Name: Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dellassorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-28T14:00:00.000+00:00
Duration: 15 min 10 s
Description: Impara a misurare l'assorbimento cerebrale di glucosio e chetoni nel ratto con PET-MRI a doppio tracciante. Questo metodo quantitativo permette di studiare il metabolismo energetico cerebrale regionale e i cambiamenti legati all'invecchiamento.

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Questo studio è stato sostenuto finanziariamente dal Fonds de la recherche en santé du Québec, dagli Istituti canadesi di ricerca sanitaria, dalla Fondazione canadese per l'innovazione e dal Segretariato delle cattedre di ricerca canadesi (SCC). Lo Sherbrooke Molecular Imaging Center fa parte del Centro di ricerca clinica Étienne-Le Bel, finanziato dall'FRQS. Gli autori ringraziano Mélanie Fortier, Jennifer Tremblay-Mercier, Alexandre Courchesne-Loyer, Dr. Fabien Pifferi, Dr. M'hamed Bentourkia, Dr. Otman Sarrhini, Dr. Jacques Rousseau, Caroline Mathieu e Mélanie Archambault per il generoso supporto e l'assistenza tecnica. Gli autori ringraziano la piattaforma di analisi e visualizzazione delle immagini (http://pavi.dinf.usherbrooke.ca) per il loro aiuto.

