Micron scala Risoluzione ottica Tomografia del cervello dei topi interi con confocale Luce Foglio Microscopia
8 ottobre 2013
In questo articolo descriviamo la procedura sperimentale piena di ricostruire, con alta risoluzione, l'anatomia del cervello multa di cervello di topo fluorescente. Il protocollo descritto prevede la preparazione del campione e di compensazione, il campione di montaggio per l'imaging, i dati post-processing e la visualizzazione multi-scala.
L'obiettivo generale di questa procedura è ricostruire e visualizzare un intero cervello di topo con risoluzione su scala micrometrica. Questo risultato si ottiene innanzitutto disidratando un cervello di topo fissato, integrato in una serie tetraedrica. Il secondo passaggio consiste nel chiarificare il campione in etere benzilico.
Successivamente, il cervello viene acquisito mediante un microscopio a foglio di luce confocale. L'ultimo passaggio consiste nell'utilizzare un software per allineare e assemblare gli stack di immagini acquisiti. Infine, uno strumento di visualizzazione a risoluzione multipla può essere utilizzato per esplorare il volume dell'immagine ricostruito.
Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ad altri metodi come la microscopia confocale o la microscopia fotografica è che l'intero volume del cervello di un topo può essere immaginato in soli pochi giorni. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze, come ad esempio la distribuzione dei diversi tipi di neuroni in tutto il cervello. Questo rivestimento metallico fornisce informazioni dettagliate sull'autonomia cerebrale?
Si può applicare anche a embrioni di topo o mosche del piede, dimostrando che la procedura verrà riavviata. Una studentessa laureata del mio laboratorio. Per iniziare questo protocollo, eseguire il fissaggio standard dei cervelli di topo mediante perfusione transcardiaca e successivo fissaggio posticipato durante la notte, prima di procedere con la disidratazione e la chiarificazione.
Successivamente, poiché il solvente disidratante, THF, inibisce fortemente la fluorescenza di XFP, eseguire una filtrazione per rimuovere i perossidi mediante ossido di alluminio attivato basico utilizzando una colonna cromatografica, evitando la formazione di crepe nella colonna, che ridurrebbe l'eliminazione dei perossidi aggiungendo uno stabilizzante alla soluzione finale. Anche se il THF fosse già stato stabilizzato prima della filtrazione, lo stabilizzante verrà trattenuto dall'ossido di alluminio. Si noti che il THF privo di stabilizzante può formare elevate quantità di perossidi ed essere esplosivo e pericoloso.
Successivamente, disidratare l'intera serie integrata di cervello di topo in THF in acqua pura. Quindi, posizionare il flaconcino con il campione su una ruota rotante per evitare l'esposizione alla luce. Avvolgere il flaconcino con della carta d'alluminio.
Infine, filtrare il solvente di chiarificazione con ossido di alluminio utilizzando un imbuto da filtrazione. Quindi, chiarificare il campione in DBE al 100%, sostituendo la soluzione dopo tre e sei ore, quando il cervello appare trasparente. Di norma, un'ora dopo la seconda sostituzione del DBE, montarlo su una piastra di imaging inclinata utilizzando uno dei metodi illustrati qui.
Montaggio diretto tramite disco agros o montaggio tramite un altoparlante agro per il montaggio diretto: immergere delicatamente il campione su una delle punte per utilizzare l'immersione con disco aros. Un disco costituito da gel aros al 6% sulle punte. Quindi fissare delicatamente il campione sul disco agros con colla acrilica e attendere circa un minuto per la polimerizzazione necessaria al montaggio.
Utilizzando l'immersione del becher agros, immergere un becher fatto di gel al 3% agros sulle punte. Quindi posizionare delicatamente il campione sul fondo del becher. Dopo aver montato il campione seguendo uno di questi metodi, posizionare la piastra di imaging all'interno della camera del campione usando pinzette.
Quindi riempire la camera con la soluzione di chiarificazione. Successivamente, prepararsi per la tomografia. Per prima cosa, rimuovere la fessura per raccogliere la maggior quantità possibile di fluorescenza, quindi illuminare il campione con una bassa potenza laser.
