Name: Protocolli per limplementazione di un Escherichia coli Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-09-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 16 min 11 s
Description: Scopri come implementare un sistema di espressione cellulare TX-TL basato su Escherichia coli per la biologia sintetica. Questo protocollo dettagliato permette di preparare estratti cellulari e ottimizzare le condizioni per la sintesi proteica in vitro.

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Ringraziamo Jongmin Kim, Dan Siegal-Gaskins, Anu Thubagere, e Enoch Yeung per l&#39;assistenza razionalizzare il protocollo, e Chiara Chen e Barclay Lee per l&#39;assistenza nelle prime fasi del progetto. Questo materiale si basa su lavoro sostenuto in parte dalla Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA / OMT) del programma Living Fonderie, numero di contratto HR0011-12-C-0065 (DARPA / CMO.ZZS è supportato anche da un UCLA / Caltech Medical Scientist Fellowship Program Formazione e da un DoD, Air Force Office of Scientific Research, Science National Defense and Engineering Graduate (NDSEG) Fellowship, 32 CFR 168. Le opinioni e le conclusioni contenute in questo documento sono quelle degli autori e non deve essere interpretato come rappresentazione ufficialmente politiche, esplicitamente o implicita, della Defense Advanced Research Projects Agency o il governo degli Stati Uniti.

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<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+cell-free+expression+with+the+endogenous+E.+Coli+RNA+polymerase+and+sigma+factor+70%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Efficient cell-free expression with the endogenous E. Coli RNA polymerase and sigma factor 70.</a> Journal of biological engineering. 4, 8(2010).</li>
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<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+E.+coli+Cell-Free+Expression+Toolbox%3A+Application+to+Synthetic+Gene+Circuits+and+Artificial+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">An E. coli Cell-Free Expression Toolbox: Application to Synthetic Gene Circuits and Artificial Cells.</a> Acs Synth Biol. 1, 29-41 (2012).</li>
<li>Shin, J., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Study+of+messenger+RNA+inactivation+and+protein+degradation+in+an+Escherichia+coli+cell-free+expression+system%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+biological+engineering%22%5BJournal%5D)">Study of messenger RNA inactivation and protein degradation in an Escherichia coli cell-free expression system.</a> Journal of biological engineering. 4, 9(2010).</li>
<li>Shin, J., Jardine, P., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+Replication%2C+Synthesis%2C+and+Assembly+of+the+Bacteriophage+T7+in+a+Single+Cell-Free+Reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Acs+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome Replication, Synthesis, and Assembly of the Bacteriophage T7 in a Single Cell-Free Reaction.</a> Acs Synth Biol. 1, 408-413 (2012).</li>
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<li>Karzbrun, E., Shin, J., Bar-Ziv, R. H., Noireaux, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coarse-grained+dynamics+of+protein+synthesis+in+a+cell-free+system%5BTitle%5D)+AND+%22Physical+review+letters%22%5BJournal%5D)">Coarse-grained dynamics of protein synthesis in a cell-free system.</a> Physical review letters. 106, 048104(2011).</li>
<li>Hoagland, M. B., Stephenson, M. L., Scott, J. F., Hecht, L. I., Zamecnik, P. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Soluble+Ribonucleic+Acid+Intermediate+in+Protein+Synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Soluble Ribonucleic Acid Intermediate in Protein Synthesis.</a> J Biol Chem. 231, 241-257 (1958).</li>
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<li>Zubay, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-Vitro+Synthesis+of+Protein+in+Microbial+Systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">In-Vitro Synthesis of Protein in Microbial Systems.</a> Annu Rev Genet. 7, 267-287 (1973).</li>
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<li>Kim, H. C., Kim, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+for+energizing+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+bioscience+and+bioengineering%22%5BJournal%5D)">Methods for energizing cell-free protein synthesis.</a> Journal of bioscience and bioengineering. 108, 1-4 (2009).</li>
<li>Michel-Reydellet, N., Calhoun, K., Swartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amino+acid+stabilization+for+cell-free+protein+synthesis+by+modification+of+the+Escherichia+coli+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Metabolic+engineering%22%5BJournal%5D)">Amino acid stabilization for cell-free protein synthesis by modification of the Escherichia coli genome.</a> Metabolic engineering. 6, 197-203 (2004).</li>
<li>Liu, D. V., Zawada, J. F., Swartz, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Streamlining+Escherichia+coli+S30+extract+preparation+for+economical+cell-free+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+progress%22%5BJournal%5D)">Streamlining Escherichia coli S30 extract preparation for economical cell-free protein synthesis.</a> Biotechnology progress. 21, 460-465 (2005).</li>
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<li>Tabor, S., Richardson, C. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%2Fpromoter+system+for+controlled+exclusive+expression+of+specific+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A bacteriophage T7 RNA polymerase/promoter system for controlled exclusive expression of specific genes.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 82, 1074-1078 (1985).</li>
<li>Lewicki, B. T., Margus, T., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coupling+of+rRNA+transcription+and+ribosomal+assembly+in+vivo.+Formation+of+active+ribosomal+subunits+in+Escherichia+coli+requires+transcription+of+rRNA+genes+by+host+RNA+polymerase+which+cannot+be+replaced+by+bacteriophage+T7+RNA+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+molecular+biology%22%5BJournal%5D)">Coupling of rRNA transcription and ribosomal assembly in vivo. Formation of active ribosomal subunits in Escherichia coli requires transcription of rRNA genes by host RNA polymerase which cannot be replaced by bacteriophage T7 RNA polymerase.</a> Journal of molecular biology. 231, 581-593 (1993).</li>
<li>Iskakova, M. B., Szaflarski, W., Dreyfus, M., Remme, J., Nierhaus, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Troubleshooting+coupled+in+vitro+transcription-translation+system+derived+from+Escherichia+coli+cells%3A+synthesis+of+high-yield+fully+active+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+acids+research%22%5BJournal%5D)">Troubleshooting coupled in vitro transcription-translation system derived from Escherichia coli cells: synthesis of high-yield fully active proteins.</a> Nucleic acids research. 34, e135(2006).</li>
