Name: Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dellesonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 10 s
Description: Scopri un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per studiare l'attività enzimatica di DmWRNexo e altre nucleasi. Questo metodo riproducibile e sicuro consente di analizzare le preferenze di substrato e le condizioni di reazione.

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Ringraziamo il programma trasversale New Dynamics of Ageing per aver finanziato questo lavoro [ES/G037086/1] e il Prof. Dave Sherratt (Dipartimento di Biochimica, Università di Oxford) per l'accesso al Fuji FLA-3000.

<ol><li>Mason, P. A., Cox, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+DNA+exonucleases+in+protecting+genome+stability+and+their+impact+on+ageing%5BTitle%5D)+AND+%22Age+%28Dordr%22%5BJournal%5D)">The role of DNA exonucleases in protecting genome stability and their impact on ageing.</a> Age (Dordr. 34, 1317-1340 (2012).</li>
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<li>Cox, L. S., Clancy, D. J., Boubriak, I., Saunders, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modeling+Werner+Syndrome+in+Drosophila+melanogaster%3A+hyper-recombination+in+flies+lacking+WRN-like+exonuclease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Modeling Werner Syndrome in Drosophila melanogaster: hyper-recombination in flies lacking WRN-like exonuclease.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 1119, 274-288 (2007).</li>
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<li>Machwe, A., Xiao, L., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Length-dependent+degradation+of+single-stranded+3%27+ends+by+the+Werner+syndrome+protein+%28WRN%29%3A+implications+for+spatial+orientation+and+coordinated+3%27+to+5%27+movement+of+its+ATPase%2Fhelicase+and+exonuclease+domains%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Length-dependent degradation of single-stranded 3' ends by the Werner syndrome protein (WRN): implications for spatial orientation and coordinated 3' to 5' movement of its ATPase/helicase and exonuclease domains.</a> BMC Mol. Biol. 7, 6 (2006).</li>
<li>Mangerich, A., Veith, S., Popp, O., Fahrer, J., Martello, R., Bohr, V. A., Burkle, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+analysis+of+WRN+exonuclease+activity+by+isotope+dilution+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Mech.+Ageing+Dev%22%5BJournal%5D)">Quantitative analysis of WRN exonuclease activity by isotope dilution mass spectrometry.</a> Mech. Ageing Dev. 133, 575-579 (2012).</li>
<li>Xue, Y., Ratcliff, G. C., Wang, H., Davis-Searles, P. R., Gray, M. D., Erie, D. A., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+minimal+exonuclease+domain+of+WRN+forms+a+hexamer+on+DNA+and+possesses+both+3%27-+5%27+exonuclease+and+5%27-protruding+strand+endonuclease+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Biochemistry%22%5BJournal%5D)">A minimal exonuclease domain of WRN forms a hexamer on DNA and possesses both 3'- 5' exonuclease and 5'-protruding strand endonuclease activities.</a> Biochemistry. 41, 2901-2912 (2002).</li>
<li>Machwe, A., Ganunis, R., Bohr, V. A., Orren, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+blockage+of+the+3%27--%3E5%27+exonuclease+activity+of+WRN+protein+by+certain+oxidative+modifications+and+bulky+lesions+in+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Selective blockage of the 3'-->5' exonuclease activity of WRN protein by certain oxidative modifications and bulky lesions in DNA.</a> Nucleic Acids Res. 28, 2762-2770 (2000).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La determinazione dell'attività esonucleasica delle proteine purificate richiede l'analisi dei prodotti di scissione del DNA. La scissione sequenziale del DNA da parte delle esonucleasi può essere visualizzata mediante la separazione dei prodotti di scissione marcati su gel di acrilammide. Storicamente ciò comportava la marcatura finale del substrato di DNA con un radiomarcatore (ad esempio 32P o 35S), ma con gli svantaggi inerenti all'uso del radiomarcatore (costo, problemi di sicurezza e ...

