Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Questa procedura localizza spazialmente diversi lipidi endogeni all'interno di una lente bovina. Utilizzando la tecnica di desorbimento assistito da matrice con laser e spettrometria di massa per imaging, preparare innanzitutto una sottile sezione di tessuto della lente bovina ed applicare una multi-matrice, quindi acquisire un dataset spettrale di massa maldi.

Elaborare il dataset in una rappresentazione visiva dei lipidi rilevati sulla sezione del tessuto della lente. Questi risultati insieme possono determinare la localizzazione e l'abbondanza relativa dei lipidi all'interno di una lente bovina e produrre una rappresentazione visiva di questa distribuzione. Rispetto ad altri metodi come l'estrazione dei lipidi seguita dall'analisi mediante LCMS, l'imaging mediante spettrometria di massa MALDI consente la visualizzazione simultanea di multipli lipidi senza perdere la loro localizzazione spaziale. Rimuovere i campioni di tessuto congelati rapidamente dallo stoccaggio a meno 80 gradi Celsius.

Rimuovere la capsula dalla superficie della lente per fissare una sezione intera di lente di vitello bovino. Applicare una o due gocce di acqua sul piano di taglio del criostato. Posizionare rapidamente la lente nell'acqua prima che si solidifichi, una volta che il criostato ha raggiunto la temperatura ottimale.

Tagliare il tessuto in sezioni di 20 micron di spessore lungo il piano equatoriale. Scartare le prime sezioni di tessuto e utilizzare solo fette che siano vicine o includano il piano equatoriale per l'immagine del tessuto del cristallino oculare. Aggiungere 1,5 microlitri di acido formico per pre-umettare la superficie di un vetrino in vetro rivestito con ITO.

Quindi trasferire con attenzione le sezioni di tessuto sul vetrino all'interno del criostato. Successivamente, liofilizzare i vetrini per 15 minuti prima dell'applicazione della matrice MALDI. Utilizzando una penna correttiva, aggiungere tre segni di allineamento sulla superficie non conduttiva del vetrino in vetro rivestito con ITO.

Ora acquisire un'immagine ottica del vetrino tissutale utilizzando uno scanner a piano fisso e salvarla in un formato appropriato come TIFF o JPEG. Innanzitutto, coprire i bordi della superficie anteriore dei vetrini in vetro rivestiti con ITO usando del nastro in modo che la matrice non ricopra i bordi del vetrino. Preparare la matrice da utilizzare in un solvente appropriato.

Applicare quindi le soluzioni della matrice sulle superfici delle sezioni di tessuto. Rivestire il vetrino eseguendo 20 cicli di rivestimento con la matrice. In alternativa, è possibile utilizzare un aerografo assistito pneumaticamente per applicare le matrici qualora un solvente non sia compatibile con l'aerografo elettronico per matrici.

Per la soluzione di calibrazione della massa, diluire la soluzione standard del mix di taratura ES di un fattore da uno a 200 in isopropanolo al 60%. Introdurre due microlitri al minuto della soluzione diluita di mix di taratura ES nella sorgente di ionizzazione elettrospray a doppia modalità dello strumento per la spettrometria di risonanza ciclotronica ionica in trasformata di Fourier. Far funzionare lo strumento F-T-I-C-R in modalità ESI a ioni positivi con rilevamento a banda larga e una dimensione di acquisizione dati di 1024 kilobyte al secondo. Impostare tipicamente i parametri ESI su una tensione elettrospray della capillare di 3.900 volt.

Una tensione dello schermo di protezione del nebulizzatore di 3.600 volt, flusso di gas azoto nebulizzatore a due litri al minuto. Flusso di azoto essiccante a quattro litri al minuto e temperatura di 200 gradi Celsius. Impostare inoltre la tensione del primo skimmer a 15 volt.

Tempo di volo a 0,01 secondi, flusso di gas di collisione di argon a 0,4 litri al secondo, tempo di accumulo degli ioni nella sorgente a 0,1 secondi e tempo di accumulo degli ioni nella cella di collisione a 0,2 secondi. Ora regolare i parametri operativi del F-T-I-C-R per massimizzare la sensibilità analitica nell'intervallo di massa da rapporto massa/carica 200 a 1400, mantenendo al contempo buoni segnali nel dominio del tempo di decadimento libero per induzione. Quindi acquisire gli spettri di massa ESI e calibrare lo strumento utilizzando le masse di riferimento dei composti standard nella soluzione del mix di taratura E es.

