Name: Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali In Vitro È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale Modello (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-10-22T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
Description: Scopri il modello VDC per studiare l'invasione batterica delle cellule epiteliali intestinali in condizioni di ossigeno fisiologiche. Questo metodo migliora significativamente l'interazione con Campylobacter jejuni rispetto alle colture aerobiche standard.

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Dominic Mills è stato sostenuto da un Bloomsbury Collegi PhD Studentship (2007-2010). Gli autori desiderano ringraziare sia Ozan Gundogdu e Abdi Elmi per la loro assistenza nello sviluppo del modello VDC.

1. La crescita di monostrati IEC su speciali filtri 0,4 micron <ol><li> Coltura cellule Caco-2 a modificate mezzi essenziali di Dulbecco (DMEM) supplementato con 10% (v / v) di siero fetale bovino, 100 U / ml penicillina, 100 ug / ml streptomicina e 1% (v / v) aminoacidi non essenziali in un standard di coltura tissutale incubatore a 37 ° C in 5% di CO 2 e il 95% di aria. Seme di 4 x 10 5 Caco-2 IECs per 0,4 micron filtro e crescono di polarizzazione di 21 giorni, cambiando i media ogni 2-3 giorni. </li><li> Misurare la TEER per confermare lo stato di polarizzazione del monostrato utilizzando un misuratore di resistenza Volt-Ohm. Nei nostri studi, la TEER di 21 giorni Caco-2 cellule cresciute in questi filtri 0,4 micron è 700-800 Qcm 2. </li></ol> 2. Preparazione di C. jejuni e la Medi batterica per il saggio Coculturing <ol><li> 24 ore prima della partenza desiderata del saggio coculturing VDC, preparare un piatto fresco di agar sangue di C. jejuni e incubare a 37 ° C in condizioni microaerobiche (85% N 2, O 2 5% e 10% CO 2) nella variabile atmosfera incubatrice. </li><li> Allo stesso tempo, Preincubare 30 ml di brodo brucella a 37 ° C in condizioni microaerobiche in un&#39;atmosfera incubatore variabile. </li></ol> 3. Preparazione e sterilizzazione della mezza Chambers VDC prima del test <ol><li> Immergere completamente camere VDC mezzo così come gli O-ring e le spine nella soluzione di sterilizzazione. </li><li> Usando una sterile siringa da 20 ml, lavare la soluzione di sterilizzazione attraverso le prese di gas in entrambe le camere e mezzo. In caso contrario si potrebbe causare la contaminazione dei campioni durante coculturing. </li><li> Lasciare tutte le componenti immersi nella soluzione di sterilizzazione per&gt; 1 ora. </li><li> Risciacquare tutti i componenti con acqua fresca sterile, utilizzando un altro sterile 20 ml siringa per lavare le prese di gas. </li></ol> 4. Preparazionedi inoculo batterico <ol><li> Raccogliere metà un piatto di C. crescita jejuni dalla piastra di agar sangue preparato il giorno precedente in 1 ml di brodo brucella preincubato. Questo dovrebbe produrre ~ 10 10 ufc / ml. </li><li> Misurare la densità ottica della sospensione batterica a 600 nm per semiquantify batteriche unità formanti colonie (CFU). </li><li> Regolare la sospensione batterica al livello desiderato inoculo in 4 ml di brodo brucella preincubato. </li><li> Eseguire una diluizione seriale a questa sospensione batterica finale successiva metallizzazione delle appropriate diluizioni su piastre di agar sangue in triplice copia ed incubare a 37 ° C in atmosfera variabile incubatore per 48 ore per quantificare il numero di CFU batteriche presenti nel inoculo. </li></ol> 5. Impostazione del VDC <ol><li> Posizionare la metà camera inferiore di un VDC piatta sulla panca. Montare un O-ring sulla camera di metà inferiore. </li><li> Staccare un filtro che trasportano i IECs da tegli vettore e lavare tre volte con 400 ml di PBS sterile. Posizionare il filtro sulla camera di metà inferiore, assicurandosi che l&#39;o-ring rimanga in posizione. </li><li> Abbassare delicatamente la camera di metà superiore in posizione. Una volta che le due mezze camere sono assemblati, fissare insieme con l&#39;anello-morsetti. Collocare il VDC orizzontalmente sul banco, con le due aperture rivolte verso l&#39;alto. </li><li> Aggiungere il 4 ml di inoculo batterico nella camera di metà apicale. </li><li> Aggiungere 4 ml di mezzo di coltura cellulare nella metà camera di basolaterale. </li><li> Mettere i pezzi di fine nelle aperture entrambe le camere e mezzo. </li></ol> 6. Fissaggio del VDC al collettore gas all&#39;interno della variabile Atmosfera Incubator <ol><li> Collocare il VDC nella variabile atmosfera incubatore in prossimità del collettore gas. </li><li> Aprire il regolatore di alimentazione gas collegato al collettore gas. Fissare il tubo dal collettore in ingresso del gas sulla metà camera di basolaterale del VDC. Fissare il gas tubo di uscita che porta fuori dell&#39;atmosfera variabile incubatore a uno dei punti vendita del codolo sulla metà camera di basolaterale. </li><li> Chiudere l&#39;altra presa alla fine-pezzo sulla metà camera di basolaterale. Apertura del flusso del gas sul collettore gas, avendo cura di aprire molto lentamente per evitare la pressione del gas in eccesso, in quanto questo può portare all&#39;espulsione del mezzo basolaterale. </li><li> L&#39;obiettivo è un flusso di gas di 1 bolla ogni 2-5 sec. Controllare periodicamente il flusso di gas durante il corso dell&#39;esperimento e regolare se necessario. </li></ol> 7. Smontaggio del VDC dopo co-coltura <ol><li> Dopo il periodo di co-coltura appropriato, chiudere il regolatore di alimentazione gas collegato al collettore gas. Chiudere il flusso di gas nel Vcc nel collettore. Scollegare l&#39;ingresso del gas, l&#39;uscita del gas ed il fermo dalla VDC. </li><li> Rimuovere il VDC da un&#39;atmosfera incubatore variabile. Rimuovere il surnatante apicale e basolaterale e conservare a -80 ° C per subsequent analisi. </li><li> Rimuovere i morsetti ad anello e delicatamente smontare il VDC. Rimuovere il filtro dalla camera di metà e trasferimento in un piatto di coltura cellulare da 6 pozzetti sterili. Lavare le IXC tre volte con 400 ml di PBS sterile. </li><li> Per il conteggio del numero totale di batteri interagenti, aggiungere 400 ml di PBS sterile contenente 0,1% (v / v) Triton X-100 al IECs e incubare per 20 min a temperatura ambiente per lisare il CEI. Eseguire una diluizione seriale a questa lisato cellulare successiva metallizzazione delle appropriate diluizioni su piastre di agar sangue in triplice copia ed incubare a 37 ° C in atmosfera variabile incubatore per 48 ore per quantificare il numero di interagire CFU batteriche. </li><li> Per il conteggio del numero totale di batteri invasori, aggiungere 400 ml di DMEM cella mezzo di coltura contenente 150 ug / ml di gentamicina ai IECs ed incubare per 2 ore in un incubatore per colture tessuto normale a 37 ° C in 5% di CO 2 e il 95% AIR per uccidere i batteri extracellulari,poi seguire come al punto 7.4 di cui sopra. </li></ol> 8. Pulizia del VDC dopo co-coltura Lavare il VDC con acqua sterile e conservare per la prossima tornata di esperimenti.