Tutti gli esperimenti sono stati eseguiti in conformità con il Comitato per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università di Sherbrooke e con il Consiglio Canadese per la Cura degli Animali. Il protocollo sperimentale è stato approvato dal Comitato Etico Istituzionale per la Ricerca sugli Animali (protocollo n. 011-09).
1. Anatomia del cervello con risonanza magnetica
<ol>
	<li>Lasciare che i ratti si ambientino nel laboratorio per animali per un periodo minimo di 7 giorni prima del protocollo. Eseguire le scansioni cerebrali con risonanza magnetica da 1 a 2 settimane prima del protocollo PET con doppio tracciante, per consentire un completo recupero dall'anestesia.</li>
	<li>Anestetizzare il ratto in una camera di induzione. Utilizzare isoflurano al 2% e ossigeno a 1,5 L/min per tutta la durata del protocollo anestetico. Pizzicare la zampa posteriore per verificare che l'animale sia completamente anestetizzato. ATTENZIONE: l'inalazione di isoflurano può causare mal di testa, vertigini o perdita di coscienza in alcuni casi; deve essere sempre utilizzato in presenza di un sistema di ricambio d'aria e in un ambiente adeguatamente ventilato.</li>
	<li>Posizionare il ratto sul tavolo di esame della risonanza magnetica in posizione prona con la testa in avanti, utilizzando una mascherina nasale per l'isoflurano. Posizionare i sensori per la rilevazione della respirazione e della temperatura rettale. Monitorare la frequenza respiratoria durante l'esperimento e mantenere la temperatura corporea a 37 °C mediante un sistema automatico di riscaldamento ad aria.</li>
	<li>Acquisire immagini RM pesate in T2 utilizzando una sequenza impulsiva fast spin-echo con parametri di acquisizione come descritti in precedenza11. Posizionare il ratto su un tappetino riscaldato durante il risveglio dall'anestesia.</li>
</ol>
2. Acquisizioni PET con doppio tracciante
<ol>
	<li>Utilizzare uno scanner PET per piccoli animali dotato di rivelatori a fotodiodo a valanga, un campo di vista assiale di circa 7,5 cm e una risoluzione spaziale isotropica di 1,2 mm17. A causa della breve emivita fisica, preparare il 11C mediante bombardamento di azoto naturale con protoni (attraverso la reazione nucleare 14N(ρ,α)11C) in un ciclotrone in loco prima di ogni esperimento.</li>
	<li>Digiunare il ratto per 18 ore prima della scansione PET. Il digiuno consente un maggiore accumulo cerebrale di 11C-AcAc e 18F-FDG, migliorando così il rapporto segnale-rumore.</li>
	<li>Anestetizzare il ratto in una camera di induzione. Trasferire il ratto su un tappetino riscaldante con un cono nasale per l'isoflurano. Iniziare in questo momento la sintesi del 11C-AcAc. La sintesi richiede 18 minuti dall'istante finale del bombardamento, come descritto in precedenza1.</li>
	<li>Posizionare il ratto su un fianco. Preparare un catetere in polietilene PE50 riempito con soluzione di cloruro di sodio 0,9% eparinizzato (soluzione salina). Installare il catetere nella vena della coda per l'iniezione del tracciante. Installare un secondo catetere nell'arteria ventrale mediale della coda per il prelievo di sangue durante tutte le acquisizioni.</li>
	<li>Trasferire rapidamente il ratto sul tavolo dello scanner in posizione prona con la testa in avanti, dotato di cono nasale per l'isoflurano. Posizionare le sonde per la respirazione e rettale. Monitorare la frequenza respiratoria durante l'esperimento e mantenere la temperatura corporea a 37 °C mediante un sistema automatico di riscaldamento ad aria. Spostare il tavolo dello scanner all'interno dello strumento per garantire un'immagine simultanea adeguata di cervello e cuore. Come riferimento anatomico, posizionare il bordo del campo di vista sugli occhi del ratto (con l'aiuto di linee laser).</li>
	<li>Utilizzando una soluzione concentrata di 11C-AcAc (~1 GBq/ml), preparare una siringa contenente circa 50 MBq di radioattività (un intervallo compreso tra 45 e 55 MBq è accettabile). Regolare il volume a 300 μl con soluzione salina. ATTENZIONE: La radioattività può essere dannosa per la salute. Deve sempre essere manipolata dietro uno schermo di piombo. L'operatore deve indossare un dosimetro corporeo e uno da dito. Durante l'esperimento deve essere utilizzato anche un contatore Geiger.</li>
	<li>Montare la siringa su una pompa di iniezione. Avviare l'iniezione a bolo di 11C-AcAc a una velocità di 1 ml/min (durata dell'iniezione: ~19 sec). Su una seconda pompa, immediatamente dopo la fine dell'iniezione di 11C-AcAc, avviare l'iniezione di 300 μl di soluzione salina alla velocità di 1 ml/min, procedura importante per garantire un'ottimale iniezione del tracciante nella circolazione sanguigna.</li>
	<li>Avviare l'acquisizione dinamica dei dati PET 30 secondi prima dell'iniezione a bolo, per una durata totale di 20,5 minuti. L'acquisizione dei dati per 30 secondi prima dell'iniezione del tracciante fornisce una misura dello sfondo ambientale da sottrarre successivamente ai dati PET. Impostare la modalità di campionamento regolare e la finestra energetica a 250-650 keV.</li>
	<li>Prelevare due campioni di sangue da 200 μl rispettivamente a circa 15 e 18 minuti dall'inizio dell'iniezione di 11C-AcAc. Iniettare soluzione salina eparinizzata nel catetere dopo ogni prelievo per evitare la coagulazione del sangue. Registrare il tempo all'inizio e alla fine di ogni prelievo e utilizzare il tempo medio. Centrifugare a 6.000 giri/min per 5 minuti e raccogliere il plasma. Misurare l'attività radioattiva nel plasma mediante un contatore gamma calibrato con lo scanner PET.</li>
	<li>Al termine della scansione con 11C-AcAc, attendere un periodo di 20 minuti per assicurarsi che la maggior parte della radioattività sia decaduta. Tale periodo può variare da 15 a 30 minuti. Non spostare il lettino dello scanner e lasciare il ratto sotto isoflurano per tutta la durata di questo intervallo.</li>
	<li>Nel frattempo, utilizzando una soluzione concentrata di 18F-FDG (~5,5 GBq/μl), preparare una siringa contenente circa 50 MBq. Procedere esattamente come indicato nei passaggi 2.6 e 2.7. Avviare un'acquisizione dinamica della durata totale di 40,5 minuti, inclusi i 30 secondi precedenti l'iniezione. Prelevare due campioni di sangue da 200 μl rispettivamente a circa 30 e 35 minuti dall'inizio dell'iniezione di 18F-FDG.</li>
	<li>Al termine dell'acquisizione con 18F-FDG, effettuare un ultimo prelievo di sangue da 200 μl. Centrifugare e raccogliere il plasma. Conservare i campioni di plasma a -80 °C per l'analisi di glucosio e AcAc.</li>