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<li>Jewett, M. C., Forster, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Update+on+designing+and+building+minimal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Current+opinion+in+biotechnology%22%5BJournal%5D)">Update on designing and building minimal cells.</a> Current opinion in biotechnology. 21, 697-703 (2010).</li>
<li>Noireaux, V., Libchaber, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+vesicle+bioreactor+as+a+step+toward+an+artificial+cell+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A vesicle bioreactor as a step toward an artificial cell assembly.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101, 17669-17674 (2004).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Sistema di espressione cell-free TX-TL basata Il Escherichia coli endogena qui descritto è una reazione di facile conduzione tre tubo che può richiedere meno di otto ore da impostare alla raccolta dei dati. Il processo di creazione di tutti i reagenti richiede tempo totale di cinque giorni (con notevoli esigenze di lavoro in un solo giorno), ma produce estratto grezzo di 3.000 reazioni e buffer-making reagenti per 10.000 reazioni (Figura 1). Inoltre, estratto grezzo e buffer facendo reagenti sono stabili per almeno 1 anno a -80 ° C, consentendo molteplici usi di una preparazione di 4. A $ 0,11 per 10 reazione microlitri (0,26 dollari compreso il lavoro), i costi sono inferiori del 98% rispetto comparabile sistemi commerciali (Figura 2). Ci sono alcune limitazioni irrisolti, tuttavia, al sistema. L&#39;efficienza fine di ciascun preparato estratto cellulare grezzo può variare sulla base di competenza degli utenti e delle condizioni ambientali, sebbene tvariazione di rendimento ypical è compresa tra il 5-10% (Fig. 4b). Come risultato, lotto a lotto variabilità sia espressione end-point e nelle dinamiche di espressione sono da aspettarsi. Queste variazioni saranno probabilmente rimarrà fino estratto è completamente caratterizzata o fino a quando la creazione estratto è completamente automatizzato. Se il sistema di libera espressione-cella viene utilizzata per condurre esperimenti quantitativi sensibili, si consiglia di eseguire tutti gli esperimenti con la stessa produzione di estratto cellulare grezzo. La resa da un unico lotto estratto cellulare greggio, circa 3000 reazioni, dovrebbe essere sufficiente per i corsi sperimentali tipici. Anche se abbiamo il sospetto variazione può essere rimosso da scalare e automatizzare la procedura, tali tentativi comporterebbe un investimento di risorse notevole. Inoltre, anche se i livelli di espressione end-point sono ragionevolmente facile da determinare, più lavoro deve essere fatto in comprensione dinamica intrinseca al sistema cell-free. È noto che sia CONCORRENZ risorsan risorse e limitazione può influenzare le dinamiche di espressione. Ad esempio, limitato sigma endogeno 70 può risultare in un regime saturare con maggiore DNA stampo produrre un profilo di espressione analoga a quella del nucleotide o amminoacido esaurimento. 9,27 Tuttavia, dinamiche non devono essere pienamente compreso per utilizzare il sistema. Per gli aumenti puri di rendimento, ottimizzazione può essere fatto da approcci di machine-learning. 28 Questioni di competizione per le risorse e di limitazione possono essere affrontate da modelli matematici verificata utilizzando dati sperimentali. Il protocollo qui presentato è ottimizzato per un ceppo BL21-Rosetta2, ma è generalizzabile ad altri E. coli. Modifiche in BL21-Rosetta2, quali la rimozione del gene codificante lon proteasi e l&#39;aggiunta di geni codificanti tRNA rari, permettono la produzione di proteine ​​massima. Abbiamo tentato il protocollo con altri due ceppi di estratto - BL21 solo e BL21 trxA ko-and ha trovato il 50% in meno di rendimento di proteine. Noi ipotizziamo che i rendimenti allo stesso modo diminuiscono quando si utilizzano altri ceppi. Altre variazioni di parametri, come il passaggio terreno di coltura 2xYT per LB ed altri brodi ricchi, hanno portato a una diminuzione dei rendimenti delle proteine. Sistemi di espressione cell-free che utilizzano i macchinari di trascrizione-traduzione endogena ed esogena e meccanismi di regolazione hanno ampie applicazioni in proteine ​​e metaboliti di espressione e di biologia sintetica. 3,29 Invece di essere limitato a circuiti T7-regolato, si può immaginare la produzione di biomolecole complesse in un ambiente user-controllabile tramite un mix di nativo E. promotori coli e meccanismi di trascrizione e regolazione esogena in dotazione. Senza limitazioni di divisione cellulare e il metabolismo, variabilità nei circuiti sintetici come il repressilator o in multistrato vie metaboliche come quelle che producono artemisinina può essere ridotta o meglio compresa. 30,31 Noi have utilizzato questi vantaggi per implementare interruttori genetici, nonché per capire sigma fattore sequestro 9,32 Tale tecnologia può anche costituire la spina dorsale del &quot;minimal&quot; o le celle &quot;artificiali&quot; -. piccola, ben caratterizzato e autosufficienti unità incarnata estratto. 33,34 In definitiva, ci aspettiamo usi immediati di questo sistema di libera espressione di cellule endogene come un ambiente di prototipazione per la biologia sintetica. Soprannominato il &quot;TX-TL tagliere biomolecolare&quot;, il sistema di espressione cell-free offre un ambiente controllabile in cui in ultima analisi, circuiti sintetici destinati in vivo l&#39;espressione può subire turni di prototipazione - cicli di test sul plasmide di base, lineare, o DNA sintetizzati chimicamente, seguita mediante analisi e la modifica rapida. Turni prototipazione possono essere aiutati da modelli matematici predittivi attualmente in fase di sviluppo. Rimuovendo la clonazione e manipolazione vivo per i circuiti non definitive, prevediamo ingegneritempi di ciclo gneria per essere ridotto a 1-3 giorni invece dello standard attuali settimane.

A correction to Figure 5's legend has been made for the article <a href="http://www.jove.com/video/50762/protocols-for-implementing-an-escherichia-coli-based-tx-tl-cell-free">Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology</a>. Method 1 and method 2 have been switched.Z
The figure legend was update from:
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1 nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 1) or post-processed with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 2).
to
Figure 5. Effects of DNA solution on expression efficiency. a) Comparison of two different purification methods for processing plasmids. 1
nM of pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 is prepared using only a QiaPrep Spin Miniprep Kit (Purification method 2) or post-processed
with a QiaQuick PCR purification kit (Purification method 1).

A correction to Figure 5's legend has been made for the article Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology. Method 1 and method 2 have been switched.