Per evitare il fotoblecamento, spostare il campione lungo le tre direzioni x, y e z utilizzando il sistema motorizzato di micro-posizionamento controllato via software. Per ciascuna direzione, identificare le coordinate minime e massime entro cui il campione risulta illuminato mentre si trova all'interno del campo visivo della telecamera. Successivamente, inserire le coordinate determinate come parametri per la subroutine di pre-tomografia.
Specificare anche la distanza tra pile adiacenti da utilizzare nella tomografia e nel passaggio di campionamento pre-tomografia nella direzione Z. Infine, avviare il pre-tomografia, che acquisirà le immagini in ogni pila con i parametri di campionamento Z specificati nel passaggio precedente. Per iniziare l'acquisizione, spostare innanzitutto il campione al di fuori del foglio luminoso utilizzando il sistema di micro-posizionamento.
Quindi aumentare la potenza del laser e arrestare il movimento di tutti i sistemi di scansione in modo da illuminare soltanto una linea fissa al centro del campo visivo. Successivamente, montare la fessura e allinearla utilizzando il segnale di autofluorescenza proveniente dalla soluzione di chiarificazione. A questo punto si dovrebbe vedere chiaramente la linea della fessura al centro del campo visivo.
Ora riattivare il sistema di scansione. Ridurre la potenza del laser e spostare il campione all'interno del foglio luminoso utilizzando il sistema di micro-posizionamento. Si noti che la potenza del laser utilizzata con la fessura sarà superiore rispetto a quella utilizzata senza di essa.
Poiché il filtro spaziale blocca una frazione non trascurabile di luce, regolare l'ampiezza e l'offset dei sistemi di scansione e d-scansione mediante il software di controllo finché le immagini non appaiono nitide e luminose. Successivamente, impostare il passo Z appropriato per l'esperimento ed eseguire il software di acquisizione tomografica. Il volume verrà immaginato in molte pile parallele e parzialmente sovrapposte, e le immagini saranno salvate in una struttura gerarchica di cartelle.
Per consentire al software di assemblaggio di elaborare un volume cubico completo, completare il volume acquisito con immagini nere sintetiche, ovvero immagini dello stesso tipo e dimensioni di quelle raccolte, ma con intensità nulla, utilizzando un software automatizzato. Successivamente, avviare il software VA A 3D con i plugin Terra, Stitcher e Tarly installati e caricare il plugin Terra Stitcher. Selezionare la directory contenente il volume immagine e indicare le orientazioni relative degli assi rispetto a un sistema di coordinate di riferimento destrogiro e la dimensione del voxel.
Ora avvia la prima parte dell'assemblaggio. Il software calcolerà lo spostamento relativo tra coppie di stack e troverà un posizionamento ottimale complessivo per tutti gli stack contemporaneamente; seleziona se salvare il volume assemblato in formato a singola risoluzione o a risoluzioni multiple. La gerarchia consente una visualizzazione a risoluzioni multiple con il plugin tarly.
In entrambi i casi, se l'immagine ad alta risoluzione è più grande di alcuni gigabyte, selezionare anche la modalità di salvataggio multi-stack e specificare le dimensioni dei singoli sottogruppi. Questo permetterà un accesso efficiente ai dati memorizzati. Avviare ora la seconda parte dell'assemblaggio.
Il software unirà gli stack allineati e li salverà in modalità singolo stack o multi-stack. Al termine, chiudere il plugin Terra Stitcher. Successivamente, caricare il plugin terra fly.
Selezionare la cartella con il volume multistrato a risoluzione multipla e indicare le dimensioni della foxhole e l'orientamento degli assi. Il volume verrà caricato alla risoluzione minima. Per ingrandire a una risoluzione più alta, utilizzare semplicemente la rotellina del mouse.
In alternativa, si può fare doppio clic su un punto specifico dell'immagine o selezionare lo zoom attorno a un punto di riferimento esistente oppure specificare direttamente le coordinate del volume di interesse. Per tornare a una risoluzione inferiore, è sufficiente utilizzare la rotellina del mouse. Il protocollo descritto può essere utilizzato per ricostruire con risoluzione su scala micrometrica interi cervelli di topo o parti asportate, senza la necessità di sezionamento fisico.