Le nucleasi svolgono un ruolo vitale nelle cellule nella rimozione del DNA danneggiato, nella risoluzione di strutture non duplex come le giunzioni di Holliday e nel fornire capacità di correzione delle bozze durante la replicazione del DNA, sia intrinseca all'interno delle DNA polimerasi che estrinseca ad esse1. Le nucleasi possono agire degradando sequenzialmente il DNA dalle estremità libere (esonucleasi) o scindendo i legami fosfodiestere interni all'interno di una molecola di DNA più lunga (endonucleasi). La perdita dell'attività della nucleasi può provocare fenotipi di instabilità del genoma altamente specifici. Mentre la mutazione del membro della famiglia dell'elicasi RecQ BLM provoca tassi eccessivamente elevati di scambio di cromatidi fratelli e tassi di cancro elevati a livello globale (rivisto da Payne e Hickson2), la mutazione della proteina WRN altamente correlata porta all'invecchiamento precoce3; la principale differenza significativa tra questi due membri della famiglia è la presenza di un dominio esonucleasico 3'-5' con in WRN4. L'evidenza di un ruolo critico dell'esonucleasi WRN nel mantenimento della stabilità del genoma si è accumulata dall'analisi dei genotipi nei pazienti con WS5, insieme a studi di mutazione puntiforme e delezioni in cellule umane, supportati da studi cristallografici del dominio esonucleasicoisolato 6. Tuttavia, la cooperazione e il dialogo incrociato tra l'attività esonucleasica di WRN e la sua attività centrale dell'elicasi7 rendono difficile separare la funzionalità di ciascuna e i loro contributi relativi alla stabilità del genoma. Nelle piante e negli animali con metazoi inferiori, l'attività esonucleasica WRN è presente su un singolo polipeptide privo di attività elicasica8-10 (rivisto in Cox e Boubriak11); è stato dimostrato biochimicamente in Arabidopsis che questa esonucleasi agisce in modo coordinato con l'affine, WRN elicasi, ricostituendo efficacemente le attività enzimatiche combinate osservate nel vertebrato WRN9. Abbiamo studiato l'esonucleasi WRN in Drosophila poiché gli eccellenti strumenti genetici consentono l'analisi dell'impatto della mutazione dell'esonucleasi (senza influire sulla presunta elicasi affine) a livello dell'intero organismo e attraverso lo sviluppo10,12. Inoltre, abbiamo clonato, espresso e purificato l'esonucleasi ricombinante Drosophila WRN (DmWRNexo) consentendo un'analisi biochimica completa delle sue proprietà enzimatiche13,14.
L'analisi della nucleasi in vitro è stata tradizionalmente condotta utilizzando oligonucleotidi radiomarcati, valutando la degradazione cercando il laddering dei prodotti su gel di acrilammide4,8,15. Sebbene sensibili, tali saggi non sono riproducibili quantitativamente giorno per giorno a causa del decadimento radioattivo dei substrati marcati. Inoltre, la manipolazione e lo smaltimento dei reagenti radioattivi pongono notevoli problemi ambientali e sanitari; Anche l'approvvigionamento di radiolabel sta diventando sempre più problematico. Un metodo alternativo recente valuta la quantità del prodotto di degradazione finale mediante spettrometria di massa16. Tuttavia, richiede molto tempo (richiede diversi giorni), richiede attrezzature specializzate e la lettura è la quantità di prodotto finale (singolo nucleotide), quindi non è adatta per la misurazione sensibile di aspetti come la processività enzimatica o per determinare se alcuni nucleotidi, sequenze o modifiche portano alla pausa o all'arresto della nucleasi. Per superare questi problemi, abbiamo adattato i tradizionali saggi basati su gel per l'uso con substrati oligonucleotidici fluorescenti, generando substrati stabilmente marcati che possono essere utilizzati in modo riproducibile per lunghi periodi di tempo e quindi consentono il confronto diretto delle attività nucleasici in diverse condizioni.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Oligonucleotidi personalizzati</td><td>Eurogentec</td><td></td><td>È necessario ottenerli ad alta purezza es. con purificazione PAGE.</td></tr><tr><td></td><td></td><td>5'FLO</td><td>fluoresescein-5' GAACTATGGCTCTC GAGTGCTAGGACATGTCTGA CTACGTACAAGTCACC - 3'bubble</td></tr> <tr><td></td><td></td><td></td><td>5'- GGTGACTTGTACGT AGTCAGACATGTCCTAGCAC TCGAGAGCCATAGTTC-3'40</td></tr><tr><td>% 19:1 Soluzione di acrilammide</td><td>Severn Biotech</td><td>20-2400-05</td><td>ATTENZIONE: potente neurotossina, quindi i guanti devono essere indossati sempre</td></tr><tr><td>Colonne His-Trap (1 ml)</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5247-01</td><td></td></tr><tr><td>Tutti gli altri reagenti</td><td>di qualsiasi fornitore</td><td></td> affidabile <td>È necessario un grado di biologia molecolare (privo di DNasi); allo stesso modo, le provette per microfugi devono essere prive</td> di DNasi e RNasi</tr><td colspan="4">EquipmentHoefer SE400 apparecchio gel Hoefer SE400-15-1.5 FLA-3000 (fosforo e fluorescenza <tr></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Fuji</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Image Reader V2.02</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Image Gauge V3.3</td><td>FujiFilm</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare dmwrnexo, ortologo dell'esonucleasi wrn progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