Erratum: Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

La tecnologia libera espressione-Cell ha iniziato nel 1950 come puramente traslazionale, avanzando anni più tardi a comprendere i meccanismi di trascrizione-traduzione accoppiati con T7 DNA del batteriofago. 11,12 Da allora, sono stati compiuti numerosi sforzi per ottimizzare la creazione di estratto cellulare grezzo (o E . estratto coli S30). 13,14 Queste ottimizzazioni includono prolungare cell-free sintesi proteica attraverso la rigenerazione dell&#39;ATP o modifiche di deformazione, e riducendo i tempi ei costi di protocollo. 15-17 esistono sistemi di espressione cell-free alternativi che uso ricostituito componenti in sostituzione di greggio estratto di cellule per l&#39;espressione. 5 Sia estratto cellulare grezzo e metodi di ricostituzione sono state sviluppate per uso commerciale. Con l&#39;avvento della biologia sintetica, vi è una maggiore necessità di una piattaforma ben caratterizzato per provare ed esprimere i moduli biologici ingegnerizzati e circuiti. 18,19 Questa piattaforma deve essereversatile, ben caratterizzato, semplice da manipolare, e focalizzato sui componenti forniti dall&#39;utente. Nonostante sia sviluppato mezzo secolo prima, sistemi acellulari basano su E. coli intrinsecamente condividere questi requisiti, in quanto sono una rappresentazione semplificata in vitro dei processi cellulari senza la complessità di crescita e metabolismo. Inoltre, tutte le conoscenze fondamentali da lavoro in vivo su E. coli si applica facilmente a E. sistemi cell-free coli. Anche se i sistemi di espressione cell-free possono avere applicazioni in biologia sintetica, ad oggi l&#39;obiettivo della maggior parte dei sistemi di espressione cell-free è stata la massimizzazione delle proteine ​​e la resa metabolita. Questo viene ottenuto usando batteriofago T7 trascrizione di sequenze guidati dai promotori T7. 20 Anche se l&#39;espressione è efficiente e robusto, questi sistemi hanno uno scopo altamente specializzato. Metodi di regolazione delle cellule sono limitate, i modelli di DNA target deve essereriprogettato per includere i promotori T7, e alcune sequenze come i complessi ribosomali non possono essere trascritti e assemblati. 21,22 attuali sistemi di espressione cell-free non sono in grado di mantenere rendimenti elevati preservando meccanismi regolatori endogeni, la versatilità necessaria per la biologia sintetica. Abbiamo sviluppato un E. endogeno coli sistema di espressione cell-free che conserva l&#39;efficienza della espressione proteica dimostrata dai sistemi precedenti, ma aggiunge ulteriore versatilità, consentendo espressione e la regolazione basato su entrambi (T7 o altro) meccanismi endogeni ed esogeni. Il protocollo qui descritto si basa inizialmente su Kigawa et al. (2004) e Liu et al. (2005), ma ha modifiche significative. Utilizza Mg e K-glutammato over-Mg e K-acetato per una maggiore efficienza, rimuove 2-mercaptoetanolo, e lisa le cellule utilizzando un tallone-beater. 17,23,24 Bead-pestaggio è scelto sopra omogeneizzazione,metodi basati pressione, o sonicazione per il suo costo inferiore e rendimenti paragonabili ai sistemi concorrenti. 23 acido 3-fosfoglicerico (3-PGA) è usato come fonte di energia come è stato trovato che invia rese proteiche superiori rispetto alla creatina fosfato e fosfoenolpiruvato. 4,25 Il nostro sistema può produrre fino a 0,75 mg / ml di proteina reporter utilizzando un promotore a base sigma70-con gli operatori lambda-fago o un promotore T7-driven, simile a rese da altri sistemi commerciali. 4,6 Cinque giorni sono tenuti a produrre tutti i reagenti necessari (Figura 1). Inoltre, fornisce una riduzione dei costi del 98% rispetto ai sistemi comparabili commerciali cell-free - Costi per materie sono $ 0,11 per 10 microlitri di reazione, che sale a 0,26 dollari, con manodopera inclusa (Figura 2).

<table><tbody><tr><td>2xYT</td><td>MP biomedicals</td><td>3012-032</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>3-PGA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8937</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Bacto-agar</td><td>BD Diagnostics</td><td>214010</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Provette battitrici (microfiale in polipropilene)</td><td>BioSpec</td><td>522S</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Perline, Ø 0,1 mm</td><td>BioSpec</td><td>11079101</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>BL21 Rosetta 2 E. coli ceppo</td><td>Novagen</td><td>71402</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine Bradford BSA</td><td>Bio-rad</td><td>500-0201</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>cAMP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C1919</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CoA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4282</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>CTP</td><td>USB</td><td>14121</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cuvette, 1,5 ml</td><td>Fisher</td><td>14-955-127</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Acido folinico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F7878</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>GTP</td><td>USB</td><td>16800</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6147</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>K-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1149</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Mg-glutammato</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>49605</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Colonne per cromatografia Micro Bio-Spin Bio-RAD</td><td></td><td>732-6204</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>NAD</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N6522</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Piastre ottiche di fondo Nunc a 384 pozzetti</td><td>Thermo-Scientific</td><td>142761</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Nastro sigillante Nunc</td><td>Thermo-Scientific</td><td>232701</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>PEG-8000</td><td>Promega</td><td>V3011</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione bibasica di fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8584</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione monobasica di fosfato di potassio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8709</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Campionatore di aminoacidi RTS</td><td>5 Prime</td><td>2401530</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Cassette per dialisi Slide-A-Lyzer, 10k MWCO (kit)</td><td>Thermo-Scientific</td><td>66382</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Spermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>85558</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Fischer</td><td>BP1521</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>tRNA (da E. coli)</td><td>Roche Applied Science</td><td>MRE600</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>UTP</td><td>USB</td><td>23160</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Flacone da centrifuga da 1 litro</td><td>Beckman-Coulter</td><td>A98813</td><td>Questo è specifico per la serie Avanti J; ottenere dimensioni equivalenti per la centrifuga in uso.</td></tr><tr><td>4L Erlenmeyer Pallone</td><td>Kimble Chase</td><td>26500-4000</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td>Centrifuga Avanti J-26XP</td><td>Beckman-Coulter</td><td>393127</td><td>O equivalente centrifuga compatibile con 1L.</td></tr><tr><td>Agitatore orbitale Forma 480</td><td>Thermo Scientific</td><td>480</td><td>O equivalente a uno shaker 6x4L delle dimensioni del torace.</td></tr><tr><td>JLA-8.1000 Rotore</td><td>Beckman-Coulter</td><td>363688</td><td>O 1L-capace, 5000 x g rotore equivalente per centrifuga.</td></tr><tr><td>Mini-Beadbeater-1</td><td>BioSpec</td><td>3110BX</td><td>&nbsp;</td></tr><tr><td colspan="4">Materiale supplementare 1. Ricette per Items. 
Cloramfenicolo, 34 mg/ml: Preparare 0,51 g di cloramfenicolo e aggiungere etanolo a 15 ml. Filtro sterilizzare (0,22 &mu; M), aliquotare in provette da 1 ml, conservare a -20 &deg; C per un uso successivo. 
2xYT+P+Cm piastra agar: Preparare 1,24 g 2xYT, 1,6 ml di soluzione bibasica di fosfato di potassio @ 1 M, 0,88 ml di soluzione monobasica di fosfato di potassio @ 1 M, 0,6 g di agar e acqua fino a 40 ml. Autoclave. Lasciare raffreddare a 50 gradi C e aggiungere 40 &mu; l Cm. Aliquotare 25 ml in una capsula di Petri 100x15 mm, e lasciare raffreddare per un'ora. 