<ol><li>Mills, D. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Increase+in+Campylobacter+jejuni+invasion+of+intestinal+epithelial+cells+under+low-oxygen+coculture+conditions+that+reflect+the+in+vivo+environment%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Increase in Campylobacter jejuni invasion of intestinal epithelial cells under low-oxygen coculture conditions that reflect the in vivo environment.</a> Infect. Immun. 80, 1690-1698 (2012).</li>
<li>Marteyn, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modulation+of+Shigella+virulence+in+response+to+available+oxygen+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Modulation of Shigella virulence in response to available oxygen in vivo.</a> Nature. 465, 355-358 (2010).</li>
<li>Dorrell, N., Wren, B. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+second+century+of+Campylobacter+research%3A+recent+advances%2C+new+opportunities+and+old+problems%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Infect.+Dis%22%5BJournal%5D)">The second century of Campylobacter research: recent advances, new opportunities and old problems.</a> Curr. Opin. Infect. Dis. 20, 514-518 (2007).</li>
<li>Young, K. T., Davis, L. M., Dirita, V. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Campylobacter+jejuni%3A+molecular+biology+and+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Campylobacter jejuni: molecular biology and pathogenesis.</a> Nat. Rev. Microbiol. 5, 665-679 (2007).</li>
<li>Hu, L., Kopecko, D. J. Chapter 17. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHu%2C+L+%22Campylobacter%22">Campylobacter</a>. Nachamkin, I., Szymanski, C. M., Blaser, M. J. , ASM Press. 297-313 (2008).</li>
<li>Everest, P. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differentiated+Caco-2+cells+as+a+model+for+enteric+invasion+by+Campylobacter+jejuni+and+C.+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Med.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Differentiated Caco-2 cells as a model for enteric invasion by Campylobacter jejuni and C. coli.</a> J. Med. Microbiol. 37, 319-325 (1992).</li>
<li>Konkel, M. E., Hayes, S. F., Joens, L. A., Cieplak, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+of+the+internalization+and+intracellular+survival+of+Campylobacter+jejuni+in+human+epithelial+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Microb.+Pathog%22%5BJournal%5D)">Characteristics of the internalization and intracellular survival of Campylobacter jejuni in human epithelial cell cultures.</a> Microb. Pathog. 13, 357-370 (1992).</li>
<li>Monteville, M. R., Konkel, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fibronectin-facilitated+invasion+of+T84+eukaryotic+cells+by+Campylobacter+jejuni+occurs+preferentially+at+the+basolateral+cell+surface%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Fibronectin-facilitated invasion of T84 eukaryotic cells by Campylobacter jejuni occurs preferentially at the basolateral cell surface.</a> Infect. Immun. 70, 6665-6671 (2002).</li>
<li>Friis, L. M., Pin, C., Pearson, B. M., Wells, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+cell+culture+methods+for+investigating+Campylobacter+invasion+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microbiol.+Methods%22%5BJournal%5D)">In vitro cell culture methods for investigating Campylobacter invasion mechanisms.</a> J. Microbiol. Methods. 61, 145-160 (2005).</li>
<li>Schuller, S., Phillips, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerobic+conditions+enhance+type+III+secretion+and+adherence+of+enterohaemorrhagic+Escherichia+coli+to+polarized+human+intestinal+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Environ.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Microaerobic conditions enhance type III secretion and adherence of enterohaemorrhagic Escherichia coli to polarized human intestinal epithelial cells.</a> Environ. Microbiol. 12, 2426-2435 (2010).</li>
<li>Cottet, S., Corthesy-Theulaz, I., Spertini, F., Corthesy, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microaerophilic+conditions+permit+to+mimic+in+vitro+events+occurring+during+in+vivo+Helicobacter+pylori+infection+and+to+identify+Rho%2FRas-associated+proteins+in+cellular+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Microaerophilic conditions permit to mimic in vitro events occurring during in vivo Helicobacter pylori infection and to identify Rho/Ras-associated proteins in cellular signaling.</a> J. Biol. Chem. 277, 33978-33986 (2002).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