	<li>Infine, posizionare il ratto su un tappetino riscaldante durante il periodo di risveglio. Mantenere l'animale per un follow-up longitudinale oppure, in alternativa, eutanizzare il ratto per il prelievo cerebrale e ulteriori studi biochimici.</li>
	<li>Ricostruire le immagini PET secondo le seguenti sequenze temporali: 1 × 30 sec; 12 × 5 sec; 8 × 30 sec; e n × 300 sec, dove n = 3 per l'acquisizione di 11C-AcAc e n = 7 per l'acquisizione di 18F-FDG.</li>
</ol>
3. Analisi del glucosio plasmatico e degli AcAc
<ol>
	<li>Misurare il glucosio plasmatico e l'acetoacetato (AcAc) con un analizzatore di chimica clinica. Eseguire i saggi entro 48 ore dal prelievo del sangue per minimizzare la decarbossilazione dell'AcAc in acetone. Misurare la concentrazione di glucosio con il kit DF40 come descritto in precedenza18 e l'AcAc con un canale aperto2. Questo tipo di analizzatore è più accurato rispetto alle strisce (0,1 μM) e presenta una finestra di rilevamento ampia.</li>
</ol>
4. Analisi quantitativa della PET
<ol>
	<li>Utilizzare il software PMOD o un sistema equivalente per l'analisi delle immagini PET da piccoli animali.</li>
	<li>Curva temporale di attività plasmatica (TAC)
	<ol>
		<li>Caricare i dati di 18F-FDG. Sommare i fotogrammi dell'immagine dei primi 60 secondi successivi all'iniezione (quando il tracciante è principalmente nel sangue).</li>
		<li>Utilizzando uno strumento di disegno manuale, tracciare un volume di interesse (VOI) sulla cavità del ventricolo sinistro nel pool ematico (un'ampia zona centrata nella parte inferiore delle immagini). Disegnare il VOI a circa 1 mm all'interno del margine del pool ematico (voxel rossi) per assicurarsi che non venga inclusa alcuna componente tissutale ed evitare che la radioattività tissutale si riversi nel pool ematico (Figura 1A). Copiare il VOI su tutta la serie dinamica di immagini e generare una curva di radioattività in funzione del tempo (TAC).</li>
		<li>In un foglio elettronico, utilizzare i conteggi di radioattività dei due campioni plasmatici prelevati durante l'acquisizione per correggere la TAC plasmatica (Figura 1B). Utilizzare la seguente equazione: 
		<img alt="Formula di correzione IDIF, metodo di correzione dell'immagine; equazioni; concetto di analisi dati scientifici" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/50761/50761eq1.jpg" width="500" data-altupdatedat="1787630408000"> 
		È possibile effettuare un certo livellamento della TAC plasmatica.</li>
		<li>Verificare se è presente radioattività residua da 11C-AcAc nei primi 30 secondi dell'acquisizione di 18F-FDG, prima dell'iniezione. In caso affermativo, sottrarre il seguente fattore da tutti i successivi intervalli temporali della TAC: 
		<img alt="Diagramma dell'equazione di decadimento esponenziale, R×e^{-(ln2/t_{1/2})×T}, analisi del decadimento radioattivo." fo:content-width="1.5in" src="/files/ftp_upload/50761/50761eq2.jpg" width="150" data-altupdatedat="1787630408000">, 
		dove R è la radioattività residua, t1/2 è il tempo di dimezzamento del 11C (20,4 min) e T è l'intervallo temporale2,13. La radioattività residua da 11C-AcAc dopo un periodo di attesa di 20 minuti può raggiungere fino all'1,5% dei conteggi massimi di 18F-FDG.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Coregistrazione 18F-FDG/MRI
	<ol>
		<li>Applicare la coregistrazione ottenuta con le immagini di 18F-FDG anche alle immagini di 11C-AcAc. Questo è necessario perché le immagini di 11C-AcAc presentano un basso rapporto segnale-rumore e la coregistrazione automatica risulta difficile.</li>
		<li>Caricare i dati MRI corrispondenti. Caricare tutti e 28 i fotogrammi temporali di 18F-FDG nella stessa orientazione delle immagini MR (su tre assi).</li>
		<li>Calcolare l'immagine sommata di 18F-FDG dei 28 fotogrammi temporali. Questo genera un'immagine con un numero maggiore di conteggi, rendendola più facile da utilizzare per la coregistrazione con MRI rispetto ai singoli fotogrammi.</li>
		<li>Eseguire la coregistrazione automatica dell'immagine sommata di 18F-FDG sulle immagini MR (Figura 2). Applicare la trasformazione a tutti i singoli fotogrammi di 18F-FDG. Salvare la trasformazione che in seguito verrà applicata alle immagini di 11C-AcAc.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Volumi di interesse (VOI)
	<ol>
		<li>Utilizzando un software di segmentazione come PMOD, selezionare i dati MRI e scegliere il piano preferito per il disegno manuale. Scegliere lo strumento di disegno manuale o semiautomatico, a seconda delle dimensioni della regione cerebrale e del contrasto dell'immagine. Localizzare le strutture cerebrali in base a un atlante standard del cervello di ratto19.</li>
		<li>Disegnare i VOI. Come mostrato in Figura 3, segmentare l'intero cervello, la corteccia, l'ippocampo, lo striato e il cervelletto, ma possono essere scelte anche altre regioni. Salvare i VOI, che verranno applicati alle immagini coregistrate di 18F-FDG e 11C-AcAc.</li>
		<li>Applicare i VOI alle immagini coregistrate di 18F-FDG. Selezionare le statistiche dei VOI per visualizzare la TAC cerebrale. Se necessario, correggere la TAC sottraendo da tutti i successivi intervalli temporali la media della radioattività corretta per il decadimento nei primi 30 secondi.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Calcolo del tasso metabolico cerebrale
	<ol>
		<li>Caricare le TAC cerebrali e plasmatiche corrispondenti.</li>
		<li>Selezionare il modello cinetico del grafico di Patlak20,21. Impostare la costante aggregata a 0,4822 e la corrispondente concentrazione plasmatica di glucosio (Figura 4B). Impostare la deviazione relativa massima dal grafico di Patlak al 5%. Adattare i dati al modello.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Immagini di 11C-AcAc
	<ol>
		<li>Calcolare l'immagine sommata di 18F-FDG dei primi 24 fotogrammi temporali per avere lo stesso numero di fotogrammi dell'acquisizione di 11C-AcAc. In caso contrario, la coregistrazione di 11C-AcAc/MRI fallisce. Eseguire la coregistrazione automatica di 18F-FDG su MRI. Salvare il processo di trasformazione che verrà utilizzato per la coregistrazione delle immagini di 11C-AcAc.</li>
		<li>Ripetere i passaggi 4.2 e 4.3 per le immagini di 11C-AcAc. Utilizzare la trasformazione di 18F-FDG del passaggio 4.6.1 e applicarla a tutti i singoli fotogrammi di 11C-AcAc. Ripetere i passaggi 4.4 e 4.5 e utilizzare i VOI salvati di 18F-FDG. Impostare la costante aggregata a 1.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Passaggi critici
