Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare il modello della camera di diffusione verticale o VDC per studiare le interazioni batteriche con un'invasione di cellule epiteliali intestinali. Questo viene raggiunto innanzitutto utilizzando un filtro speciale su cui è coltivato un monostrato polarizzato di cellule epiteliali intestinali Caco-2, al fine di creare compartimenti laterali apicali e basolaterali separati all'interno della VDC. Nel secondo passaggio, il ceppo batterico di interesse viene aggiunto al compartimento apicale.

In condizioni microaerofile e di coltura cellulare, il mezzo viene aggiunto al compartimento basolaterale in condizioni aerobiche; successivamente, nei diversi intervalli di tempo desiderati durante la co-coltura, il filtro viene rimosso e viene effettuato il conteggio dei batteri interagenti o intracellulari. In definitiva, utilizzando il modello VDC è possibile osservare un aumento del numero di batteri interagenti e intracellulari rispetto alle condizioni standard di coltura aerobica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi standard di adesione e invasione in coltura tissutale, consiste nel fatto che con questa metodica la co-coltura di batteri e cellule epiteliali intestinali viene effettuata in condizioni in vitro che riproducono più fedelmente le condizioni in vivo dell'intestino umano.

La procedura sarà dimostrata da N Vida nas, studentessa di dottorato del mio laboratorio, e Dominic Mills, un ricercatore post-dottorato che ha sviluppato il modello di camera di diffusione verticale come parte del suo dottorato nel mio laboratorio. Iniziare seminando quattro per 10 alla quinta cellule caco-2, cellule epiteliali intestinali, per ogni filtro da 0,4 micron in mezzo di coltura, quindi coltivare le cellule fino alla polarizzazione per 21 giorni, cambiando il mezzo ogni due o tre giorni per verificare lo stato di polarizzazione del monostrato. Utilizzare un volt-ohm metro per misurare la resistenza elettrica transepiteliale.

24 ore prima di iniziare il saggio di co-coltura VDC, incubare jejuni su una piastra fresca di agar sangue in condizioni microaerofile in un incubatore a atmosfera variabile. Allo stesso tempo, pre-incubare 30 millilitri di brodo Bruce nelle stesse condizioni il giorno dell'esperimento, immergendo anche le semicamere VDC, le guarnizioni ad anello e i tappi in soluzione disinfettante. Successivamente, utilizzare una siringa sterile da 20 millilitri per far passare la soluzione attraverso gli ingressi del gas in entrambe le semicamere. Dopo un'ora, risciacquare le componenti VDC con acqua sterile fresca utilizzando un'altra siringa sterile da 20 millilitri per risciacquare gli ingressi del gas.

Quindi raccogliere metà della coltura su piastra di agar sangue CJ in un millilitro di brodo Barella pre-incubato per ottenere circa 10 alla 10ª UFC per millilitro. Misurare la densità ottica della sospensione batterica a 600 nanometri per quantificare in modo semi-quantitativo le unità formanti colonie batteriche o UFC, quindi regolare la sospensione batterica al livello di inocolo desiderato in un volume totale di quattro millilitri di brodo Bruce pre-incubato. Eseguire una diluizione seriale a partire da questa sospensione batterica finale, quindi seminare la diluizione appropriata su piastre di agar sangue in triplice replicato e incubare le piastre nell'incubatore a atmosfera variabile per 48 ore.

Ora, posizionare la metà inferiore della camera del VDC piatta sul banco e inserire una guarnizione ad anello (O-ring) su di essa. Successivamente, staccare un filtro che porta le cellule epiteliali intestinali dal supporto e lavarlo tre volte con 400 microlitri di PBS sterile. Posizionare il filtro sulla metà inferiore della camera, assicurandosi che la guarnizione ad anello rimanga al suo posto, quindi abbassare delicatamente la metà superiore della camera fino a inserirla correttamente.

Dopo aver assemblato le due semicamere, fissarle insieme utilizzando le pinze ad anello e posizionare il VDC orizzontalmente sul banco da lavoro con le due aperture rivolte verso l'alto. Aggiungere l'inoculo batterico nella semicamera apicale e quindi aggiungere quattro millilitri di mezzo di coltura cellulare nella semicamera laterale basale. Inserire i tappi nelle aperture di entrambe le semicamere, quindi posizionare il VDC nell'incubatore a atmosfera variabile.