L&#39;uso di metodi di coltura cellulare in vitro per studiare le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti è una tecnica largamente impiegata in molti laboratori di ricerca. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l&#39;ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Il ampiamente usato in modelli di infezione in vitro sono partico...

Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. L&#39;uso di tali saggi di coltura cellulare, adesione batterica alle cellule ospiti, l&#39;identificazione dei recettori della cellula ospite, cellula ospite vie di segnalazione e l&#39;invasione batterica delle cellule ospiti sono stati tutti studiati in dettaglio, con conseguente molte importanti osservazioni. Tuttavia tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche che possono non essere rappresentativi della ambiente in vivo. Una limitazione importante di modelli in vitro utilizzati per studiare le infezioni gastrointestinali è che le condizioni di coltura tra cui alti livelli di ossigeno in generale favoriscono la sopravvivenza delle cellule eucariotiche. Tuttavia le condizioni nel lume intestinale saranno quasi anaerobica. Patogeni enterici in un ambiente povero di ossigeno esprimono geni di virulenza cui espressione cambia in condizioni aerobiche 2. Come tale, i dati ottenuti utilizzando standard di coltura cellulare modelli may dare un&#39;indicazione imprecisa delle interazioni batteriche con le cellule ospiti. Campylobacter jejuni è il principale agente eziologico della gastroenterite acuta batterica in tutto il mondo, con sintomi che vanno dalla diarrea lieve a grave enterite infiammatoria. La maggioranza di C. jejuni infezioni provocano gastroenterite non complicata, tuttavia C. jejuni è anche l&#39;agente infettivo più comunemente identificato in neuropatie periferiche, incluse la sindrome di Guillain-Barré (GBS). Nel Regno Unito, si stima che ci siano oltre 500.000 casi di enteriti causate da C. jejuni infezione ogni anno, con un costo previsto per l&#39;economia del Regno Unito di £ 580.000.000. Nel mondo in via di sviluppo, C. jejuni è una delle principali cause di mortalità tra i bambini. Nonostante l&#39;indubbia importanza di infezione da Campylobacter e di decenni di ricerca, tra cui l&#39;analisi genomica basata approfondita, C. jejuni patogenesi è ancora poco understood, a differenza di altri patogeni enterici come Salmonella, Escherichia coli, Shigella e Vibrio cholerae. La mancanza di un comodo piccolo modello animale è una delle ragioni principali per questo 3. Anche il ampiamente utilizzato in modelli di infezione in vitro sono più appropriati per lo studio microaerofili C. jejuni che per altri patogeni enterici che sono anaerobi facoltativi. Mentre C. jejuni è riconosciuto come un agente patogeno invasivo, i meccanismi di C. jejuni invasione delle cellule epiteliali intestinali (IECs) sono ancora poco chiari 4,5. C. jejuni invasione ha dimostrato di essere dipendente sia microfilamenti, microtubuli, una combinazione di entrambi o nessuno 5. La confusione in questa zona è molto probabilmente dovuta all&#39;uso di appropriati nelle condizioni di saggio in vitro. Un certo numero di differenti saggi di coltura cellulare sono stati utilizzati per studiare le interazioni di C. jejunicon le cellule ospiti. Caco-2 6, 7 INT 407 e T84 8 linee cellulari sono stati tutti utilizzati per studiare le capacità di adesione e invasione di diversa C. ceppi jejuni. Tuttavia, i livelli di adesione batterica e invasione per C. jejuni con IECs sono notevolmente inferiori rispetto ad altri patogeni enterici 9. La coculturing di C. jejuni con IECs viene normalmente eseguita in un incubatore CO 2 in condizioni vicine a livelli di ossigeno atmosferico, necessaria per la