Un passaggio fondamentale in questo protocollo PET a doppio tracciante è quello di essere in grado di scansionare contemporaneamente il ventricolo sinistro del cuore e il cervello. Ciò richiede uno scanner PET con una lunghezza assiale sufficiente, ovvero un minimo di 7,5 cm. Sono necessarie alcune scansioni di prova per determinare la posizione esatta del tavolo dello scanner (valori x, y e z), dove il cervello e il cuore vengono scansionati correttamente.
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Contesto e Logica
La tomografia a emissione di positroni (PET) consente lo studio minimamente invasivo dei processi funzionali nel cervello. Il glucosio è il principale substrato energetico del cervello, ma in condizioni di carenza di glucosio, i chetoni (acetoacetato [AcAc] e β-idrossibutirrato) sono i principali substrati energetici alternativi. Il metabolismo energetico cerebrale è stato ampiamente studiato dalla PET utilizzando il tracciante PET più comune, il 18F-fluorodesossiglucosio (18F-FDG), un analogo del glucosio. Il nostro gruppo ha recentemente sviluppato un nuovo radiotracciante -11C-AcAc - per misurare il metabolismo dei chetoni cerebrali1. La risonanza magnetica (MRI) è una tecnica a risoluzione molto più elevata (0,1 mm × 0,1 mm di risoluzione in piano) rispetto alla PET, ed è necessaria per localizzare chiaramente le regioni anatomiche del cervello necessarie per l'analisi PET regionale del metabolismo energetico cerebrale.
I dati PET sono comunemente espressi come valori di assorbimento standardizzati (SUV)2-6. I SUV sono la concentrazione di attività tissutale normalizzata dalla frazione della dose iniettata/peso unitario, come inizialmente proposto oltre 70 anni fa7. Queste unità sono ancora ampiamente utilizzate perché richiedono metodologie di acquisizione PET e analisi delle immagini più semplici. Tuttavia, una limitazione importante è che i SUV sono unità relative e non assolute, il che rende difficile confrontare i risultati tra diversi studi. Questa difficoltà di confronto può contribuire a risultati contraddittori in letteratura sull'assorbimento del glucosio cerebrale negli anziani8. Pertanto, il tasso metabolico cerebrale quantitativo (CMR; μmol/100 g/min) presenta particolari vantaggi9-11. La generazione dei valori di CMR richiede un'acquisizione dinamica della PET e la radioattività del plasma conta in funzione del tempo, ovvero della curva tempo-attività del plasma (TAC) o funzione di input. La funzione di input può essere ottenuta mediante più prelievi di sangue durante l'acquisizione PET9,12 o con il metodo IDIF (image-derived input function), in cui una regione di interesse viene disegnata su un pool di sangue (ventricolo sinistro del cuore o arteria maggiore)11,13-16.
Obiettivo
Lo scopo del nostro metodo era quello di confrontare quantitativamente per la prima volta l'assorbimento dei due substrati energetici chiave del cervello, glucosio e chetoni, utilizzando la PET e la risonanza magnetica nei roditori. 11C-AcAc e 18F-FDG sono stati utilizzati in sequenza nello stesso animale. Il protocollo è stato progettato per misurare le captazioni regionali in diverse strutture cerebrali rilevanti (corteccia, ippocampo, striato e cervelletto) chiaramente visibili nelle immagini RM. Il protocollo era anche specificamente destinato a consentire l'analisi quantitativa dell'assorbimento del cervello tracciante, ovvero la CMR sia di 18F-FDG che di 11C-AcAc. Sebbene questo protocollo sia stato sviluppato per studiare i substrati energetici del cervello, i radiotraccianti che abbiamo utilizzato potrebbero essere sostituiti da altri e la stessa metodologia può essere utilizzata per studiare diversi processi funzionali cerebrali.
Vantaggi rispetto ai metodi esistenti
PET e MRI non richiedono che l'animale venga sacrificato dopo l'acquisizione. Pertanto, sono possibili studi di follow-up sui trattamenti. Pertanto, i dati di base seguiti da una condizione sperimentale possono essere misurati all'interno dello stesso animale, riducendo così sia la variabilità biologica che il numero di animali richiesti. Un vantaggio chiave del nostro protocollo PET a doppio tracciante è quello di confrontare l'assorbimento di entrambi i traccianti nello stesso animale nelle stesse condizioni fisiologiche all'interno della stessa sessione di imaging, riducendo così ulteriormente la variabilità biologica e le discrepanze sistematiche. Questo protocollo PET a doppio tracciante è fattibile principalmente a causa della breve emivita fisica di 11C (20,4 min) e del rapido dilavamento biologico di 11C-AcAc, che lasciano una minima radioattività residua di 11C durante la seconda acquisizione con 18F-FDG. La risonanza magnetica è una caratteristica importante di questo protocollo in quanto consente di studiare l'assorbimento del tracciante in specifiche aree cerebrali. Inoltre, questo metodo consente una misura quantitativa assoluta dell'assorbimento del tracciante cerebrale rispetto alle unità relative ottenute con il metodo SUV. Infine, 11immagini C-AcAc hanno un basso rapporto segnale/rumore a causa dell'assorbimento cerebrale relativamente basso di AcAc in condizioni fisiologiche, il che rende difficile la registrazione automatica di 11immagini C-AcAc e RM. Quindi, poiché le acquisizioni di 11C-AcAc e 18F-FDG sono sequenziali (nessun movimento dell'animale), l'allineamento tra 18F-FDG e risonanza magnetica può essere applicato a 11immagini C-AcAc.
Documenti chiave in cui è stato utilizzato il protocollo
Abbiamo utilizzato il protocollo PET a doppio tracciante in uno studio che prevede il confronto tra lo stato a digiuno e la dieta chetogenica (KD) in giovani ratti2. Abbiamo dimostrato che sia il digiuno che la KD aumentano significativamente sia l'assorbimento cerebrale di 11C-AcAc che di 18F-FDG. Tuttavia, questi non erano risultati quantitativi in quanto all'epoca non utilizzavamo l'imaging PET dinamico e la metodologia di modellazione cinetica del tracciante. Successivamente, abbiamo intrapreso uno studio regionale e quantitativo del metabolismo cerebrale in ratti anziani, in cui sono stati valutati l'effetto dell'invecchiamento e di un KD sull'assorbimento cerebrale di 11C-AcAc e 18F-FDG11. Abbiamo anche dimostrato che la percentuale di distribuzione tra le regioni del cervello era diversa tra 11C-AcAc e 18F-FDG. Inoltre, non solo la CMR di 11C-AcAc, ma anche quella di 18F-FDG era aumentata in tutto il cervello e nello striato di ratti anziani trattati con KD.

