Dithranol come Matrix Assisted Laser per Matrix desorbimento / ionizzazione Imaging su una trasformata di Fourier Ionorisonanza Ciclotronica Mass Spectrometer

Questa procedura localizza spazialmente più lipidi endogeni all'interno di un cristallino bovino. Utilizzando la tecnica della ionizzazione di desorbimento laser assistita da matrice, imaging spettrometrico di massa. Innanzitutto, preparare una sottile sezione di tessuto del cristallino bovino e applicare un multi matrixx, quindi acquisire un set di dati spettrali di massa maldi.

Elaborare il set di dati in una rappresentazione visiva dei lipidi rilevati sulla sezione del tessuto del cristallino. Insieme, questi risultati possono determinare la posizione e l'abbondanza relativa dei lipidi all'interno di un cristallino bovino e produrre una rappresentazione visiva di questa distribuzione. Rispetto ad altri metodi, come l'estrazione dei lipidi seguita dall'analisi LCMS, l'imaging con spettrometria di massa maldi consente la visualizzazione di più lipidi contemporaneamente senza perdere la loro localizzazione spaziale. Rimuovere i campioni di tessuto congelati al flash dalla conservazione a meno 80 gradi Celsius.

Rimuovere la capsula dalla superficie della lente per fissare un'intera sezione della lente di vitello bovino. Mettere una o due gocce d'acqua sul tavolino di taglio dei tessuti di un criostato. Posiziona rapidamente la lente nell'acqua prima che si solidifichi quando il criostato si è bilanciato alla temperatura ottimale.

Tagliare il tessuto equatorialmente in sezioni di 20 micron di spessore. Scartare le prime sezioni di tessuto e utilizzare solo fette vicine o che aggiungono il piano equatoriale per l'imaging del tessuto del cristallino oculare. Aggiungere 1,5 microlitri di acido formico per pre-bagnare la superficie di un vetrino in vetro rivestito ITO.

Quindi trasferire con cura le sezioni di tessuto sul vetrino all'interno del criostato. Successivamente, liofilizzare i vetrini per 15 minuti prima dell'applicazione della matrice maldi. Utilizzando una penna per liquido correttore, aggiungere tre segni di insegnamento sulla superficie non conduttiva del vetrino in vetro rivestito ITO.

Ora prendi un'immagine ottica del vetrino di tessuto utilizzando uno scanner piano e salvala in un formato appropriato come TIFF o jpeg. Innanzitutto, coprire i bordi sulla superficie anteriore dei vetrini in vetro rivestiti ITO con del nastro adesivo in modo che la matrice non ricopra i bordi del vetrino. Preparare la matrice da utilizzare in un solvente appropriato.

Quindi applicare le soluzioni di matrice sulle superfici delle sezioni di tessuto. Rivestire il vetrino utilizzando 20 cicli di rivestimento a matrice. In alternativa, è possibile utilizzare uno spruzzatore ad aerografo ad assistenza pneumatica per applicare le matrici se un solvente è incompatibile con lo spruzzatore a matrice elettronica.

Per la soluzione di calibrazione della massa, diluire la soluzione standard della miscela di sintonizzazione ES di un fattore da uno a 200 nel 60%L'isopropanolo ha introdotto due microlitri al minuto della soluzione diluita della miscela di sintonizzazione ES nella sorgente ionica di ionizzazione elettrospray a doppia modalità sullo strumento per quattro a risonanza ciclotronica ionica a trasformata ms. Utilizzare lo strumento F-T-I-C-R in modalità ESI a ioni positivi con rilevamento a banda larga e una dimensione di acquisizione dati di 1024 kilobyte al secondo. In genere impostare i parametri ESI di 3, 900 volt di tensione di elettrospruzzo capillare.

Una tensione dello schermo antispruzzo di 3, 600 volt flusso di azoto gassoso del nebulizzatore a due litri al minuto. Flusso di azoto gassoso secco a quattro litri al minuto e temperatura di 200 gradi Celsius. Impostare anche la tensione dello schiumatoio a 15 volt.

Tempo di volo a 0,01 secondi: flusso di gas argon di collisione a 0,4 litri al secondo, tempo di accumulo di ioni sorgente a 0,1 secondi e tempo di accumulo di ioni a cella di collisione a 0,2 secondi. Ora sintonizzare i parametri di funzionamento F-T-I-C-R per massimizzare la sensibilità analitica nell'intervallo di massa dal rapporto di massa a carica da 200 a 1400, mantenendo buoni segnali di decadimento dell'induzione liberi dal dominio del tempo. Quindi acquisire gli spettri di massa ESI e calibrare lo strumento utilizzando le masse di riferimento dei composti standard nella soluzione di miscelazione di sintonia E.