sopravvivenza di IECs. C. espressione genica jejuni sarà molto differente nell&#39;ambiente ossigeno basso del lume intestinale rispetto a condizioni di ossigeno atmosferico. L&#39;uso di un sistema di camera di diffusione verticale (VDC) è stato sviluppato che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas 1,10,11. Questo sistema simula le condizioni nell&#39;intestino umano, dove i batteri saranno ONUder condizioni di tessuto mentre molto basso ossigeno saranno forniti con l&#39;ossigeno dal flusso sanguigno. Monostrati polarizzati IEC coltivate in speciali 0,4 micron filtri sono stati collocati in un VCC creando un compartimento apicale e basolaterale, che sono stati riempiti singolarmente con brodo batterica e coltura cellulare rispettivamente (Figura 1). Il VDC è stata posta in atmosfera variabile incubatore contenente 85% N 2, O 2 5%, e 10% di CO 2 a 37 ° C, con condizioni ottimali per C. jejuni. Il compartimento apicale stata lasciata aperta ed esposta all&#39;atmosfera microaerobica all&#39;interno della variabile atmosfera incubatrice, mentre il vano basolaterale sigillata è stata fornita con l&#39;ossigeno da una costante somministrazione di 5% 95% O 2 miscela di gas con un tubo di uscita evitando accumuli di pressione CO 2 / . Caco-2 sopravvivenza cellulare e integrità monostrato in queste condizioni sono state confermate dal monitoraggio ele transepitelialeResistenza ctrical (TEER) attraverso il monostrato oltre 24 ore per dimostrare sopravvivenza della separazione Caco-2 monostrato cellulare e fisica dei compartimenti apicale e basolaterale in condizioni di bassa ossigeno nel compartimento apicale. La TEER di monostrati in VDCs mantenuto in atmosfera incubatrice variabile (condizioni microaerobiche) ed in una coltura cellulare di CO 2 incubatore standard (condizioni aerobiche) non ha evidenziato differenze significative, indicando integrità del monostrato cellulare in diverse condizioni meteorologiche 1. In condizioni microaerobiche, giunzioni strette sono rimasti presenti e uniformemente distribuito tra i bordi delle celle con un pattern di colorazione occludina simili alle cellule mantenute in condizioni aerobiche 1. Le interazioni di C. jejuni con Caco-2 e T84 cellule del VDC sono stati studiati per valutare l&#39;interazione batterica (adesione e invasione) e l&#39;invasione. Due diversi C. jejuni wild-type straiNS sono stati utilizzati 1. C. jejuni 11168H è un derivato hypermotile dell&#39;originale ceppo sequenza NCTC11168. Il ceppo 11168H mostra molto più alti livelli di colonizzazione in un modello di colonizzazione pulcino ed è quindi considerato un ceppo adatto da utilizzare per studi di interazione ospite-patogeno. 81-176 è un umano isolare ed è uno dei più invasive ceppi di laboratorio ampiamente studiate. C. jejuni ceppi sono stati aggiunti al compartimento apicale di un VDC in condizioni sia microaerobiche o aerobico. Abbiamo osservato tassi più elevati sia per l&#39;interazione e l&#39;invasione sono stati registrati per C. jejuni in condizioni microaerobiche 1. L&#39;aumento C. interazioni jejuni non erano dovuti ad un aumento del numero di batteri in condizioni microaerobiche 1. Questi dati supportano la nostra ipotesi che l&#39;ambiente a basso ossigeno nel compartimento apicale del VDC migliora interazioni batteri-ospite e indica che le proprietà invasive di C. jejuni sono incrfacilitato in queste condizioni. Questo era il primo rapporto di utilizzo del modello VCC per studiare un patogeno batterico invasiva e mette in evidenza l&#39;importanza di eseguire saggi di infezione in vitro in condizioni che imitare maggiormente la situazione in vivo. Il modello VDC potrebbe essere usato per studiare le interazioni ospite-patogeno per molte differenti specie batteriche.