<table><tbody><tr><td>Scanner MRI</td><td>Varian</td><td></td><td>7 Tesla</td></tr><tr><td>Scanner PET per piccoli animali</td><td>Gamma Medica</td><td></td><td>Lab-PET/-Triumph</td></tr><tr><td>Tappetino termico</td><td>Sunbeam</td><td>PN 143937</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di riscaldamento</td><td>SA Instruments</td><td>761 100 Rev B</td><td></td></tr><tr><td>Respiratorio</td><td>SA Instruments</td><td>SAII's P-resp</td><td></td></tr><tr><td>Analizzatore di chimica clinica</td><td>Siemens Healthcare Diagnosis</td><td>765000.931</td><td>Dimension Xpand Plus</td></tr><tr><td>Tubo in polietilene 50&nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>427411</td><td></td></tr><tr><td>Pompa iniezione</td><td>KD Scientific</td><td>Modello 210</td><td></td></tr><tr><td>Contatore gamma</td><td>GMI</td><td>Packard Cobra II</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>75002416</td><td>Heraeus Pico 21</td></tr><tr><td>Software PMOD</td><td>Tecnologie</td><td></td><td>PMOD Versione PMOD 3.2</td></tr><tr><td>Contatore Geiger</td><td>Fluke Biomedical</td><td>ASM-990</td><td></td></tr><tr><td>Reagente</td><td></td><td></td><td></td></tr> per misuratore di rilevamento avanzato <tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott Laboratories, Ltd</td><td>B506</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di NaCl allo 0,9%</td><td>Hospira</td><td>4888010</td><td></td></tr><tr><td>Eparina</td><td>Sandoz</td><td>1004336</td><td></td></tr><tr><td>Isopropil acetato</td><td>Aldrich</td><td>11778</td><td>99%</td></tr> <tr><td>Metillitio</td><td>Aldrich</td><td>197343</td><td>1,6 M</td></tr><tr><td>THF</td><td>Aldrich</td><td>87371</td><td></td></tr><tr><td>Cartuccia reagente Flex glucosio</td><td>Siemens Healthcare Diagnosi</td><td>DF40</td><td></td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma</td><td>T6066-500G</td><td>preparare tris tampone 100 mM pH 7,0</td></tr><tr><td>Ossamato di sodio</td><td>Sigma</td><td>O2751</td><td>20 mM</td></tr><tr><td>NADH</td><td>Roche</td><td>10128015001</td><td>0,15 mM</td></tr><tr><td>b-idrossibutirrato deidrogenasi</td><td>Toyobo</td><td>HBD-301</td><td>1 U/ml</td></tr></tbody></table>

