2.15: Clonazione molecolare

Il clonaggio molecolare è un insieme di tecniche utilizzate per inserire il DNA ricombinante da una fonte procariotica o eucariotica in un veicolo replicante come plasmidi o vettori virali. La clonazione si riferisce alla creazione di numerose copie di un frammento di DNA di interesse, come un gene. In questo video imparerai a conoscere le diverse fasi del clonaggio molecolare, come impostare la procedura e le diverse applicazioni di questa tecnica.

Prima di iniziare la clonazione, sono necessarie almeno due importanti molecole di DNA. Innanzitutto, e soprattutto, hai bisogno del frammento di DNA che stai per clonare, altrimenti noto come inserto. Può provenire da un procariote, da un eucariote, da un organismo estinto, oppure può essere creato artificialmente in laboratorio. Utilizzando il clonaggio molecolare possiamo saperne di più sulla funzione di un particolare gene.

In secondo luogo, hai bisogno di un vettore. Un vettore è il DNA plasmidico utilizzato come strumento in biologia molecolare per fare più copie o produrre una proteina da un determinato gene. I plasmidi sono un esempio di vettore e sono DNA circolare, extra cromosomico, che viene replicato dai batteri.

Un plasmide ha tipicamente un sito di clonazione multiplo o MCS, quest'area contiene siti di riconoscimento per diverse endonucleasi di restrizione note anche come enzimi di restrizione. Diversi inserti possono essere incorporati nel plasmide con una tecnica chiamata legatura. Il vettore plasmidico contiene anche un'origine di replicazione, che ne consente la replicazione nei batteri. Inoltre, il plasmide ha un gene antibiotico. Se i batteri incorporano il plasmide, sopravviverà nei terreni che contengono l'antibiotico. Ciò consente la selezione di batteri che sono stati trasformati con successo.

L'inserto e il vettore vengono clonati in un organismo cellulare ospite, il più comunemente utilizzato nel clonaggio molecolare è E. coli. E. coli cresce rapidamente, è ampiamente disponibile e ha numerosi vettori di clonazione diversi prodotti commercialmente. Gli eucarioti, come il lievito, possono anche essere usati come organismi ospiti per i vettori.

Il primo passo della procedura generale di clonaggio molecolare consiste nell'ottenere l'inserto desiderato, che può essere derivato dal DNA o dall'mRNA di qualsiasi tipo di cellula. Il vettore ottimale e il suo organismo ospite vengono quindi scelti in base al tipo di inserto e a ciò che verrà infine fatto con esso. Per replicare l'inserto viene spesso utilizzata una reazione a catena della polimerasi, o metodo basato sulla PCR.

Quindi, utilizzando una serie di reazioni enzimatiche, l'inserto e il digestato vengono uniti e introdotti nell'organismo ospite per la replicazione di massa. I vettori replicati vengono purificati dai batteri e, dopo la digestione di restrizione, analizzati su un gel. I frammenti purificati con gel vengono successivamente inviati per il sequenziamento per verificare che l'inserto sia il frammento di DNA desiderato.

Diamo uno sguardo un po' più dettagliato a come viene condotta la clonazione molecolare. Prima di iniziare, ti consigliamo di pianificare la tua strategia di clonazione, prima di effettuare qualsiasi tentativo di clonazione al banco. Ad esempio, un dato vettore plasmidico fornirà un numero finito di siti di restrizione per incorporare l'inserto tramite il sito di clonazione multipla. Dovrai scegliere i siti di restrizione che non si trovano nel tuo inserto in modo da non tagliarlo. Potresti trovarti in una situazione in cui sei costretto a unire un frammento di estremità smussato con uno che ha una sporgenza. In tal caso, l'utilizzo del frammento di Klenow per impostare una legatura dell'estremità smussata potrebbe essere l'unica opzione per ottenere l'inserto nel vettore desiderato. Comprendere i vari strumenti di clonazione molecolare a tua disposizione, oltre a elaborare una strategia attenta prima di iniziare la clonazione, può essere un immenso risparmio di tempo.

La fonte del DNA per la clonazione molecolare può essere isolata da quasi tutti i tipi di campioni di cellule o tessuti attraverso semplici tecniche di estrazione. Una volta isolata, la PCR può essere utilizzata per amplificare l'inserto.