<table><tbody><tr><td>Sistema di diffusione verticale speciale per l'uso con inserti Snapwell</td><td>Apparecchio Harvard</td><td>66-0001</td><td>Collettore e sei camere Snapwell</td></tr><tr><td>Tappi Apparato</td><td>Harvard</td><td>66-0020</td><td></td></tr><tr><td>O-ring</td><td>Apparato Harvard</td><td>66-0007</td><td></td></tr><tr><td>Morsetti</td><td>Apparato Harvard</td><td>66-0012</td><td></td></tr><tr><td>Filtri Snapwell (dimensione dei pori 0,4 &mu; m)</td><td>Corning Costar</td><td>3407</td><td></td></tr><tr><td>Millicell ERS-2 Volt-Ohm spettrofotometro</td><td>Millipore</td><td>MERS00002</td><td></td></tr><tr><td>WPA Lightwave II</td><td>Biochrom</td><td>80-3003-72</td><td></td></tr></tbody></table>

enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali<em&gt; in vitro</em&gt; È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale modello

Enteric Bacterial Invasion Of Intestinal Epithelial Cells In Vitro Is Dramatically Enhanced Using a Vertical Diffusion Chamber Model

Le interazioni di patogeni batterici con cellule ospiti sono stati studiati estesamente utilizzando metodi di coltura cellulare in vitro. Tuttavia, come tali analisi di colture cellulari vengono eseguite in condizioni aerobiche, questi modelli in vitro possono non rappresentare accuratamente l&#39;ambiente in vivo in cui le interazioni ospite-patogeno si svolgono. Abbiamo sviluppato un modello in vitro di infezione che permette la co-coltura di batteri e cellule ospiti sotto diverse condizioni medie e gas. La camera di diffusione verticale (VDC) modello simula le condizioni nell&#39;intestino umano, dove i batteri saranno in condizioni di tessuto, mentre molto basso di ossigeno sarà fornita con l&#39;ossigeno dal flusso sanguigno. Posizionamento polarizzati cellulari (IEC) monostrati epiteliali intestinali cresciute in Snapwell inserisce in un VDC crea compartimenti apicale e basolaterale separati. Il vano basolaterale è riempito con mezzo di coltura cellulare, sigillato e perfusi con l&#39;ossigeno wHilst compartimento apicale è pieno di brodo, tenute aperte e incubate in condizioni microaerobiche. Sia Caco-2 e T84 IECs possono essere mantenuti nel VDC in queste condizioni, senza apparenti effetti negativi sulla sopravvivenza delle cellule o l&#39;integrità monostrato. Esperimenti Coculturing eseguiti con differenti C. jejuni ceppi wild-type e diverse linee IEC nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale riproducibile risultano in un incremento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche 1. L&#39;ambiente creato nel modello VDC imita più da vicino l&#39;ambiente incontrate da C. jejuni nell&#39;intestino umano e mette in evidenza l&#39;importanza di esibirsi in saggi di infezione in vitro in condizioni che mimano più da vicino la realtà in vivo. Noi proponiamo che l&#39;uso del modello VDC consentirà nuove interpretazioni delle interazioni scommettonoween batteri patogeni e cellule ospiti.