2xYT+P terreni: Preparare 124 g 2xYT, 160 ml di soluzione bibasica di fosfato di potassio @1 M, 88 ml di soluzione monobasica di fosfato di potassio @ 1 M e acqua in 4 L. Aliquotare in 2x1,88 L e 0,24 L. Autoclave. 
Tris base, 2 M: Preparare 60,57 g di base Tris e acqua fino a 250 ml. Sterilizzare, conservare presso RT per un uso successivo. 
DTT, 1 M: Preparare 2,31 g DTT e acqua a 15 ml. Filtro sterilizzare (0,22 &mu; M), aliquotare in provette da 1 ml, conservare a -20 &deg; C per un uso successivo. 
S30A tampone: Preparare 10,88 g di Mg-glutammato e 24,39 g di K-glutammato, 50 ml di Tris a 2M, acido acetico (a pH 7,7) e acqua a 2 L. Autoclave, conservare a 4 &deg; C, aggiungere 4 ml di 1 M DTT prima dell'uso. 
S30B tampone: Preparare 10,88 g di Mg-glutammato e 24,39 g di K-glutammato, Tris a 2 M (a pH 8,2) e acqua a 2 L. Autoclave, conservare a 4 gradi; C, aggiungere 2 ml di DTT 1 M prima dell'uso. 
HEPES: Preparare 1,91 g di HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8) e acqua a 4 ml. 
tRNA: Preparare 30 mg di tRNA e acqua a 600 &mu;l. 
CoA: Preparare 30 mg di CoA (MW 767.53) e acqua a 600 &mu;l. 
NAD: Aggiungere 34,83 mg di NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8) e acqua a 300 &mu;l. (Aggiungere 27 &mu; l di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5-8). 
cAMP: Aggiungere 42,80 mg di cAMP (MW 329,22), Tris a 2 M (a pH 8) e acqua a 200 &mu;l. (Aggiungere 73 &mu; l di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 8). 
Acido folinico (33,9 mM): a 20 mg di sale di calcio solido di acido folinico (MW 511,5), aggiungere 1,15 ml di acqua. 
Spermidina: Preparare 23.55 &mu; l di spermidina (MW 145,25) e acqua a 150 &mu;l. Preparare a temperatura ambiente dopo averlo sciolto brevemente a 37 &deg;C. 
3-PGA: Aggiungere 1,03 g di 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (a pH 7,5) e acqua a 3,2 ml. (Aggiungere 1,73 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5). 
Nucleotide Mix: Aggiungere 145 mg di ATP sale dipotassico diidrato (MW 619,4), 133 mg di GTP sale disodico (MW 567,14), 79,4 mg di CTP sale disodico diidrato (MW 563,16), 82,6 mg di UTP sale trisodico diidrato (MW 586,12), KOH al 15% di diluizione (a pH 7,5) e acqua a 1,5 ml. (Aggiungere 353 &mu; l di KOH a diluizione del 15% per portare la soluzione a pH 7,5). 
Materiale supplementare 2. Saggio di Bradford.
<ol>
	<li>Rimuovi l'agente Bradford da 4 &deg; C e impostare a temperatura ambiente.</li>
	<li>Prepara 50 &mu; l BSA Standard a 1 mg/ml e a 0,1 mg/ml.</li>
	<li>Preparare 40 &mu; l Diluizione 20x dell'estratto dal passaggio 1.47.</li>
	<li>Aggiungi 800 &mu; l. acqua in 7 cuvette. </li>
	<li>Preparare cuvette standard per 0 mg/ml, 1 mg/ml (10 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 2 mg/ml (20 &mu; l 0,1 mg/ml BSA), 4 mg/ml (4 &mu; l 1 mg/ml BSA), 6 mg/ml (6 &mu; l 1 mg/ml BSA).</li>
	<li>Prepara cuvette sperimentali per 2 &mu; l di campione e 4 &mu; l di campione.</li>
	<li>Aggiungi 200 &mu; l di agente Bradford in ciascuna cuvetta e mescolare bene mediante pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min.</li>
	<li>Produrre una curva standard con diametro esterno di 595 nm utilizzando le cuvette dal passaggio 6.5. Scarta la curva standard se r2 < 0,95,</litio>
	<li> Determinare la concentrazione dell'estratto a OD 595nm utilizzando cuvette da tep 6.6.</li>
</ol>
Materiale supplementare 3. Foglio di calcolo per la calibrazione del tampone. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank"> Vedi TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx</a>. 
Materiale supplementare 4. Esecuzione dell'espressione senza celle spreadsheet. 
<a href="http://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Vedi TXTL _JoVE.xlsx</a>.</td></tr></tbody></table>

protocolli per l'implementazione di un escherichia coli sulla base tx-tl cellulare-free expression system per la biologia sintetica

Protocols for Implementing an Escherichia coli Based TX-TL Cell-Free Expression System for Synthetic Biology

Sistemi di espressione acellulari ideale può teoricamente emulare un ambiente cellulare in vivo in una piattaforma controllata in vitro. 1 Questo è utile per esprimere proteine ​​e circuiti genetici in modo controllato e per fornire un ambiente di prototipazione per biologia sintetica. 2,3 Per raggiungere il secondo obiettivo, i sistemi di espressione acellulari che conservano endogena Escherichia coli meccanismi di trascrizione-traduzione sono in grado di riflettere più accuratamente dinamiche cellulari in vivo rispetto a quelle a base di T7 RNA polimerasi trascrizione. Descriviamo la preparazione e l&#39;esecuzione di un efficiente E. endogeno basato coli trascrizione-traduzione (TX-TL) sistema di espressione senza cellula in grado di produrre quantità equivalenti di proteine ​​come sistemi basati T7 a una riduzione dei costi del 98% a sistemi commerciali simili. 4,5 La preparazione di tamponi e estratto cellulare grezzo sono descritto, così come l&#39;esecuzione di untre tubo di reazione TX-TL. L&#39;intero protocollo richiede cinque giorni di tempo per preparare e produce abbastanza materiale per un massimo di 3000 singole reazioni in una preparazione. Una volta preparato, ogni reazione prende meno di 8 ore dal setup per la raccolta e l&#39;analisi dei dati. Meccanismi di regolazione e trascrizione esogeno di E. coli, come repressori lac / Tet e T7 RNA polimerasi, potrà essere integrata. 6 immobili endogeni, come l&#39;mRNA e la velocità di degradazione del DNA, può anche essere adeguato. 7 Il sistema di libera espressione di cellule TX-TL è stata dimostrata per la grande montaggio scala circuito, esplorando fenomeni biologici, e l&#39;espressione di proteine ​​sotto le due promotori-T7 e endogeni. 6,8 modelli matematici di accompagnamento sono disponibili. 9,10 Il sistema risultante ha applicazioni uniche nella biologia sintetica come un ambiente di prototipazione, o &quot;TX- TL biomolecolare breadboard. &quot;

