Multiplex fluorescente Microarray per salivare umana Protein Analysis Utilizzando polimerici Microsfere e fasci di fibre ottiche
October 10th, 2013
Descriviamo una procedura per la profilatura proteine salivari utilizzo di matrici di anticorpi a base di microsfere-multiplex. Gli anticorpi monoclonali sono stati legati covalentemente a colorante fluorescente con codifica 4.5 micron microsfere polimeriche utilizzando la chimica carbodiimmide. Le microsfere modificati sono stati depositati in pozzetti in fibra ottica per misurare i livelli di proteine nella saliva mediante saggi immunologici panino fluorescenza.
L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare più proteine in campioni di saliva umana utilizzando array fluorescenti basati su microsfere. Innanzitutto, codificare le microsfere con diverse quantità di due coloranti fluorescenti. Accoppiare gli anticorpi di cattura per diverse proteine sulle microsfere codificate.
Quindi assemblare il microarray proteico multiplexato sul fascio di fibre ottiche utilizzando i saggi immunologici a sandwich sul saggio di microarray assemblato per più proteine nei campioni di saliva del test. In definitiva, l'analisi mediante microscopia a fluorescenza può misurare le risposte al segnale di diverse proteine nei campioni di saliva. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come quello di Eliza è che consente l'analisi simultanea di più proteine in biofluidi complessi.
Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'analisi della saliva umana, può essere applicato anche ad altre bioinfluenze come il siero, l'urina e l'espettorato. Pesare il TTA da oppio in un flaconcino di vetro ambrato e preparare una soluzione madre da 200 millimolari in tetra hydro furin. Miscelare delicatamente mediante pipettaggio e verificare visivamente che il colorante sia completamente disciolto.
Allo stesso modo, preparare una soluzione madre da 12 millimolari di cumarina 30 miscelata delicatamente mediante pipettaggio. Visualmente. Verificare che la D sia completamente disciolta in sospensione da vortice a microsfera, quindi trasferire 60 microlitri in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Per lavare le microsfere, aggiungere 600 microlitri di PBS miscelato pipettando 20 volte e centrifugare a 10.000 RPM per tre minuti.
Dopo tre lavaggi con la soluzione di tetra idrofurina, rimuovere il surnatante, risospendere il palato in 600 microlitri di soluzione di lavoro e trasferire la miscela in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri. Sigillare la provetta per microcentrifuga con pellicola para e posizionarla su uno shaker. Proteggerlo dalla luce coprendolo con un foglio di alluminio.
Aggiungere 200 microlitri di sospensione di microsfere codificate in una provetta per microcentrifuga da 1,5 millilitri. Aggiungere goccia a goccia 150 microlitri, una soluzione EDC appena preparata Aggiungere immediatamente 150 microlitri di soluzione sulfamidica NHS. Mescolare bene mediante pipettaggio e verificare che la sospensione sia omogenea.
Tappare il tubo, sigillarlo con paraform e posizionarlo su uno shaker. Proteggerlo dalla luce coprendolo con un foglio di alluminio. Dopo tre lavaggi di reus tampone P-B-S-S-D-S, sospendere il pellet in 200 microlitri di miscela tampone P-B-S-S-D-S s.
Bene, quindi trasferire la soluzione in 300 microlitri di tampone P-B-S-S-D-S contenente 60 microgrammi di anticorpi di cattura. Mescola 50 microlitri di ogni tipo di microsfere di cattura delle proteine in una nuova provetta per microcentrifuga in autoclave. Centrifugare la vasca di microsfere stock a 7.000 giri/min per tre minuti e rimuovere tutti i microlitri di surnatante tranne 100
.Ora i fasci di fibre ottiche tagliati a mano a circa cinque centimetri di lunghezza, lucidano in sequenza entrambe le estremità utilizzando pellicole diamantate. Quindi sonicare il fascio lucidato in acqua deionizzata per due minuti. Per rimuovere eventuali particelle, inserire una piccola barra di agitazione magnetica in una provetta da microcentrifuga da 0,5 millilitri.