A Fluorescence-based Exonuclease Assay to Characterize DmWRNexo, Orthologue of Human Progeroid WRN Exonuclease, and Its Application to Other Nucleases

WRN l'esonucleasi è coinvolta nella risoluzione del danno al DNA che si verifica durante la replicazione del DNA o in seguito all'esposizione a genotossine endogene o esogene. È probabile che svolga un ruolo nella prevenzione dell'accumulo di intermedi ricombinogenici che altrimenti si accumulerebbero alle forcelle di replicazione transitoriamente bloccate, coerentemente con un fenotipo iper-ricombinante di cellule prive di WRN. Nell'uomo, il dominio esonucleasico comprende una porzione N-terminale di una proteina molto più grande che possiede anche attività elicasica, insieme a siti aggiuntivi importanti per l'interazione tra DNA e proteine. Al contrario, in Drosophila, l'attività esonucleasica di WRN (DmWRNexo) è codificata da un locus genetico distinto dalla presunta elicasi, consentendo la dissezione biochimica (e genetica) del ruolo dell'attività esonucleasica nei meccanismi di stabilità del genoma. Qui, dimostriamo un metodo fluorescente per determinare l'attività dell'esonucleasi WRN utilizzando DmWRNexo ricombinante purificato e oligonucleotidi fluorescenti marcati all'estremità. Questo sistema consente una maggiore riproducibilità rispetto ai saggi radioattivi, poiché gli oligonucleotidi del substrato rimangono stabili per mesi, e fornisce un metodo più sicuro e relativamente rapido per l'analisi dettagliata dell'attività della nucleasi, consentendo di determinare la polarità, la processività e le preferenze del substrato della nucleasi.

L'analisi in vitro dell'attività esonucleasica richiede diverse fasi preparatorie oltre all'analisi vera e propria. Una panoramica delle procedure è mostrata nella Figura 1.
Prima di eseguire saggi di esonucleasi basati sulla fluorescenza, è fondamentale ottimizzare il rilevamento dell'oligonucleotide marcati fluorescentemente dopo la separazione su gel di urea-acrilamide, utilizzando un sistema di imaging fluorescente adeguato. La scelta del filtro è estremamente imp...

Le esonucleasi svolgono un ruolo fondamentale nel garantire la stabilità del genoma. La perdita della funzione dell'esonucleasi WRN provoca un invecchiamento precoce. Lo studio dei substrati e di altri requisiti della nucleasi in vitro può aiutare a chiarire il suo ruolo in vivo. Qui dimostriamo un saggio rapido e riproducibile basato sulla fluorescenza per misurare la sua attività nucleasica.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

WRN exonuclease is involved in resolving DNA damage that occurs either during DNA replication or following exposure to endogenous or exogenous genotoxins. ...