Per tarare lo strumento per l'operazione MALDI, sciogliere diverse aliquote da un microlitro di una soluzione standard mista di turina e INE nella soluzione della matrice a una concentrazione di un micromolare ciascuna e depositare queste soluzioni direttamente su una delle sezioni di tessuto campione. Posizionare il vetrino in un adattatore per vetrini tissutali e inserire l'adattatore, dal lato MALDI, nella sorgente ionica doppia ESI-MALDI. Successivamente, ottimizzare i parametri operativi MALDI appropriati per la potenza del laser e il numero di colpi laser necessari per l'accumulo del segnale MALDI per ogni scansione di massa.

Dopo aver regolato, calibrato e ottimizzato lo strumento per esperimenti di MSI MALDI, allineare la posizione fisica di una sezione di tessuto da immagini alla sua immagine ottica registrata all'interno del software di acquisizione. Allineare i tre segni di fluido correttivo utilizzando un metodo di triangolazione a tre punti. Quindi avviare un'operazione simultanea ESI MALDI in modo che ogni spettro di massa contenga i picchi di massa di riferimento della soluzione di taratura E ES per la calibrazione interna della massa successiva all'acquisizione.

Prima attenuare il segnale ESI riducendo la tensione del capillare finché i segnali MALDI non dominano gli spettri, mentre i segnali di calibrazione ESI rimangono sufficientemente intensi per la calibrazione interna della massa. Successivamente, impostare un metodo automatizzato di aumento graduale della radiazione laser. Utilizzando un'analisi su punti casuali.

Definire le regioni del tessuto da acquisire e impostare la dimensione del passo RA del laser appropriata. Calibrare gli spettri di massa MALDI utilizzando la calibrazione interna per il confronto iniziale, selezionare i picchi per la deisotopizzazione in MS/MS e selezionare i picchi mono-isotopici mediante uno script VBA personalizzato ed esportare gli elenchi risultanti di picchi mono-isotopici. Inserire i valori misurati del rapporto massa/carica nel database Melin e/o nel database metabolomico HMDB per l'abbinamento delle masse con le voci della libreria.

Successivamente, generare immagini MALDI per tutte le entità lipidiche rilevate nell'intera sezione di tessuto utilizzando un software di imaging con una larghezza del filtro di massa di una parte per milione nel picco massimo. Una volta generate le immagini per tutti i valori del rapporto massa/carica che corrispondono alle voci del database, generare immagini anche per tutti gli altri picchi al fine di individuare pattern di distribuzione unici che potranno essere analizzati successivamente in tessuti specifici, come il cristallino bovino. Spesso si osserva un ampio strappo del tessuto quando si utilizza il montaggio diretto con scongelamento.

La precoating della lamella IT OAS con etanolo o acido formico contribuisce a mantenere l'integrità delle sezioni di tessuto durante il montaggio del tessuto. Sia la scelta della matrice sia la selezione del solvente sono fattori importanti che influenzano la qualità degli spettri MALDI. Questi esempi confrontano uno spettro ottenuto con un solvente di matrice efficiente e una scelta inadeguata di solvente di matrice per il diolo.

Una volta acquisito l'insieme degli spettri di massa da un esperimento di MSI con Maldi, è possibile generare l'immagine per ciascuno degli ioni rilevati. Ogni pixel rappresenta un punto di irradiazione laser sulla superficie di una sezione di tessuto. Le concentrazioni relative degli analiti possono essere dettagliate nelle diverse porzioni della sezione di tessuto.

Nella maggior parte degli esperimenti, i dati vengono normalizzati rispetto alla corrente totale degli ioni all'interno di ogni spettro. Senza questa normalizzazione, aree con una matrice analitica più favorevole, come la cristallizzazione di COC, potrebbero generare segnali più intensi per gli analiti, alterando così i dati. Anche la preparazione del tessuto può modificare in modo significativo l'immagine generata.

Se il campione è troppo umido, gli analiti si delocalizzeranno sul tessuto e gran parte dell'informazione spaziale andrà perduta. Questa dimostrazione di un esperimento di imaging su tessuto di cristallino oculare ha utilizzato il diolo come matrice multipla per determinare la distribuzione spaziale dei lipidi mediante F-T-I-C-R-M-S. L’imaging dei lipidi in diversi tipi di tessuto può essere eseguito utilizzando il diolo o un’altra matrice in modo analogo.