Aggiungere 400 microlitri di tampone PBS senza proteine e mescolare su una piastra magnetica per 30 minuti. Per rimuovere le bolle d'aria, incidere un'estremità del fascio di fibre lucidate in una soluzione di cloruro di idrogeno normale 0,025 per 150 secondi. Immergere e sonicare immediatamente l'N inciso in acqua deionizzata per un minuto.
Quindi asciugare i fasci di fibre con aria compressa, montare il fascio di fibre su un supporto per fibre e bloccare l'estremità incisa nel tampone PBS privo di proteine senza bolle per un'ora, depositare un quad ALI da un microlitro della sospensione di microsfere immagazzinata sull'estremità incisa del fascio di fibre ottiche. Proteggi l'impianto dalla luce con una scatola avvolta con un foglio di alluminio. Dopo 15 minuti, il volume della sospensione diminuirà per evaporazione e costringerà le microsfere nei micro pozzetti incisi.
Utilizzare un tampone imbevuto di soluzione campione per rimuovere le microsfere che non sono intrappolate nei micro pozzetti. Per rendere il microarray proteico pronto per l'uso, aggiungere 200 microlitri di soluzione campione in una provetta per microcentrifuga per autoclave da 0,5 millilitri. Immergere il microarray proteico caricato sulla fibra nella soluzione e posizionarlo su uno shaker.
Proteggere dalla luce coprendolo con un foglio di alluminio. Quindi, immergere il microarray di proteine in una nuova provetta per microcentrifuga per autoclave contenente 200 microlitri di tampone di lavaggio e agitare a 600 giri/min per due minuti. Ora incubare il microarray in una soluzione da 100 microlitri di un cocktail di anticorpi di rilevamento contenente anticorpi di rilevamento biotinilati e un tampone bloccante A PBS per 30 minuti.
A temperatura ambiente al buio, pulire l'estremità distale del fascio di fibre con un tampone imbevuto di etanolo assoluto. Quindi asciugare entrambe le estremità della fibra con aria compressa, montare la fibra su un microscopio epifluorescente e acquisire immagini attraverso l'estremità distale della fibra, acquisire le immagini della microsfera corrispondenti alle intensità di emissione di oppio TTAC 30 e fluorescente SAP. Le immagini di codifica di sette tipi di microsfere sono mostrate qui.
Nell'immagine di codifica UTTA si osservano due livelli di intensità, che stanno per microsfere codificate con diverse quantità di die UTTA Risultati simili si osservano nell'immagine di codifica C 30. L'analisi delle immagini MATLAB consente di calcolare le intensità di fluorescenza di diverse microsfere nell'immagine del segnale. I risultati della decodifica sono mostrati nella figura 2D sette.
Diverse microsfere vengono decodificate con successo. Le microsfere non mostrano alcuna risposta quando incubate con tampone di saggio. Quando incubato con campioni di saliva umana, si osservano risposte fluorescenti significative.
Per un migliore confronto, i contrasti in queste due cifre sono stati adeguati allo stesso livello. Una volta padroneggiato, questo metodo consente l'analisi riproducibile di diverse proteine nei campioni di saliva umana. Vengono mostrati i risultati di tre rilevamenti indipendenti sullo stesso campione.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un microraggio proteico multiplex basato su microsfere e utilizzarlo per l'analisi di biofluidi complessi. Seguendo questa procedura. Possono essere analizzati anche altri biomarcatori proteici in diversi biofluidi complessi.
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Panoramica
Questo articolo descrive una procedura per la profilazione delle proteine salivari utilizzando array di anticorpi multiplex basati su microsfere. Il metodo consente l'analisi simultanea di molteplici proteine in campioni di saliva umana, migliorando le capacità dei test tradizionali.
Componenti principali dello studio
Area della scienza
- Neuroscienze
- Biotecnologia
- Proteomica
Contesto
- La saliva contiene una varietà di proteine che possono fornire informazioni sulla salute e sulla malattia.
- I metodi tradizionali come l'ELISA sono limitati all'analisi di una proteina alla volta.
- I test multiplex possono migliorare l'efficienza e la ricchezza dei dati.
- La tecnologia delle microsfere fluorescenti offre un approccio innovativo per il rilevamento delle proteine.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per analizzare contemporaneamente molteplici proteine nella saliva.