Questo esperimento utilizza un saggio basato sulla fluorescenza robusto e riproducibile per determinare l'attività esonucleasica. Incubare l'enzima purificato con il substrato di DNA fluorescente per consentire all'enzima di degradare in modo sequenziale il DNA. Successivamente, risolvere il DNA su un gel di acrilamide-urea per separare i prodotti di degradazione in base alle dimensioni.Successivamente, utilizzare l'immagine di fluorescenza per identificare e quantificare il grado di attività esonucleasica. I risultati analizzati possono determinare le condizioni di reazione del substrato preferite, nonché l'attività processiva e complessiva dell'enzima. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto alle tecniche esistenti basate sulla radioattività è che i substrati di DNA sono stabili per un lungo periodo, consentendo un'elevata riproducibilità, una riduzione dei costi e un aumento della sicurezza.Per prima cosa, aggiustare il lisato batterico a 20 millimolar ole, utilizzando un volume appropriato di soluzione stock di due molar emit ole. Successivamente, aggiustare il volume ad almeno un millilitro utilizzando ole wash 20 millimolar, una colonna hist trap da un millilitro con 10 millilitri di acqua milli Q. Quindi, equilibrare la colonna con 10 millilitri di ole 20 millimolar.Successivamente, caricare il lisato sulla colonna: durante il caricamento del lisato sulla colonna, potrebbe verificarsi una notevole pressione retrostante. Questo fenomeno è perfettamente normale. Evitare di applicare una forza eccessiva sulla siringa e mantenere una pressione costante e uniforme.È normale osservare un lieve cambiamento di colore quando il lisato entra nella colonna. Raccogliere il flusso in uscita in una bottiglia sterile da sette millilitri e conservare sul ghiaccio. Successivamente, lavare la colonna con 10 millilitri di emit ole 20 millimolari.Ora fai passare cinque millilitri di iole 40 millimolari attraverso la colonna. Osserva attentamente lo stantuffo della siringa per misurare le frazioni di un millilitro che vengono raccolte in ciascuna delle provette microcentrifuga. Analogamente e in sequenza, fai passare cinque millilitri di ciascuna concentrazione di iole attraverso la colonna e raccogli ogni volta cinque frazioni da un millilitro ciascuna.Analizzare le frazioni mediante dot blot e rivelazione con un anticorpo anti-his coniugato con perossidasi (HRP). Per identificare le frazioni corrispondenti al picco. Mantenere tutti i reagenti a quattro gradi Celsius, aliquotare la miscela madre in provette Microfuge sterili e prive di DNA da 0,5 millilitri; includere anche un controllo senza enzima per visualizzare il substrato iniziale.Ora impostare un blocco termico alla temperatura appropriata per l'attività enzimatica. Preparare un IDE contenente soluzione di arresto e conservarlo a temperatura ambiente. Organizzare lo spazio di lavoro vicino al blocco termico, inclusi i reagenti finali da aggiungere alla reazione.Utilizzare una pipetta da uno a dieci microlitri con puntali, un timer, un rack criogenico o un secchiello con ghiaccio e la soluzione di arresto. Avviare il timer dopo l'aggiunta dell'enzima al primo tubo e posizionare il tubo nel blocco termico. Continuare ad aggiungere l'enzima ai restanti tubi a intervalli di 15 secondi e posizionare i tubi nel blocco termico quando il timer raggiunge il momento corretto.Aggiungere 10 microlitri di soluzione di arresto al primo campione e mescolare mediante pipettaggio. Posizionare immediatamente sul ghiaccio. Continuare ad arrestare le reazioni agli intervalli di tempo appropriati e nello stesso ordine in cui sono state avviate, in modo che ogni reazione abbia esattamente lo stesso tempo di incubazione. Caricare metà o la totalità di ciascun campione su un gel di acrilamide. Inserire una x di soluzione di arresto contenente colorante in una o più corsie per verificare il corretto avanzamento del gel.Dopo l'elettroforesi, rimuovere le distanziali e una delle lastre del gel. Sciacquare