Abbiamo presentato un protocollo di cinque giorni per la preparazione di un Escherichia coli endogeno basato sistema di espressione acellulare TX-TL. Una cronologia esempio per la creazione dei reagenti - estratto di cellule greggio e tampone - può essere trovato in Figura 1. Una volta creati, questi possono essere conservati a -80 ° C per un massimo di un anno. Dopo i reagenti sono creati, setup sperimentale e l'esecuzione può essere fatto in meno di 8 ore. Inoltre, abbiamo ottimizzato le condizioni di espressione del sistema di espressione acellulare TX-TL. Altre aggiunte forniti dall'utente, come tamponi o soluzioni di DNA, devono essere calibrati per la tossicità anticipo. Ad esempio, diversi metodi di elaborazione dei risultati plasmidi di espressione differente dovuto contenuto di sale. Abbiamo anche testato l'effetto di tampone di eluizione Tris-Cl sull'efficienza reazione (Figura 5). Un esempio di calibrazione grezzo estratto cellulare, riferendosi passo 4,1-4,9, è mostratoin figura 4a. In generale, i nostri esperimenti mostrano che l'estratto cellulare grezzo è più sensibile ai livelli di Mg-glutammato, seguiti da livelli di K-glutammato. Per dimostrare il sistema di libera espressione di cellule, abbiamo costruito e testato un ciclo di feedback negativo in base a tet repressione. 26 (Figura 6). Nel sistema di espressione cell-free, la stessa corsa circuito con e senza ATC mostra un end-point cambiamento di espressione di 7 volte di deGFP giornalista dopo otto ore di espressione. Anche se questo esperimento non richiede induttori globali o repressori, se necessario, possono essere aggiunti in "Mix Preparazione Maestro". <img alt="Figura 1" fo:content-width="4.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig1.jpg"> Figura 1. Timeline di estratto di cellule greggio, soluzione di aminoacidi, e la preparazione soluzione energetica. Timelin A cinque giorni e per l'esecuzione tipica del protocollo è dato sopra, ottimizzato per incubazioni overnight e fasi di lavoro durante il giorno. <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig2.jpg"> Figura 2. Costi e analisi di espressione di competere estratti cellulari greggio. a) Ripartizione dei costi di manodopera e dei materiali del sistema di libera espressione di cellule TX-TL. Sulla base dei costi dei reagenti come di Dicembre 2012, e il costo del lavoro di $ 14 all'ora. B) Confronto dei costi di sistema libera espressione di cellule TX-TL vs altri sistemi commerciali. I costi sono ripartiti per ml, anche se i volumi di reazione possono variare per kit. C) Confronto tra TX-TL cell-free sistema di espressione del rendimento rispetto ad altri sistemi commerciali. Resa espressione proteica determinata dalle norme produttore./ 50762fig2large.jpg "target =" _blank "&gt; Clicca qui per ingrandire la figura. <img alt="Figura 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig3.jpg"> Figura 3. Caricamento e lavorazione di un tubo tallone-pestaggio. a) Dimostrazione della corretta viscosità della soluzione di cellule-tallone. Soluzione Cell-tallone avrà una viscosità dipende da molti fattori, tra cui quantità di tampone S30A aggiunto, la quantità di perline aggiunti, e il tempo trascorso sul ghiaccio. B) Caricamento di tubo tallone battendo prima breve centrifugazione tavolo. La centrifugazione rimuove le bolle accumulate durante il caricamento. C) Bolle emersione dopo tavolo centrifugazione. La dimensione delle bolle varia, possono essere spuntato o rimosso utilizzando un puntale d) completamente riempito tubo tallone battere prima di tappatura.. Un menisco si forma nel tallone battendo tube, e il tappo ha abbastanza per coprire e causare piccole quantità per riempire troppo. e) apparecchio filtrante correttamente caricato. Questi possono essere riutilizzati. F) Confronto correttamente vs tubo tallone battere correttamente elaborato. Il tubo sulla sinistra è un tubo ben-beat - è dotato di un piccolo e ben delineato strato superiore, e molto chiaro surnatante. Il tubo a destra è ottimale, in base al formato grande, secondo strato nebuloso e il surnatante nebuloso. Tubi che sono subottimale non dovrebbero essere sottoposti a ulteriori elaborazioni. <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig4.jpg"> Figura 4. Proprietà di preparati estratto grezzo. a) curva di taratura tipici per estratto cellulare grezzo. Estratto grezzo è calibrato per ulteriori Mg-glutammato, K-glutammato, e livelli DTT, in questo ordine. Viene mostrato endpoint fluorescence dopo 8 ore, così come velocità massima di produzione di proteine ​​sulla base di una media mobile a 12 minuti. Sulla base di queste trame, un intervallo accettabile di ulteriori Mg-glutammato è di 4 mm, K-glutammato è 60-80 mm, DTT è 0-3 mm. Si noti che ogni estratto grezzo deve essere calibrato in modo indipendente per queste tre variabili. B) Variazione dalle preparazioni estratto. È mostrato Endpoint fluorescenza di due estratti grezzi preparati in date diverse, le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50762/50762fig5.jpg"> Figura 5. Effetti della soluzione di DNA sull'efficienza espressione. a) Confronto tra due diversi depurazionemodalità di trattamento dei plasmidi. 1 nM di pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500 viene preparata utilizzando solo un kit QIAprep Spin Miniprep (metodo di purificazione 1) o post-elaborata con un kit di purificazione QIAquick PCR (metodo di purificazione 2). Puo 'endpoint fluorescenza dopo 8 ore, così come velocità massima di produzione di proteine ​​sulla base di una media mobile a 12 minuti. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da quattro piste indipendenti in giorni diversi. B) Effetto del tampone di eluizione (Tris-Cl). Diverse concentrazioni di Tris-Cl sono confrontati in una reazione espressione cell-free base all'espressione di 1 nM di pBEST-OR2-OR1-Pr-UTR1-deGFP-T500. Le concentrazioni indicate sono concentrazioni finali di Tris-Cl nella reazione; tampone di eluizione utilizzato è 10 mM Tris-Cl. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . Figura 6. Esempio di run TX-TL di un ciclo di feedback negativo. a) la configurazione di esempio di una reazione esecuzione cell-free. Prove "a" "off" stato del ciclo di feedback negativo rispetto, con controlli positivi e negativi. B) plasmide mappa di feedback negativo. C) I risultati rappresentativi. Dati riflette esperimento in a) e b), con controllo negativo sottratto dal segnale. Circuito genetico mostrato in insert. Le barre di errore sono 1 deviazione standard da tre piste indipendenti in giorni diversi. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/50762fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per ingrandire la figura</a> . <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentrazione </td><td> Importo </td><td> Sterilizzazione </td><td> Note </td></tr><tr><td> Cloramfenicolo (Cm) </td><td> 34 mg / ml in etanolo </td><td> 1 ml </td><td> Filtro sterilizzare (0,22 micron) </td><td> Può essere fatto in grandi volumi conservati a -20 ° C per un uso successivo. </td></tr><tr><td> 2xYT + P + piastra Cm agar </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potassio fosfato bibasico, 22 mM fosfato di potassio monobasico, 34 mg / ml di cloramfenicolo </td><td> 1 piastra </td><td> Autoclave </td><td></td></tr><tr><td> 2xYT + P supporti </td><td> 31 g / L 2xYT, 40 mM potassio fosfato bibasico, 22 mM fosfato di potassio monobasico </td><td> 4 L </td><td> Autoclave </td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 1. Reagenti per giorno 1 del protocollo estratto cellulare grezzo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentrazione </td><td> Importo </td><td> Sterilizzazione </td><td> Note </td></tr><tr><td> Tris base </td><td> 2 M </td><td> 250 ml </td><td> Sterilizzare Filter (0,22 micron) o in autoclave </td><td> Può essere conservato a temperatura ambiente. </td></tr><tr><td> DTT </td><td> 1 M </td><td> 6 ml </td><td> Filtro sterilizzare (0,22 micron) </td><td> Può essere fatto in grandi volumi e conservati a -20 ° C per un uso successivo. </td></tr><tr><td> Tampone S30A </td><td> 14 mM Mg-glutammato, 60 mM K-glutammato, 50 mM Tris, pH 7.7 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Per raggiungere pH 7.7, titolare con acido acetico. Aggiungi DTT a 2 mm di concentramento finale appena prima dell'uso. Conservare a 4 ° C. </td></tr><tr><td> Tampone S30B </td><td> 14 mM Mg-glutammato, 60 mm K-glutammato, ~ Tris 5 mM, pH 8,2 </td><td> 2 L </td><td> Autoclave </td><td> Per raggiungere pH 8,2, titolare con 2MTris. Aggiungi DTT a 1 mM concentrazione finale appena prima dell'uso. Conservare a 4 ° C. </td></tr></tbody></table> Tabella 2. Reagenti per il giorno 2 del protocollo estratto cellulare grezzo. <table border="1"><tbody><tr><td></td><td colspan="4"> Falco </td></tr><tr><td></td><td> 1 </td><td> 2 </td><td> 3 </td><td> 4 </td></tr><tr><td> Vuoto 50 ml Falcon (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> 50 ml Falcon con pellet (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Massa Pellet (50 ml Falcon con pellet - vuoto 50 ml Falcon) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> S30A volume di tampone di aggiungere (massa pellet * 0,9) (ml) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Massa totale di perline per aggiungere (massa pellet * 5.0) (g) </td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table> Tabella 3. Tampone S30A e calcolatrice massa tallone, per il giorno 3 del protocollo estratto cellulare grezzo. <table border="1"><tbody><tr><td> Nome </td><td> Concentrazione </td><td> Importo </td><td> Sterilizzazione </td><td> Note </td></tr><tr><td> HEPES </td><td> 2 M, pH 8 </td><td> 4 ml </td><td> Nessuno </td><td> Per raggiungere pH 8, titolare con KOH. </td></tr><tr><td> Nucleotide Mix </td><td> , 94 mM CTP 156 mM ATP e GTP e UTP, pH 7.5 </td><td> 1,5 ml </td><td> Nessuno </td><td> Per raggiungere pH 7.5, titolare con KOH. </td></tr><tr><td> tRNA </td><td> 50 mg / ml </td><td> 600 microlitri </td><td> Nessuno </td><td></td></tr><tr><td> CoA </td><td> 65 mm </td><td> 600 microlitri </td><td> Nessuno </td><td></td></tr><tr><td> NAD </td><td> 175 mM, pH 7,5-8 </td><td> 300 ml </td><td> Nessuno </td><td> Per raggiungere pH 7.5-8, titolare con Tris a 2 M. </td></tr><tr><td> cAMP </td><td> 650 mM, pH 8 </td><td> 200 ml </td><td> Nessuno </td><td> Per raggiungere pH 8, titolare con Tris a 2 M. </td></tr><tr><td> Acido folinico </td><td> 33.9 mM </td><td> 300 ml </td><td> Nessuno </td><td> Anche se sono necessari solo 300 ml, ricetta supplementare è di 1.15 ml. </td></tr><tr><td> Spermidina </td><td> 1 M </td><td> 150 microlitri </td><td> Nessuno </td><td> Conservare a 4 ° C, calore a 37 ° C per fondere. </td></tr><tr><td> 3-PGA </td><td> 1.4 M, pH 7.5 </td><td> 3.2 ml </td><td> Nessuno </td><td> Per raggiungere pH 7.5, titolare con Tris a 2 M. </td></tr></tbody></table> Tabella 4. Reagenti per prepararsi per il protocollo Energy Solution. Supplemental Materiale 1. Ricette per Articoli. Cloramfenicolo, 34 mg / ml: Preparare 0,51 g cloramfenicolo e aggiungere etanolo a 15 ml. Sterilizzare Filter (0,22 micron), aliquota da 1 ml tubi, conservare a -20 ° C per un uso successivo. 2xYT + P + piastra Cm agar: Preparare 1,24 g 2xYT, 1,6 ml di soluzione di potassio fosfato bibasico @ 1 M, 0,88 ml di potassio fosfato monobasico @ 1 M, 0,6 g di agar, e l'acqua a 40 ml. Autoclave. Lasciate raffreddare a 50 ° C e aggiungere 40 microlitri Cm. Aliquota 25 ml in una piastra di Petri di 100 x 15 mm, e lasciate raffreddare per un'ora. 2xYT + P supporti: Preparare 124 g 2xYT, 160 ml di fosfato di potassio dibasico @ 1 M, soluzione di 88 ml di potassio fosfato monobasico @ 1 M, e acqua per 4 L. Aliquot fuori in 2 x 1,88 L e 0,24 L. Autoclave. Tris base, 2 M: Preparare 60,57 g di base Tris e acqua a 250 ml. Sterilizzare, conservare a temperatura ambiente per un uso successivo. DTT, 1 M: Preparare 2.31 ​​g DTT e acqua a 15 ml. Sterilizzare Filter (0,22 micron), aliquota da 1 ml tubi, conservare a -20 ° C per un uso successivo. Tampone S30A: Preparare 10.88 g Mg-glutammato e 24,39 g K-glutammato, 50 ml Tris a 2M, acido acetico (a pH 7,7), e acqua per 2 L. Autoclave, conservare a 4 ° C, aggiungere 4 ml di 1 M DTT prima dell'uso. Tampone S30B: Preparare 10.88 g Mg-glutammato e 24,39 g K-glutammato, Tris a 2 M (pH 8.2), e acqua per 2 L. Autoclave, conservare a 4 ° C, aggiungere 2 ml di 1 M DTT prima dell'uso. HEPES: Preparare 1.91 g HEPES (MW 238,21), KOH (a pH 8), e acqua a 4 ml. tRNA: Preparare 30 mg di tRNA e acqua a 600 ml. CoA: Preparare 30 mg di CoA (MW 767,53) e l'acqua a 600 ml. NAD: Aggiungere 34.83 mg di NAD (MW 663,43), Tris a 2 M (a pH 7,5-8), e acqua a 300 ml. (Aggiungere 27 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5-8). cAMP: Aggiungere 42.80 mg di cAMP (MW 329,22), Tris a 2 M (a pH 8), e acqua di 200 microlitri. (Aggiungere 73 