- Migliorare la sensibilità e la specificità del rilevamento delle proteine nei biofluidi complessi.
- Fornire un'alternativa più efficiente agli attuali test per singolo analito.
Metodi utilizzati
- Codifica delle microsfere con coloranti fluorescenti.
- Collegamento covalente degli anticorpi di cattura alle microsfere.
- Assemblaggio di microarray proteici multiplex su fasci ottici.
- Utilizzo di immunodosaggi sandwich fluorescenti per rilevare le proteine nei campioni di saliva.
Principali risultati
- Il metodo ha rilevato con successo molteplici proteine nei campioni di saliva.
- La microscopia a fluorescenza ha fornito chiare risposte del segnale per diverse proteine.
- La tecnica ha dimostrato vantaggi rispetto ai tradizionali metodi ELISA.
- I risultati indicano potenziali applicazioni nella diagnostica clinica.
Conclusioni
- Questo approccio multiplex consente un'analisi efficiente delle proteine salivari.
- Il metodo potrebbe facilitare una migliore comprensione di varie condizioni di salute.
- Studi futuri potrebbero espandere l'applicazione di questa tecnica in altri biofluidi.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Multiplexed protein analysis in complex biofluids like saliva addresses a critical bottleneck in biomarker discovery, where traditional single-plex assays limit throughput and increase sample consumption. This microsphere-based fiber-optic array enables simultaneous quantification of multiple salivary proteins, improving assay efficiency and supporting early-stage target validation in neurodegenerative and inflammatory disease research. By providing quantitative, reproducible readouts from limited clinical samples, the method enhances predictive confidence in lead identification and preclinical de-risking workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by measuring multiple salivary protein biomarkers simultaneously in disease-relevant samples.
- Operational Value: Reduces sample volume requirements and assay timelines through parallel protein detection in a single workflow.
- Predictive Value: Supports biomarker panel development and functional target validation by correlating multi-analyte responses with phenotypic outcomes.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates standardized, quantitative fluorescence readouts for six proteins using encoded microspheres, enabling reproducible assay performance across runs.
- Operational Value: Facilitates assay standardization via fiber-optic bundle immobilization and automated decoding algorithms, reducing user-dependent variability.
- Scalability: Supports platform reuse for other biofluids (serum, urine, sputum) as noted in the transcript, extending utility beyond saliva.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by providing clinically relevant salivary protein data that can inform mechanistic models.
- Mechanistic De-risking: Enables pathway-level analysis through multiplexed detection, reducing ambiguity in target engagement and biological response assessments.
- Predictive Confidence: Delivers quantitative, fluorescence-based signal responses that support go/no-go decisions in early preclinical advancement.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from early target validation through assay development to preclinical mechanistic studies, particularly for biomarker-driven programs in neurology and inflammation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling simultaneous measurement of multiple salivary proteins linked to disease states.
- Screening: Delivers assay readiness through standardized microsphere encoding, fiber-optic array assembly, and fluorescence-based quantification compatible with high-content imaging.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements (fluorescence intensity per microsphere type) that allow comparison across experimental conditions and sample groups.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity via disease-relevant salivary biomarkers that reflect systemic or local pathophysiological processes.
- Enterprise Reuse: Encodes a adaptable microsphere-based platform applicable to multiple complex biofluids, supporting cross-project standardization and reagent sharing.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation through multiplexed, quantitative protein detection in native biofluids.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fiber-optic immobilization and algorithmic decoding, reducing technical noise.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by maximizing data yield per sample and enabling reuse across biomarker programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization by delivering multi-analyte profiles that inform mechanistic and safety-related decision-making.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsphere encoding, antibody conjugation, and fluorescence microscopy for successful assay setup and optimization.
- Dependent on fluorescence microscopy and MATLAB-based image analysis infrastructure for signal acquisition and decoding.
- Necessitates cross-team standardization of microsphere preparation, fiber-optic handling, and assay protocols to ensure reproducibility across sites.
- Adaptation to other model systems (e.g., serum, urine) requires re-validation of encoding stability and antibody performance in differing matrices.
- Practical limitations include potential microsphere leakage from microwells and signal variability due to incomplete washing or evaporation during array assembly.