Una volta che l'inserto è amplificato, sia esso che il vettore vengono digeriti dagli enzimi di restrizione, noti anche come endonucleasi di restrizione.

Una volta digeriti, l'inserto e il vettore possono essere eseguiti su un gel e purificati mediante un processo chiamato purificazione su gel. Per quanto riguarda il vettore, questo passaggio aiuterà a purificare il plasmide linearizzato dal plasmide non tagliato, che tende ad apparire come uno striscio ad alto peso molecolare su un gel.

Dopo la purificazione dei digesti, l'inserto viene legato o unito al plasmide, tramite un enzima chiamato DNA ligasi.

In generale, è sempre una buona idea impostare le legature, in modo che il rapporto tra inserto e vettore sia di 3 a 1, il che garantisce che solo una piccola quantità di vettore si autoliti. Una volta che la legatura è stata impostata sul ghiaccio, viene incubata da 14 a 25? C da 1 ora a pernottamento.

Successivamente, viene eseguita la trasformazione per introdurre il vettore plasmidico nell'ospite che lo replicherà.

Dopo la trasformazione, i batteri vengono piastrati su piastre di agar con antibiotico e incubati per una notte a 37 °C. Poiché il plasimide contiene un gene di resistenza agli antibiotici, una trasformazione riuscita produrrà colonie batteriche se coltivata su piastre di agar in presenza di antibiotici. Le singole colonie possono quindi essere prelevate dalla piastra trasformata, poste in terreni di crescita liquidi in provette numerate e messe in un incubatore a scuotimento per l'espansione. Un piccolo volume di coltura liquida viene aggiunto a una piastra di agar numerata, mentre il resto della coltura passa alla purificazione plasmidica. Lo schema di numerazione che denota l'identità delle colonie batteriche da cui i plasmidi saranno eventualmente purificati viene mantenuto durante tutto il processo di purificazione dei plasmidi.

Un campione di plasmide purificato viene quindi tagliato con enzimi di restrizione. Il digestato viene quindi caricato e fatto scorrere sul gel al fine di verificare la presenza di inserto, che verificherà che la colonia batterica sia stata trasformata con un plasmide contenente un inserto e non un plasmide autolegante. I batteri che sono stati trasformati con un plasmide contenente inserti, vengono espansi per un'ulteriore purificazione del plasmide. Il sequenziamento viene utilizzato come fase di verifica finale per confermare che il gene di interesse è stato clonato.

Il clonaggio molecolare può essere utilizzato per un numero quasi illimitato di applicazioni. Ad esempio, quando un modello di mRNA viene trascritto inversamente per formare cDNA, o DNA complementare, da un enzima chiamato trascrittasi inversa e quindi la PCR viene utilizzata per amplificare il cDNA, il clonaggio molecolare può essere utilizzato per creare una libreria di cDNA ? Una libreria di tutti i geni espressi da un dato tipo di cellula.

Il clonaggio molecolare può anche essere impiegato per prendere una serie di geni, o cluster di geni da un ceppo batterico, riorganizzarli in plasmidi che vengono trasformati in un altro ceppo, in modo che un intero percorso biosintetico possa essere ricreato per produrre una molecola complessa.

Attraverso il clonaggio molecolare, una libreria mutante può essere generata esprimendo un plasmide bersaglio in uno speciale ceppo batterico che utilizza una polimerasi soggetta a errori quando viene coltivato a determinate temperature. Le mutazioni possono essere caratterizzate mediante sequenziamento. I batteri trasformati con geni mutanti possono quindi essere testati con diversi farmaci o sostanze chimiche per vedere quali colonie batteriche si sono evolute per avere resistenza ai farmaci.

Grazie al clonaggio molecolare, i geni reporter possono essere incorporati nei plasmidi del DNA, un gene reporter comune è la proteina fluorescente verde o GFP, che emette una fluorescenza verde quando esposta alla luce UV. Un gene reporter può anche essere inserito in un alfavirus per mostrare l'infezione nelle zanzare e la trasmissibilità nelle cellule.

Hai appena visto il video di JoVE sulla clonazione molecolare. Ora dovresti capire come funziona il clonaggio molecolare e come la tecnica può essere utilizzata in biologia molecolare. Come sempre, grazie per la visione!