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 8). Acido folinico (33,9 mm): A 20 mg di solido sale di calcio di acido folico (511,5 MW), aggiungere 1,15 ml di acqua. Spermidina: Preparare 23.55 ml di spermidina (MW 145,25) e acqua a 150 ml. Preparare a temperatura ambiente dopo la fusione brevemente a 37 ° C. 3-PGA: Aggiungere 1,03 g di 3-PGA (MW 230,02), Tris a 2 M (pH 7,5), e acqua a 3,2 ml. (Aggiungere 1,73 ml di Tris a 2 M per portare la soluzione a pH 7,5). Nucleotide Mix: Aggiungere 145 mg di ATP dipotassio diidrato sale (619,4 MW), 133 mg di GTP sale disodico (MW 567,14), 79,4 mg di CTP diidrato sale disodico (MW 563,16), 82,6 mg di diidrato UTP sale trisodico (MW 586,12) , KOH al 15% di diluizione (a pH 7,5), e acqua a 1,5 ml. (Aggiungere 353 ml di KOH al 15% diluizione per portare la soluzione a pH 7,5). Supplemental materiale 2. Bradford Assay. <ol><li> Rimuovere agente Bradford da 4 ° C e impostare a temperatura ambiente. </li><li> Preparare 50 ml BSA standard a 1 mg / ml ed a 0.1 mg / ml. </li><li> Preparare 40 ml 20x diluizione dell'estratto dal punto 1.47. </li><li> Aggiungere 800 microlitri di acqua a 7 cuvette. </li><li> Preparare cuvette standard per la 0 mg / ml, 1 mg / ml (10 ml 0,1 mg / ml BSA), 2 mg / ml (20 ml 0,1 mg / ml BSA), 4 mg / ml (4 microlitri 1 mg / ml BSA) , 6 mg / ml (6 ml 1 mg / ml BSA). </li><li> Preparare cuvette sperimentali per 2 ml di campione e 4 ml di campione. </li><li> Aggiungere 200 ml di agente Bradford ad ogni provetta e mescolare bene by pipettaggio. Incubare a temperatura ambiente per almeno 10 min. </li><li> Produrre curva standard a OD 595 nm utilizzando cuvette dal punto 6.5. Rifiuta curva standard se r 2 &lt;0,95. </li><li> Determinare la concentrazione di estratto di OD a 595 nm utilizzando cuvette dal punto 6.6. </li></ol> Materiale supplementare 3. Buffer foglio di calibrazione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_e(template)_calibration_JoVE.xlsx" target="_blank">Vedere TXTL_e (template) _calibration_JoVE.xlsx</a> . Materiale supplementare 4. Libera espressione-Cell eseguito foglio di calcolo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50762/TXTL_JoVE.xlsx" target="_blank">Vedere TXTL _JoVE.xlsx</a> .

Questo protocollo di cinque giorni delinea tutte le fasi, attrezzature e software supplementare necessario per la creazione e l&#39;esecuzione di un sistema di espressione TX-TL cell-free da zero efficiente Escherichia coli endogeno basato. Con i reagenti, il protocollo dura 8 ore o meno per impostare una reazione, raccogliere e elaborare i dati.

Protocolli per l'implementazione di un Escherichia coli Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

Ideal cell-free expression systems can theoretically emulate an in vivo cellular environment in a controlled in vitro platform.1 This is useful for ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un sistema di espressione libera da cellule basato su e coli denominato traduzione della trascrizione o TX tl. Ciò si ottiene creando prima tre componenti iniziali per l'estratto di cellule grezze TX TL, la soluzione di amminoacidi e la soluzione energetica. La soluzione di amminoacidi e la soluzione energetica saranno successivamente combinate per formare il tampone TX TL.Il secondo passo consiste nel calibrare l'estratto cellulare grezzo per determinare le concentrazioni ottimali di magnesio, potassio e DTT per produrre reazioni TX TL con i massimi livelli di espressione. Successivamente, i risultati della calibrazione vengono utilizzati per realizzare un sistema TX TL a tre tubi costituito da estratto di cellule grezze tampone e DNA. Il passaggio finale consiste nell'eseguire una reazione TX TL utilizzando i reagenti appena realizzati.In definitiva, TX TL viene utilizzato per dimostrare circuiti di biologia sintetica e applicazioni tradizionali di espressione senza cellule. Questo metodo può aiutare a testare i circuiti nel campo della biologia sintetica fornendo un ambiente equo in vitro, che emula quello in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'aumento della velocità della progettazione biologica sintetica, eliminando la necessità di condurre tutte le fasi di prototipazione in vivo.Ad assistere a una procedura sarà Claire Hayes, un'assistente di ricerca del nostro gruppo. Si prega di notare che questo video passerà solo attraverso sezioni selezionate del protocollo critico per le riprese. Il protocollo completo è disponibile con l'articolo di testo.All'inizio di questo protocollo, le cellule batteriche sono state coltivate e pellettate. Ora le cellule batteriche verranno lisate utilizzando un battitore di perline. Tenere in ghiaccio tutte le provette Falcon da 50 millilitri contenenti sospensione cellulare.Ai fini di questo video, la perlina sarà dimostrata per un solo tubo. Le perline devono essere aggiunte in modo intermittente al tubo Falcon in tre aliquote ciascuna utilizzando un terzo delle perline totali. Aggiungere la prima aliquota di perline al vortice del tubo per 30 secondi e mettere sul ghiaccio.Allo stesso modo, aggiungere la seconda aliquota di perline, vorticare e mettere sul ghiaccio. Dopo aver aggiunto l'ultima aliquota e aver fatto in modo che le perle siano distribuite uniformemente, dopo la terza fase di vortice dovrebbe formarsi una pasta densa. Metti il tubo sul ghiaccio.Preparare un puntale per pipetta da cinque millilitri utilizzando un paio di forbici sterili per tagliare l'estremità. Per creare un'apertura di tre o quattro millimetri, regolare la pipetta a due millilitri. Mettere 20 tubi sterili per perline sul ghiaccio.Utilizzare la pipetta modificata per verificare l'elevata viscosità della soluzione di bead cell. Deve essere viscoso al punto da uscire a malapena dal puntale della pipetta. Durante l'espulsione, rimuovere la soluzione di perline dal tubo Falcon e trasferirla in un tubo di perline.Riempiendolo per tre quarti di centrifuga completa in modo estremamente breve in una mini centrifuga. Per rimuovere le bolle d'aria senza ridistribuire le perline, finire di aggiungere la soluzione di perline al tubo per formare un menisco concavo. Quindi, aggiungere una piccolissima goccia di soluzione di perline all'interno di un tappo del tubo per perline.Facendo attenzione a non mettere la soluzione nel