Per regolare lo strumento per il funzionamento MALDI, sciogliere diverse aliquote da un microlitro di una soluzione standard mista di urina e INE nella soluzione della matrice a una concentrazione di un micromolare ciascuna e individuare queste soluzioni direttamente su una delle sezioni di tessuto del campione. Posizionare il vetrino in un adattatore per vetrini in tessuto e caricare l'adattatore dal lato MALDI nella doppia sorgente di ioni MALDI ESI. Successivamente, ottimizzare i parametri operativi MALDI appropriati per la potenza del laser e il numero di colpi laser per l'accumulo del segnale MALDI per ogni scansione di massa.

Dopo aver messo a punto, calibrato e ottimizzato lo strumento per gli esperimenti maldi MSI, allineare la posizione fisica di una sezione di tessuto da visualizzare con la sua immagine ottica registrata all'interno del software di imaging. Allineare i tre segni del liquido di correzione utilizzando un metodo di triangolazione a tre punti. Quindi iniziare un'operazione ESI MALDI simultanea in modo che ogni spettro di massa contenga i picchi di massa di riferimento della soluzione di mix di sintonizzazione E ES per la calibrazione di massa interna post-acquisizione.

Per prima cosa attenuare il segnale ESI diminuendo la tensione capillare fino a quando i segnali MALDI dominano gli spettri, mentre i segnali del calibro ESI sono ancora abbastanza alti per la calibrazione della massa interna. Successivamente, impostare un metodo di rasing automatizzato per il laser di radiazione. Utilizzando un'analisi spot casuale.

Definire le regioni di tessuto da sottoporre a imaging e impostare la dimensione del passo RA del laser appropriata. Calibrare gli spettri di massa MALDI utilizzando la calibrazione interna per il confronto iniziale e selezionare i picchi per l'isotopo de MSMS e selezionare i picchi monoisotopici utilizzando uno script VBA personalizzato ed esportare gli elenchi di picchi monoisotopici risultanti. Inserire i valori misurati del rapporto massa/carica nei database Melin nine e/o HMDB metaboloma per la corrispondenza della massa con le voci della libreria.

Successivamente, generare immagini maldi per tutte le entità lipidiche rilevate nell'intera sezione di tessuto utilizzando un software di imaging con una larghezza del filtro di massa di una parte per milione all'apice del picco. Una volta generate le immagini per tutti i valori del rapporto massa/carica che corrispondono alle voci del database, generare immagini anche per tutti gli altri picchi per cercare modelli di distribuzione univoci che possono essere studiati in seguito per alcuni tessuti specifici, come il cristallino bovino. Quando si utilizza il montaggio diretto dello scongelamento, si osserva spesso un'estesa lacerazione del tessuto.

La precompressione del vetrino IT OAS con etanolo o acido formico aiuta a mantenere l'integrità delle sezioni di tessuto durante il montaggio del tessuto. Sia la scelta della matrice che la selezione del solvente sono fattori importanti che influenzano la qualità degli spettri MALDI. Questi esempi confrontano uno spettro prodotto con un solvente a matrice efficiente con una scelta scadente di solvente a matrice per il diolo.

Una volta acquisito il set di spettri di massa di un esperimento MSI di Maldi, è possibile generare l'immagine per ciascuno degli ioni rilevati. Con ogni pixel che rappresenta un punto di irradiazione laser dalla superficie di una sezione di tessuto. Le concentrazioni relative degli analiti possono essere dettagliate nelle diverse porzioni della sezione tissutale.

Nella maggior parte degli esperimenti, i dati sono normalizzati alla corrente ionica totale all'interno di ogni spettro. Senza queste aree di normalizzazione con una migliore matrice dell'analita, la cristallizzazione del COC potrebbe causare segnali più forti per gli analiti, e questo distorcerebbe i dati. La preparazione dei tessuti può anche cambiare drasticamente l'immagine che viene generata.

Se il campione è troppo umido, gli analiti delocalizzeranno sul tessuto e gran parte delle informazioni spaziali andranno perse. Questa dimostrazione di un esperimento di imaging tissutale su lente oculare ha utilizzato il diolo come multi Matrixx per determinare la distribuzione spaziale dei lipidi mediante F-T-I-C-R-M-S. L'imaging dei lipidi in diversi tipi di tessuto può essere realizzato utilizzando diolo o un'altra matrice in modo simile.