Come risultato rappresentativo, qui viene mostrato l'intero cervelletto di un topo L7 GFP al decimo giorno postnatale. Tutti i neuroni del gene Perkin sono etichettati con EGFP. Dopo un ingrandimento, è possibile osservare la tipica struttura lamellare della corteccia cerebellare; un ulteriore ingrandimento permette di distinguere chiaramente il corpo cellulare di ogni cellula di Burkini.
Il protocollo descritto può quindi essere utilizzato per analizzare l'organizzazione spaziale neuronale in vari studi di neurosviluppo. Come secondo risultato rappresentativo, qui possiamo osservare immagini della sezione cerebrale UN di un adulto di coscia, un topo GFPM. In questo animale transgenico, EGFP viene espressa in un sottoinsieme neuronale sparso e casuale.
Viene mostrata qui la metà destra del cervello. Procedendo con ingrandimenti sempre maggiori, i processi neuronali diventano distinguibili. Questo risultato dimostra che il protocollo descritto consente l'acquisizione di immagini con risoluzione su scala micrometrica in cervelli interi di topo adulti, aprendo la possibilità di studiare l'anatomia dell'intero cervello a risoluzione cellulare.
In modelli murini di malattie neurodegenerative, una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in tre o quattro giorni se realizzata correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di filtrare adeguatamente la soluzione di disidratazione e pulizia per preservare la fluorescenza di GFP. Lo strumento di visualizzazione multirisoluzione presentato qui può essere utilizzato anche per esplorare set di dati molto ampi ottenuti con altre tecniche, come la sezione ottica microscopica in tomografia.
Dopo aver guardato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come datare, valutare e chiarire il cervello fisso del topo. Immaginarlo mediante microscopia a foglio confocale e visualizzare il volume ricostruito in 3D con realtà virtuale utilizzando il plugin Tely.
Panoramica
Questo articolo descrive un protocollo dettagliato per ricostruire l'anatomia cerebrale fine di cervelli di topo marcati fluorescentemente con alta risoluzione. La procedura comprende la preparazione del campione, la chiarificazione, l'acquisizione di immagini e l'elaborazione successiva dei dati.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Neuroscienze
- Tecniche di Imaging
- Anatomia del Cervello
Sfondo
- Comprendere la struttura del cervello è fondamentale per la ricerca in neuroscienze.
- La marcatura fluorescente consente una visualizzazione dettagliata dell'anatomia cerebrale.
- Tecniche di imaging ad alta risoluzione possono rivelare la distribuzione dei tipi neuronali.
- Questo metodo può essere applicato anche ad altri campioni, come embrioni di topo.
Scopo dello studio
- Sviluppare un protocollo per l'acquisizione di immagini ad alta risoluzione del cervello di topo.
- Facilitare lo studio della distribuzione neuronale in tutto il cervello.
- Fornire un metodo più rapido delle tecniche di imaging tradizionali.
Metodi Utilizzati
- Disidratazione di cervelli di topo fissati utilizzando THF.
- Chiarificazione dei campioni in etere benzilico per ottenere trasparenza.
- Acquisizione di immagini mediante microscopio confocale a foglio di luce.
- Assemblaggio e allineamento dei dati mediante software specializzato.
Risultati principali
- Il protocollo consente l'acquisizione di immagini di interi cervelli di topo in pochi giorni.
- È possibile ricostruire e visualizzare immagini ad alta risoluzione.
- Il metodo fornisce informazioni dettagliate sull'anatomia cerebrale fine.
- Permette l'esplorazione dei tipi neuronali e della loro distribuzione.
Conclusioni
- Questa tecnica di imaging migliora in modo significativo lo studio dell'anatomia cerebrale.
- È applicabile a vari campioni biologici oltre ai cervelli di topo.
- Il protocollo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nelle neuroscienze.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Metodo
L'imaging cerebrale ad alta risoluzione consente la validazione degli obiettivi e la riduzione dei rischi meccanicistici nella scoperta di farmaci per le neuroscienze, fornendo un contesto spaziale su scala micrometrica per i fenotipi neuronali. Questa capacità sostiene una maggiore affidabilità predittiva negli studi sull'interazione con l'obiettivo e sul meccanismo d'azione a livello di circuiti. Il metodo accelera la caratterizzazione dei modelli preclinici e l'allineamento dei biomarcatori traslazionali nello sviluppo di terapie per il sistema nervoso centrale.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Target
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche mediante la mappatura dell'intero cervello di popolazioni neuronali marcate con fluorescenza.