Esperimenti Coculturing eseguite con il C. jejuni ceppo selvatico e IECs nel modello VDC con condizioni microaerobiche nel compartimento apicale hanno dimostrato un aumento del numero di interagire (quasi 10 volte) e intracellulari (quasi 100 volte) batteri rispetto a condizioni di coltura aerobiche in un momento maniera dipendente dalla 1. Questa osservazione era riproducibile utilizzando due diversi C. jejuni ceppi wild-type (11168H e 81-176) e due linee IEC diversi (Caco-2 e T84), mettend...

Esecuzione di test di coltura cellulare per indagare adesione batterica e l&#39;invasione in condizioni aerobiche è di solito non rappresentativo della<em&gt; In vivo</em&gt; Ambiente. Un modello di camera di diffusione verticale permette lo studio delle interazioni del patogeno umano<em&gt; Campylobacter jejuni</em&gt; Con le cellule epiteliali intestinali in più<em&gt; In vivo</em&gt; Condizioni simili, con conseguente maggiore invasione batterica.

Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali<em&gt; In Vitro</em&gt; È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale Modello

The interactions of bacterial pathogens with host cells have been investigated extensively using in vitro cell culture methods. However as such cell ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è utilizzare il modello della camera di diffusione verticale o VDC per studiare le interazioni batteriche con un'invasione di cellule epiteliali intestinali. Questo viene raggiunto innanzitutto utilizzando un filtro speciale su cui è coltivato un monostrato polarizzato di cellule epiteliali intestinali Caco-2, al fine di creare compartimenti laterali apicali e basolaterali separati all'interno della VDC. Nel secondo passaggio, il ceppo batterico di interesse viene aggiunto al compartimento apicale.In condizioni microaerofile e di coltura cellulare, il mezzo viene aggiunto al compartimento basolaterale in condizioni aerobiche; successivamente, nei diversi intervalli di tempo desiderati durante la co-coltura, il filtro viene rimosso e viene effettuato il conteggio dei batteri interagenti o intracellulari. In definitiva, utilizzando il modello VDC è possibile osservare un aumento del numero di batteri interagenti e intracellulari rispetto alle condizioni standard di coltura aerobica. Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come i saggi standard di adesione e invasione in coltura tissutale, consiste nel fatto

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Questo protocollo descrive un modello in vitro di enterocolite necrotizzante (NEC), che può essere utilizzato per studi meccanicistici sulla patogenesi della malattia. È dotato di un chip microfluidico seminato con enteroidi intestinali derivati dall'intestino neonatale umano, dalle cellule endoteliali e dal microbioma intestinale di un neonato con NEC grave.

Modello microfluidico di enterocolite necrotizzante che incorpora enteroidi intestinali neonatali umani e un microbioma disbiotico

Il presente protocollo descrive saggi di infezione per interrogare l'aderenza, l'invasione e la replicazione intracellulare di Shigella utilizzando linee cellulari epiteliali in vitro .

Analisi delle infezioni delle cellule epiteliali con Shigella

Lo studio presenta un metodo per l'indagine in vitro delle infezioni batteriche utilizzando organoidi intestinali derivati dalle cellule staminali tissutali. Il protocollo descrive come coltivare e differenziare gli organoidi in due dimensioni, infettarli con Escherichia coli invasiva da aderenti e valutare i dati chiave, tra cui la rottura della barriera epiteliale, l'imaging infezionale e la risposta dell'RNA epiteliale.

Una coltura organoide bidimensionale su estratto di invasina o membrana basale per studiare le interazioni ospite-batteri

La resistenza agli antibiotici tra i ceppi di Escherichia coli invasivi in adesione pone difficoltà nella valutazione dell'invasione batterica utilizzando il tradizionale saggio protettivo per la gentamicina. Viene descritto un metodo migliorato per valutare quantitativamente l'invasione batterica enumerando le unità formative di colonie e qualitativamente tramite la visualizzazione delle cellule infette tramite microscopia confocale a immunofluorescenza.

Test di protezione amikacin per la quantificazione e visualizzazione dell'invasione delle cellule di Escherichia coli

Scopri il modello VDC per studiare l'invasione batterica delle cellule epiteliali intestinali in condizioni di ossigeno fisiologiche. Questo metodo migliora significativamente l'interazione con Campylobacter jejuni rispetto alle colture aerobiche standard.

Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali In Vitro È drammaticamente migliorata utilizzando una camera di diffusione verticale Modello (Video) | JoVE Journal

Enterico invasione batterica della cellule epiteliali intestinali

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