In prossimità del collettore del gas, aprire il regolatore della fornitura di gas collegato al collettore. Collegare il tubo del collettore all'ingresso del gas nella camera laterale basale del VDC, quindi collegare il tubo di uscita del gas proveniente dall'incubatore a atmosfera variabile a una delle uscite del pezzo terminale sulla camera laterale basale. Chiudere l'altra uscita del pezzo terminale sulla camera laterale basale.

Quindi aprire molto lentamente il flusso di gas sul collettore per evitare un'eccessiva pressione del gas e ottenere un flusso di gas pari a una bolla ogni due-cinque secondi dopo il periodo di co-coltura appropriato. Chiudere il regolatore di alimentazione del gas collegato al collettore. Successivamente, interrompere il flusso di gas verso il VDC attraverso il collettore e scollegare l'ingresso del gas, l'uscita del gas e il tappo dal VDC.

Successivamente, rimuovere il VDC dall'incubatore a atmosfera variabile. Quindi rimuovere i supernatanti apicali e basolaterali e conservarli a meno 80 gradi Celsius per analisi successive. Rimuovere le pinze ad anello e smontare delicatamente il VDC.

Rimuovere il filtro dalla semicamera e trasferirlo in una piastra per colture cellulari sterile da sei pozzetti. Quindi lavare il VDC con acqua sterile e conservarlo per il successivo ciclo di esperimenti finalizzati alla conta del numero totale di batteri interagenti. Lavare le cellule epiteliali intestinali da tre a cinque volte con 400 microlitri di PBS sterile, quindi lisarle in 400 microlitri di PBS sterile contenente Triton X-100 per 20 minuti a temperatura ambiente; eseguire una diluizione seriale del lisato cellulare, seguita dalla semina delle diluizioni appropriate su piastre di agar sangue in triplice replicato.

Quindi incubare le piastre a 37 gradi Celsius nell'incubatore a atmosfera variabile per 48 ore al fine di enumerare il numero totale di batteri invasivi. Incubare le cellule epiteliali intestinali con 400 microlitri di mezzo di coltura cellulare contenente 150 microgrammi per millilitro di Gentamicina per due ore in un incubatore standard per colture tessutali per eliminare i batteri extracellulari. Quindi quantificare le unità formanti colonie dopo la lisi cellulare, diluizione seriale e coltura come appena illustrato.

I seguenti dati illustrano un confronto tra il numero di CJ jui che interagiscono con o invadono cellule Caco-2 dopo 3, 6 o 24 ore di co-coltura in condizioni standard di saggio di coltura cellulare rispetto all'utilizzo del modello VDC. Dopo 24 ore di co-coltura, ad esempio, meno di 10⁷ UFC di CJ jui possono essere osservate in interazione con cellule Caco-2 in condizioni standard di coltura cellulare. Tuttavia, dopo 24 ore di co-coltura nel modello VDC, circa 10⁸ UFC di CJ jui possono essere osservate in interazione con cellule Caco-2, un aumento delle interazioni tra CJ jui e cellule epiteliali intestinali di quasi dieci volte.

Confrontando il numero di CJ jui invasivi in condizioni di coltura standard rispetto a quelle con modello VDC, circa 10 alla quinta UFC intracellulari di CGE jui possono essere isolate dalle cellule CACO-2 dopo 24 ore in condizioni di coltura cellulare standard. Dopo 24 ore di co-coltura nel modello VDC, invece, possono essere isolate circa 10 alla settima UFC intracellulari dalle cellule CACO-2, con un aumento dell'ordine di quasi 100 volte delle CGE intracellulari. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante monitorare il flusso di gas nella camera basolaterale dopo il suo sviluppo.

Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della patogenesi dell'abuc per studiare sia la base genetica dell'interazione batterica con le cellule epiteliali intestinali, sia la risposta immunitaria innata dell'ospite all'infezione batterica. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come utilizzare il modello della camera di diffusione verticale per studiare le interazioni di altri batteri enterici con le cellule epiteliali intestinali e le condizioni che rappresentano più fedelmente quelle presenti nell'intestino umano.