo in una provetta pulita con cinque millilitri di soluzione di tryin allo 0,05%. Quindi, digerire le cellule in una soluzione di tryin allo 0,05% in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius agitando per sette minuti, neutralizzare la tryin con 10 millilitri di mezzo di risciacquo freddo.

Dopo sette minuti di trattamento con tripsina, centrifugare le cellule per otto minuti a 356 g. Nel frattempo, bilanciare la sezione della rete TX sterilizzata sopra una provetta sterile da 15 millilitri per coltura cellulare. Dopo la centrifugazione, scartare il surnatante e risospendere delicatamente la miscela cellulare attivandola in tre millilitri.

Mezzi neuronali completi. Tutte le modifiche devono essere eseguite molto delicatamente Per evitare di generare bolle d'aria, filtrare la soluzione cellulare attraverso la rete NYX in una provetta per coltura cellulare pulita da 15 millilitri. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione per otto minuti a 356 gs.

Successivamente, rimuovere e scartare il surnatante. Risospendere le cellule in 1200 microlitri di mezzi neuronali completi. Quindi, tappare delicatamente le cellule utilizzando un puntale per pipetta di plastica da un millilitro.

Fare attenzione a non generare bolle d'aria, pipettare lentamente e delicatamente fino a quando la maggior parte dei pezzi non si rompe e le cellule sono sospese nel liquido. A questo punto, aggiungere 750 microlitri del terreno completo a ciascuno dei 12 pozzetti contenenti un vetrino di copertura in vetro precodificato. Quindi aggiungere 100 microlitri della soluzione cellulare nominale.

Incubare i neuroni in un incubatore di colture cellulari a 37 gradi Celsius con una variazione di anidride carbonica del 5%. Metà del terreno cellulare ogni due giorni. I neuroni sono pronti per le registrazioni elettrofisiologiche dopo uno o due giorni di coltura.

Qui viene mostrata la caratterizzazione immunoistochimica dei neuroni enterici. Lea isolata dal topo. La microscopia confocale muscolare longitudinale ha rivelato la colorazione neuronale specifica della tubulina beta tre nell'intera preparazione del muscolo longitudinale del Monte ileale dal topo.

E queste sono le cellule isolate dalle preparazioni LMMP, che contengono i neuroni che si sono colorati positivamente per il legame del cal e le cellule della glia di Retin mostrate qui sono state visualizzate con il marcatore specifico della glia GFAP. Tuttavia, non è stata osservata alcuna colorazione quando l'anticorpo primario è stato omesso. Qui ci sono i neuroni e la glia isolati dal muscolo longitudinale del topo che crescono in stretta vicinanza l'uno all'altro.

Le immagini al microscopio confocale indicano che i neuroni verdi e il ggl rosso crescono facilmente l'uno accanto all'altro e sembrano interagire in vitro. Questa figura mostra l'elettrofisiologia dei neuroni enterici in coltura e della CLIA in modalità current clamp. Tutti i neuroni hanno mostrato potenziali d'azione dopo l'iniezione di corrente.

I CLIA non hanno potenziali d'azione, ma mostrano grandi potenziali elettrotonici in risposta all'iniezione di corrente. I neuroni coltivati dall'ileo di topo sono una popolazione eterogenea elettrofisiologica. Nella modalità di blocco della corrente, un'iniezione di corrente di 0,09 nano ampere nei neuroni produce potenziali d'azione.

I neuroni HP negativi ritornano immediatamente al potenziale di membrana a riposo dopo la stimolazione. Mentre un HP positivo, i neuroni mostrano un A HP dopo la stimolazione in cui il potenziale di membrana a riposo scende al di sotto della linea di base prima di tornare lentamente al valore iniziale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro ore se eseguita correttamente.

Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di mantenere la vetreria e gli strumenti chirurgici il più puliti possibile. Inoltre, iterare e far bollire delicatamente le cellule e cambiare metà del terreno di coltura cellulare ogni due giorni dopo questa procedura. Metodi come l'elettrofisiologia e l'immunocitochimica possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande come il modo in cui i canali ionici nell'intestino rispondono al trattamento farmacologico e per conoscere l'espressione delle proteine nei neuroni e nel lia e come l'interazione di questi due tipi di cellule viene alterata da vari trattamenti dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della neurobiologia per esplorare le funzioni di base delle neuropatie e delle neuropatie del sistema nervoso enterico negli animali geneticamente modificati. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare i neuroni e la glia dal plesso TER del sistema nervoso enterico del topo adulto.