e asciugare con cura la lastra del gel per eliminare eventuali tracce di urea precipitata. Posizionare la lastra con il gel rivolto verso il basso sulla superficie di vetro del supporto per gel e inserirla nell'immaginatore, se necessario.Prendere nota delle coordinate del gel sul vetro. Aprire il software appropriato e scansionare la regione indicata dell'area di scansione utilizzando le condizioni descritte nel protocollo testuale. Ritagliare l'immagine e comprimere i dati.Se necessario, salvare ed esportare come file per l'analisi. L'esecuzione dell'analisi in vitro dell'attività esonucleasica richiede diverse fasi preparatorie. Oltre all'analisi vera e propria per questi saggi di esonucleasi basati sulla fluorescenza, è fondamentale ottimizzare il rilevamento del sistema di imaging a fluorescenza.Ad esempio, un substrato di oligonucleotide marcato con fluoresceina richiede un filtro che permetta l'eccitazione a 470 nanometri e l'emissione a 520 nanometri. Utilizzando questo filtro, è possibile aumentare la capacità di rilevare basse concentrazioni di substrato o prodotto regolando sia la sensibilità che la risoluzione dell'apparecchio di imaging. Si noti che esiste una certa tolleranza in termini di larghezza di banda del filtro.Poiché una scelta subottimale del filtro consente comunque una rilevazione parziale del substrato, sebbene con sensibilità molto ridotta. Una combinazione appropriata tra concentrazione dell'oligonucleotide marcato e impostazioni dell'apparecchio di rilevamento può portare a una rilevazione robusta del substrato. Ciò è importante poiché i prodotti di degradazione ottenuti dopo incubazione con un'esonucleasi attiva saranno presenti in quantità inferiori in ciascuna banda, in quanto il substrato è stato frammentato in modo sequenziale.Un saggio di esonucleasi riuscito provocherà la degradazione del substrato in modo sequenziale verso la flora. Quattro, generando un tipico profilo a scala di DNA sul gel rappresentativo della degradazione da parte di esonucleasi. Una volta ottimizzato per il rilevamento, il saggio può essere utilizzato per rilevare attività differenziali sia in modo qualitativo che quantitativo.Ad esempio, è possibile determinare la presenza o l'assenza di attività per mutanti della nucleasi rispetto alla proteina di tipo selvaggio. Possono essere inoltre testati diversi substrati per verificare la loro degradabilità da parte della nucleasi. In corso di studio.Questo saggio in vitro può essere utilizzato per verificare la specificità del substrato e il processo di una nucleasi di interesse.

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Un saggio basato sulla fluorescenza con esonucleasi per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi umana Progeroid WRN, e la sua applicazione ad altre nucleasi

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Questo studio presenta un saggio FRET raziometrico semplice e di facile utilizzo per il rilevamento e la valutazione quantitativa dell'attività della DNasi e dimostra la sua applicazione nell'analisi di una nucleasi debole.

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Questo protocollo descrive un saggio biochimico gel shift per misurare l'attività di FEN1 (Flap Endonuclease 1) e lo sviluppo di inibitori.

Rilevamento basato sulla fluorescenza dell'attività della nucleasi FEN1 e screening di inibitori di piccole molecole

Scopri un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per studiare l'attività enzimatica di DmWRNexo e altre nucleasi. Questo metodo riproducibile e sicuro consente di analizzare le preferenze di substrato e le condizioni di reazione.

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dellesonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi (Video) | JoVE Journal

Un saggio di esonucleasi basato sulla fluorescenza per caratterizzare DmWRNexo, ortologo dell'esonucleasi WRN progeroide umana, e la sua applicazione ad altre nucleasi

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