un protocollo pet-mri a doppio tracciante per la misura quantitativa dell'assorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto

A Dual Tracer PET-MRI Protocol for the Quantitative Measure of Regional Brain Energy Substrates Uptake in the Rat

Presentiamo un metodo per confrontare l'assorbimento dei due substrati energetici chiave del cervello: glucosio e chetoni (acetoacetato [AcAc] in questo caso) nel ratto. Il metodo sviluppato è un protocollo di tomografia a emissione di positroni (PET) per piccoli animali, in cui 11C-AcAc e 18F-fluorodesossiglucosio (18F-FDG) vengono iniettati in sequenza in ciascun animale. Questa acquisizione di PET a doppio tracciante è possibile grazie alla breve emivita di 11C (20,4 min). I ratti vengono inoltre sottoposti a un'acquisizione di risonanza magnetica (MRI) sette giorni prima del protocollo PET. Prima dell'analisi delle immagini, le immagini PET e MRI vengono registrate congiuntamente per consentire la misurazione della captazione cerebrale regionale (corteccia, ippocampo, striato e cervelletto). Una misura quantitativa dell'assorbimento cerebrale di 11C-AcAc e 18F-FDG (tasso metabolico cerebrale; μmol/100 g/min) è determinata mediante modellazione cinetica utilizzando il metodo IDIF (image-derived input function). Il nostro nuovo protocollo PET a doppio tracciante è robusto e flessibile; I due traccianti utilizzati possono essere sostituiti da diversi radiotraccianti per valutare altri processi nel cervello. Inoltre, il nostro protocollo è applicabile allo studio dell'apporto di carburante cerebrale in molteplici condizioni come il normale invecchiamento e patologie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer e il Parkinson.

Come mostrato nella Figura 2, l'assorbimento di 11C-AcAc è basso all'interno del cervello stesso. Come menzionato in precedenza, il consumo di chetoni da parte del cervello è molto ridotto in caso di digiuno a breve termine. L'assorbimento di 11C-AcAc è più elevato nei muscoli della lingua e delle guance. In effetti, i chetoni vengono rapidamente captati dai muscoli scheletrici del ratto23. Al contrario, l'assorbimento di 18F-FDG è prevalentemente localizzato n...

La tomografia a emissione di positroni per piccoli animali consente di valutare i due principali substrati energetici del cervello: glucosio e chetoni. Nel presente metodo, 11C-acetoacetato e 18F-fluorodesossiglucosio vengono iniettati in sequenza in ciascun animale e il loro assorbimento viene misurato quantitativamente in specifiche regioni cerebrali determinate dalle immagini di risonanza magnetica.

Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dell'assorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto

We present a method for comparing the uptake of the brain&#39;s two key energy substrates: glucose and ketones (acetoacetate [AcAc] in this case) in the ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è confrontare quantitativamente l'assorbimento regionale dei due principali substrati energetici del cervello, glucosio e corpi chetonici, utilizzando PET e MRI nei roditori. Questo viene ottenuto innanzitutto acquisendo un'immagine mediante risonanza magnetica del cervello per localizzare le regioni anatomiche cerebrali. Come secondo passaggio, vengono effettuate acquisizioni PET con acetacetato marcato con carbonio-11 e fluoro-18 fluorodesossiglucosio (FDG), che forniscono immagini dell'assorbimento cerebrale di corpi chetonici e glucosio. Successivamente, le immagini PET e MR vengono coregistrate.Per misurare l'assorbimento cerebrale regionale di entrambi i traccianti PET, si ottengono risultati che mostrano il tasso metabolico cerebrale regionale di glucosio e corpi chetonici, basati sulle curve di attività nel tempo del cervello e del plasma. Questa tecnica può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo del metabolismo energetico cerebrale durante l'invecchiamento, ad esempio se il deterioramento del metabolismo del glucosio con l'età si verifichi anche per i corpi chetonici, principale fonte di energia alternativa del cervello. L'effettivo campo visivo dello scanner rappresenterà un fattore e un vincolo importanti per acquisire correttamente immagini sia del cervello che del cuore.Il modello animale attuale richiederà un campo visivo di 7,5 centimetri per ospitare la distribuzione degli organi bersaglio. Scansioni di prova localizzeranno la posizione finale del tavolo dello scanner. Abbiamo aggiunto l'idea per questo metodo quando abbiamo realizzato che i chetoni erano importanti per il metabolismo energetico cerebrale, ma quasi nulla era noto al riguardo.Come il cervello li utilizza Dimostrare la procedura verrà osservata con calma. Una professionista della ricerca e Michelle Ett, studentessa laureata del Centro di Imaging Molecolare di Sherbrooke, iniziano consentendo ai ratti di acclimatarsi nella struttura per animali per un periodo minimo di sette giorni prima di iniziare questo protocollo, quindi eseguono scansioni cerebrali mediante risonanza magnetica (MRI) da una a due settimane prima della PET con doppio tracciante, per consentire al soggetto un completo recupero dall'anestesia. Posizionare il ratto sul tavolo dell'esame MRI in posizione prona con la testa in avanti e posizionare un cono nasale per l'isoflurano.Posizionare anche le sonde per la respirazione e rettali in modo da poter monitorare la frequenza respiratoria e mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius mediante un sistema automatico di riscaldamento dell'aria. Acquisire immagini RM pesate in T2 del cervello utilizzando una sequenza impulsiva a eco di spin rapido. Al termine dell'imaging, posizionare il ratto su un tappetino riscaldato e monitorarne il recupero dall'anestesia da una a due settimane dopo la risonanza magnetica. Digiunare il ratto per 18 ore prima dello scanning PET.Utilizzare uno scanner per piccoli animali dotato di rilevatori a fotodiodo a valanga e un campo visivo assiale di circa 7,5 centimetri con una risoluzione spaziale isotropica di 1,2 millimetri. Iniziare posizionando il ratto in una camera di induzione. Successivamente, trasferire il ratto su un tappetino riscaldante munito di cono nasale per l'isoflurano e assicurarsi che l'animale sia completamente anestetizzato prima dell'imaging.Iniziare la sintesi dell'acetoacetato di carbonio 11 in questo momento, poiché la sintesi richiede 18 minuti a partire dalla fine del bombardamento. Preparare inoltre un catetere in polietilene PE 50 riempito con soluzione di cloruro di sodio 0,9% eparinizzato. Posizionare il ratto sul fianco e inserire il catetere nella vena della coda per l'iniezione del tracciante.Installare un secondo catetere nell'arteria caudale ventrale mediale per il prelievo di campioni di sangue durante tutte le acquisizioni. Trasferire ora rapidamente il ratto sul tavolo dello scanner in posizione prona con la testa in avanti, con il cono nasale posizionato. Successivamente, spostare il tavolo dello scanner all'interno dello strumento per garantire un'adeguata imaging del cervello e del cuore simultaneamente, posizionando come riferimento anatomico il margine del campo visivo sugli occhi del ratto.Monitorare la frequenza respiratoria e mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius per tutta la durata dell'esperimento. Successivamente, utilizzando una soluzione concentrata di acetacetato di carbonio 11 di circa un giga ERL per millilitro, preparare una siringa contenente circa 50 megal di radioattività. Un intervallo compreso tra 45 e 55 megal è accettabile.Quindi, regolare il volume a 300 microlitri con soluzione fisiologica. Montare la siringa in una pompa per iniezioni e impostare l'iniezione in bolo del tracciante radioattivo a una velocità di un millilitro al minuto per una durata dell'iniezione di circa 19 secondi. Successivamente, impostare una seconda pompa per somministrare immediatamente 300 microlitri di soluzione fisiologica a una velocità di un millilitro al minuto, al fine di garantire un'ottimale iniezione del tracciante nella circolazione sanguigna.Impostare la modalità di campionamento normale e la finestra energetica tra 250 e 650 chilo elettronvolt e avviare l'acquisizione dinamica dei dati pet 30 secondi prima dell'iniezione bolus. La durata totale della scansione deve essere di 20 minuti e 30 secondi. La 32ª acquisizione prima dell'iniezione del tracciante fornisce una misura del fondo ambientale che verrà successivamente sottratto dai dati pet.Prelevare due campioni di sangue da 200 microlitri ciascuno circa 15 e 18 minuti dopo l'inizio dell'iniezione di acetacetato marcato con Carbonio-11 e iniettare soluzione salina eparinizzata nel catetere dopo ogni prelievo per evitare la coagulazione del sangue. Annotare l'orario all'inizio e alla fine del prelievo del sangue e calcolare il tempo medio. I campioni devono essere centrifugati a 6.000 giri al minuto per cinque minuti per raccogliere il plasma.Quindi si misurano i conteggi di radioattività utilizzando un contatore a gamma calibrato con lo scanner PET. Dopo la scansione con acetacetato marcato con carbonio-11, attendere un periodo di 20 minuti per assicurarsi che la maggior parte della radioattività sia decaduta. Durante questo intervallo, utilizzando una soluzione concentrata di FDG, preparare una siringa di circa 50 megal.Regolare nuovamente il volume con soluzione salina e impostare la pompa di infusione come descritto in precedenza. Avviare ora un'acquisizione dinamica della durata totale di 40,5 minuti, inclusi nuovamente 30 secondi prima dell'iniezione. Raccogliere due campioni di sangue da 200 microlitri ciascuno a circa 30 e 35 minuti dall'inizio dell'iniezione di FDG.Quindi, al termine dell'acquisizione con FDG, prelevare un ultimo campione di sangue di 200 microlitri. Una volta completata la scansione, ricostruire le immagini PET secondo il seguente intervallo temporale: sequenze di uno per 30, 12 per cinque, otto per 30 e n per 300 secondi, dove n è uguale a tre per l'acquisizione con carbonio 11 ACETOACETATO e n è uguale a sette per l'acquisizione con FDG. Per iniziare l'analisi, utilizzare il software in modalità P o un sistema equivalente per l'analisi di immagini PET da piccoli animali al fine di generare una curva di attività plasmatica nel tempo.Caricare innanzitutto i dati FDG, quindi alcune immagini relative ai primi 60 secondi successivi all'iniezione, quando il tracciante si trova principalmente nel sangue. Successivamente, utilizzando uno strumento di disegno manuale, tracciare una regione di interesse o VOI all'interno della cavità del ventricolo sinistro, approssimativamente di un millimetro al di sotto del margine della massa ematica. Questo accorgimento evita l'inclusione di tessuto e previene il riversamento dell'attività radioattiva tissutale all'interno della massa ematica.Quindi copiare la VOI nell'intera serie di immagini dinamiche e generare una curva di radioattività in funzione del tempo. Successivamente, in un foglio di calcolo, utilizzare i conteggi di radioattività dei due campioni di plasma prelevati durante l'acquisizione per correggere la curva temporale di attività plasmatica. Utilizzare l'equazione mostrata qui.Verificare inoltre la presenza di radioattività residua derivante dall'acetoacetato di carbonio 11 nei primi 30 secondi dell'acquisizione FDG prima dell'iniezione. In caso affermativo, sottrarre il seguente fattore da tutti i successivi intervalli temporali della curva di attività nel tempo. Successivamente, caricare tutti e 28 gli intervalli temporali FDG nella stessa orientazione delle immagini RM e calcolare l'immagine FDG sommata.Eseguire quindi la co-registrazione automatica dell'immagine sommata di FDG sulle immagini RM. Applicare la trasformazione a tutti i singoli fotogrammi dell'immagine FDG e salvare la trasformazione, che in seguito verrà applicata alle immagini di acetacetato di carbonio 11. Questo è necessario poiché il carbonio 11.Le immagini dell'acetoacetato hanno un rapporto segnale-rumore basso e la co-registrazione automatica è difficile. Successivamente, utilizzando un software di segmentazione, selezionare i dati della risonanza magnetica e scegliere il piano preferito per il disegno manuale. Lo strumento di disegno manuale o semiautomatico può essere utilizzato in base al cervello, alle dimensioni della regione e al contrasto dell'immagine.Individuare le strutture cerebrali in base a un segmento standard dell'atlante cerebrale del ratto: la corteccia cerebrale completa, l'ippocampo, il corpo striato e il cervelletto come mostrato qui, oppure altre regioni se necessario. Salvare le ROI (regioni di interesse), che verranno applicate alle immagini coregistrate di FDG e acetoacetato al carbonio-11. Applicare innanzitutto le ROI alle immagini di FDG coregistrate.Se necessario, selezionare le statistiche VO i per visualizzare la curva di attività cerebrale nel tempo. Correggere la curva sottraendo l'attività radioattiva media corretta per il decadimento dei primi 30 secondi da tutti i successivi intervalli temporali per eseguire il calcolo della velocità metabolica cerebrale; caricare le curve di attività nel tempo per il cervello e il plasma corrispondente. Quindi selezionare il modello cinetico del grafico LAC e impostare la costante raggruppata a 0,48 e la corrispondente concentrazione plasmatica.Impostare la deviazione relativa massima dal grafico plac al 5% e adattare i dati al modello. Successivamente, eseguire la co-registrazione della acetoacetato al carbonio-11 con la risonanza magnetica. Calcolare innanzitutto l'immagine sommata di FDG dei primi 24 intervalli temporali, in modo da ottenere lo stesso numero di frame dello scan dell'acetoacetato al carbonio-11.Quindi utilizzare il processo di trasformazione FDG con MRI per la co-registrazione delle immagini di acetacetato di carbonio-11. Ripetere i calcoli della curva di attività nel tempo del plasma e i passaggi di co-registrazione per le immagini di acetacetato di carbonio-11. Applicare la trasformazione FDG a tutti i singoli fotogrammi delle immagini di acetacetato di carbonio-11.Infine, utilizzare i VOI salvati di FDG e, nuovamente, calcolare il tasso metabolico cerebrale, impostando la costante aggregata pari a uno. Qui possiamo osservare che durante il processo di co-registrazione, le immagini RM rimangono fisse mentre le immagini PET si spostano a causa dell'allineamento nel piano assiale. Questo grafico mostra la modellizzazione cinetica dell'assorbimento cerebrale di FDG a livello dell'intero cervello.Dopo l'assorbimento cerebrale, utilizzando il software in modalità P, si raggiunge lo stato stazionario. La curva risulta in una linea retta il cui coefficiente angolare rappresenta il flusso cerebrale in ingresso. I valori tipici del flusso in ingresso cerebrale e del volume di distribuzione nell'intero cervello per il FDG sono rispettivamente di circa 0,0165 al minuto alla meno uno e di circa 0,6425 millilitri di sangue per millilitro di tessuto.Il tasso metabolico cerebrale atteso del glucosio nell'intero cervello è di circa 25 micromoli al minuto per 100 grammi seguendo questa procedura. Possono essere eseguiti altri metodi, come il prelievo di sangue venoso, per rispondere a domande aggiuntive. Ad esempio, l'espressione dei trasportatori cerebrali di glucosio e corpi chetonici è modificata in una condizione specifica?Con lo sviluppo di questa tecnica, abbiamo aperto una nuova finestra per i ricercatori interessati al metabolismo degli antigeni cerebrali, consentendo lo studio di processi fisiologici e patologici coinvolti nell'invecchiamento, nelle malattie neurodegenerative e nello sviluppo e trattamento dei tumori in modelli animali roditori e in altri modelli animali. Il lavoro con le radiazioni richiede precauzioni aggiuntive. Manipolazione del tracciante radioattivo dietro uno schermo di piombo.Indossare un dosimetro corporeo e uno ad anello è obbligatorio per questo esperimento. Effettuare controlli del personale e del locale utilizzando un Geiger è fondamentale per mantenere un'area di lavoro libera da contaminazioni.