- Valore operativo: Fornisce una riduzione del rischio biologico visualizzando l'interazione con il bersaglio e gli effetti fuori bersaglio su tutta l'architettura cerebrale integra.
- Valore predittivo: Supporta la selezione del portafoglio generando dati spaziali quantitativi sulla distribuzione neuronale e sulla modulazione dei percorsi.
Sviluppo di Screening e Saggi
- Valore scientifico: Prepara sistemi biologici validati e trasparenti per flussi di lavoro standardizzati e riproducibili basati su imaging.
- Valore operativo: Consente la prontezza del saggio mediante imaging ad alto contrasto e risoluzione micrometrica di campioni integri.
- Scalabilità: Favorisce il riutilizzo della piattaforma grazie a strumenti software open source per l'assemblaggio e la navigazione multirisoluzione di set di dati su scala terabyte.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Continuità Translazionale: Collega la mappatura neuronale nella fase di scoperta alla validazione preclinica attraverso modelli cerebellari e cerebrali completi pertinenti alle malattie.
- Avanzamento Basato sul Rischio: Supporta decisioni di avanzamento o interruzione visualizzando fenotipi neurodegenerativi in cervelli intatti di topi adulti con risoluzione cellulare.
- Riduzione del Rischio Meccanicistico: Permette l'esplorazione dell'organizzazione spaziale neuronale nei modelli di sviluppo neurologico e di malattia senza la necessità di sezione fisica.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si integra nel percorso di scoperta, dalla verifica dell'ipotesi sul bersaglio fino all'identificazione del composto promettente e alla validazione preclinica, fornendo dati neuroanatomici quantitativi con risoluzione spaziale.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi mediante l'immagine dell'intero cervello di sottoinsiemi neuronali marcati con EGFP in modelli transgenici.
- Screening: Garantisce prontezza e riproducibilità del saggio attraverso l'immagine confocale con foglio luminoso di campioni trasparenti con minima fotodegradazione.
- Analisi: Produce dati quantitativi a multi-risoluzione che permettono il confronto della distribuzione e della morfologia neuronale tra diverse condizioni sperimentali.
- Ricerca traslazionale: Si collega alla continuità preclinica tramite l'immagine di modelli rilevanti per le malattie, come i topi L7-GFP e thy1-GFP-M.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce una capacità di imaging riutilizzabile mediante protocolli standardizzati di trasparenza, montaggio ed elaborazione software per la composizione delle immagini.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Affidabilità predittiva nella validazione degli obiettivi grazie all'imaging a risoluzione micrometrica di volumi cerebrali interi.
- Valore operativo: Standardizzazione e riproducibilità mediante filtrazione dei solventi, protocolli di chiarificazione e flussi di lavoro automatizzati per l'assemblaggio delle immagini.
- Valore strategico: Miglioramento delle decisioni di avanzamento o interruzione dei progetti grazie alla riduzione del rischio biologico in fase avanzata nei programmi sul sistema nervoso centrale mediante una de-risking fenotipica precoce.
- Impatto sul portafoglio: Prioritizzazione aggiustata per il rischio resa possibile dal mappaggio dell'intero cervello dei tipi neuronali e dei modelli di proiezione.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nel chiarimento dei tessuti, nella microscopia a fluorescenza e nella gestione di dati tridimensionali di immagini.
- È dipendente da sistemi microscopici a foglio di luce confocale e da calcolo ad alte prestazioni per la gestione di dataset su scala terabyte.
- Necessita di una standardizzazione intersettoriale delle procedure di disidratazione, chiarimento e montaggio per preservare la fluorescenza di GFP.
- Comprende considerazioni di adattamento per diverse etichette fluorescenti e solventi per il chiarimento in diversi sistemi modello.
- Incorpora limitazioni pratiche, come la formazione di perossidi nel THF, che richiede filtrazione per prevenire l'oscuramento della fluorescenza e potenziali rischi per la sicurezza.