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Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dell'assorbimento di substrati energetici cerebrali regionali nel ratto

Il danno cerebrale derivante dall'ischemia cerebrale può essere esaminato in modo non invasivo e studiato nei ratti utilizzando la tomografia a emissione di positroni preclinica accoppiata con la sonda radioattiva iniettabile, 18F-fluorodesossiglucosio. Inoltre, l'uso di moderni strumenti software che includono modelli cerebrali VOI (Volume of Interest) aumenta notevolmente le informazioni quantitative raccolte da questi studi.

Imaging non invasiva e analisi di ischemia cerebrale in ratti Living Utilizzando Positron Emission Tomography con<sup&gt; 18</sup&gt; F-FDG

Il metodo qui presentata utilizza simultaneamente la tomografia ad emissione di positroni e la risonanza magnetica. Nel modello di ipossia-ischemia cerebrale, cambiamenti dinamici nel metabolismo del glucosio e diffusione si verificano durante e dopo l'infortunio. Il danno in continua evoluzione e irriproducibile in questo modello richiede la simultanea acquisizione se dati di imaging multimodali significativi devono essere acquisite.

Simultanea Imaging PET / MRI Durante mouse cerebrale ipossia-ischemia

Abbiamo applicato la stimolazione magnetica transcranica ripetitiva (rTMS) all'emisfero unilaterale del cervello di ratto, posizionando una bobina a forma di 8 da 25 mm 1 cm lateralmente al vertice sulla linea biauricolare e angolando la bobina di 45°. Per rTMS è stato utilizzato un sistema di raffreddamento ad acqua interno per più di 20 minuti.

Repetitive stimolazione magnetica transcranica al unilaterale emisfero del cervello di ratto

La sintesi proteica è un processo biologico critico per le cellule. Nel cervello, è necessario per le modifiche adattive. La misurazione dei tassi di sintesi proteica nel cervello intatto richiede un'attenta considerazione metodologica. Qui presentiamo il metodo autoradiografico quantitativo L-[1-14C]-leucina per la determinazione dei tassi regionali di sintesi delle proteine cerebrali in vivo.

Metodo autoradiografico quantitativo per la determinazione dei tassi regionali di sintesi proteica cerebrale in vivo

Dopo aver controllato di sangue-ossigeno-livello-dipendente funzionale imaging a risonanza magnetica (fMRI grassetto) che la corrispondente zona della corteccia somatosensoriale barile campo (chiamata S1BF) è correttamente attivato, il principale obiettivo di questo studio è quello di quantificare il contenuto del lattato fluttuazioni nei cervelli del ratto attivati dalla spettroscopia di risonanza magnetica del protone localizzata (1H-MRS) a 7 T.

Spettroscopia di risonanza magnetica funzionale a 7 T nella corteccia di canna del ratto durante l'attivazione Whisker

Questo manoscritto descrive due protocolli di amministrazione del radiotracer per FDG-PET (infusione costante e bolus plus infusione) e li confronta con l'amministrazione del bolo. Le risoluzioni temporali di 16 s sono realizzabili utilizzando questi protocolli.

Radiotracer Administration for High Temporal Resolution Positron Emission Tomoography of the Human Brain: Application to FDG-fPET

Questo protocollo ha lo scopo di monitorare i cambiamenti in vivo della mielina (demielinazione e remielinazione) mediante l'imaging della tomografia ad emissione di positroni (PET) in un modello animale di sclerosi multipla.

Imaging tomografico ad emissione di positroni per la misurazione in vivo del contenuto di mielina nel modello di ratto di lisolecitina della sclerosi multipla

Questo protocollo descrive un metodo per ottenere dati stabili di risonanza magnetica funzionale (rs-fMRI) allo stato di riposo da un ratto utilizzando isoflurano a basso dosaggio in combinazione con dexmedetomidina a basso dosaggio.

Acquisizione dei dati di risonanza magnetica funzionale a riposo nel ratto

Qui, presentiamo un protocollo sperimentale di imaging per la quantificazione della funzione cardiaca e della morfologia utilizzando la tomografia ad emissione di positroni ad alta risoluzione / tomografia computerizzata per piccoli animali. Vengono considerati sia i topi che i ratti, discutendo i diversi requisiti degli agenti di contrasto della tomografia computerizzata per le due specie.

Tomografia cardiaca ad emissione di positroni ad alta risoluzione/tomografia computerizzata per piccoli animali

Le misurazioni quantitative del metabolismo dell'ossigeno e del glucosio mediante PET sono tecnologie consolidate, ma i dettagli dei protocolli pratici sono scarsamente descritti in letteratura. Questo articolo presenta un protocollo pratico implementato con successo su uno scanner per tomografia computerizzata a emissione di positroni all'avanguardia.

Studi multi-traccianti sul metabolismo dell'ossigeno e del glucosio nel cervello utilizzando uno scanner per tomografia computerizzata con tomografia a emissione di positroni a tempo di volo

L'acquisizione di dati di tomografia dinamica a emissione di positroni (PET) e la ricostruzione in intervalli di tempo consente l'analisi della connettività cerebrale metabolica a livello di singolo soggetto. Descriviamo un metodo per acquisire dati PET dinamici [18F]FDG del cervello di ratto e ottenere una matrice di connettività attraverso l'estrazione di curve tempo-attività di volumi di interesse.

Studio della connettività cerebrale metabolica utilizzando la tomografia a emissione di positroni dinamica 2-deossi-2-[18F]Fluoro-D-glucosio a livello di singolo soggetto

Impara a misurare l'assorbimento cerebrale di glucosio e chetoni nel ratto con PET-MRI a doppio tracciante. Questo metodo quantitativo permette di studiare il metabolismo energetico cerebrale regionale e i cambiamenti legati all'invecchiamento.

Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dellassorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto (Video) | JoVE Journal

Un protocollo PET-MRI a doppio tracciante per la misura quantitativa dell'assorbimento dei substrati energetici cerebrali regionali nel ratto

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