bordo esterno del tappo. In caso contrario, il tubo di perline non si chiuderà a sufficienza. Picchiettare il tappo su una superficie piana e verificare che non ci siano bolle d'aria sul fondo del tappo.Tappare il tubo battitore di perline. Se fatto correttamente, il tappo deve essere ben sigillato. Da qui in poi non dovrebbero essere visibili bolle d'aria e da qui in poi dovrebbe traboccare poca o nessuna soluzione di perline, sono necessarie due persone per eseguire la perlatura in modo efficiente.Consegnare il tubo riempito a un assistente per la perlatura delle perline, mentre il primo dimostratore continua a riempire altre provette con la soluzione di perline rimanente. Prendi il tubo di perline pieno e mettilo sul ghiaccio. Una volta riempiti, due tubi per perline sono stati raccolti e sono stati messi in ghiaccio per almeno un minuto.Iniziare a bordare un tubo per 30 secondi a 46 giri/min. Mettere a testa in giù sul ghiaccio per 30 secondi mentre si sbatte l'altro tubo. Ripetere la perlina e la glassa in modo tale che ogni tubo di perline pieno venga battuto per un totale di un minuto.Una volta che tutti i tubi di perline riempiti sono stati lavorati, costruire un apparato filtrante da un tubo di falco da 15 millilitri. Per prima cosa, aggiungere un nuovo tappo per perline con la parte piatta rivolta verso l'alto fino al fondo del tubo. Quindi rimuovere il tappo da un tubo di perline lavorato e premere saldamente una colonna per microcromatografia sull'estremità del tubo di perline lavorato fino a quando non è completamente sigillato.Staccare l'estremità eluciana della colonna per microcromatografia e posizionarla in luciano. Terminare in un tubo di perline vuoto. Metti questo complesso nel tubo di falco da 15 millilitri.Costruire gli apparecchi di filtraggio per tutti i tubi di battitura delle perle pieni e tenerli sul ghiaccio. Una volta completata la centrifuga, il filtro apparecchiature Falcon tubo aperto a 6, 000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per separare l'estratto e il pellet dalle perle. Dopo la centrifugazione, verificare che ogni provetta per perline abbia prodotto un estratto vitale.L'estratto correttamente battuto non sarà torbido e il pellet avrà due strati distinti come illustrato dal tubo a sinistra. I tubi torbidi, come mostrato nell'esempio a destra, devono essere eliminati. Trasferire il surnatante dalle provette non turidi in singole provette da microcentrifuga da 1,75 millilitri, prelevando il minor pellet possibile.Tenere in ghiaccio fino a quando tutti i tubi di perline sono stati lavorati. Quindi, centrifugare le provette della microcentrifuga e raccogliere il surnatante. Dopo aver consolidato 500 microlitri di surnatante senza pellet in un nuovo tubo per perline.Incubare le provette con i tappi rimossi a 220 giri/min e 37 gradi Celsius per 80 minuti. Questo digerisce gli acidi nucleici rimanenti utilizzando l'esonucleasi endogena rilasciata durante il processo di beading. Al termine dell'incubazione, l'estratto dovrebbe apparire torbido.Consolidare l'estratto in provette da microcentrifuga da 1,75 millilitri fino a 1,5 millilitri per centrifuga a provette a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta, consolidare il surnatante senza pellet in una provetta per microcentrifuga da 1,75 millilitri per rese inferiori o in una provetta con falco da 15 millilitri per rese maggiori su ghiaccio. Tappare il tubo e mescolare bene invertendolo.Conservare 10 microlitri di surnatante sul ghiaccio per la successiva misurazione della concentrazione proteica. Determinare la quantità totale di estratto prodotto e idratare il numero necessario di cassette per dialisi con cut-off di 10 pesi molecolari immergendole nel tampone S 30 B per due minuti. Caricare cassette con un massimo di 2,5 millilitri di estratto.Ogni becher può contenere fino a due cassette, dializzare, mescolando a quattro gradi Celsius per tre ore. Fare riferimento all'articolo scritto per le fasi di elaborazione dopo la dialisi. Una reazione di traduzione della trascrizione di base ha tre parti, estratto di cellule grezze, tampone e DNA.Sebbene le reazioni possano variare di volume, questo protocollo utilizza un modello pre-scritto per condurre una reazione da 10 microlitri. Qui. Gli elementi in viola indicano i valori di input dell'utente e gli elementi in blu indicano ulteriori reagenti da aggiungere al progetto di reazione dell'esperimento in sili utilizzando la sezione di preparazione della miscela master e la sezione di preparazione del DNA. Generalmente le costanti possono essere inserite nella sezione di preparazione della miscela principale, mentre le variabili possono essere inserite nella sezione di preparazione del DNA.Ridurre al minimo i campioni per esperimento per evitare l'evaporazione dei campioni e la distorsione dell'orario di inizio dell'esperimento. In questa tabella viene illustrata una configurazione di esempio. Per preparare i campioni di DNA per ogni campione, l'aliquota identificativa dell'acqua di DNA indicata e degli articoli forniti dall'utente in una provetta da microcentrifuga.A temperatura ambiente, preparare la miscela master composta da estratto tampone e qualsiasi elemento fornito dall'utente globale mantenendo il ghiaccio e il vortice. Dopo l'aggiunta di ciascun elemento, aggiungere la quantità appropriata di master mix a ciascun campione di DNA e conservare a temperatura ambiente. Considera questo come l'ora di inizio della reazione.Agitare ogni campione e centrifugare a 10.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente per ridurre eventuali residui di campione e ridurre le bolle. Eseguire la reazione in una piastra a 384 pozzetti a 29 gradi Celsius. I tempi di esecuzione variano a seconda dell'esperimento, ma in genere durano meno di otto ore.Al termine della corsa, i dati possono essere letti da un lettore di piastre. Questo articolo presenta un protocollo di cinque giorni per la preparazione di un sistema di trascrizione endogeno basato su e coli o TXTL cell-free. Le condizioni di espressione di questo sistema sono state ottimizzate attraverso test sugli effetti di diversi metodi di processamento plasmidico e del tampone eluciano.Alcune variabili introdotte nel sistema TXTL devono essere calibrate in anticipo per la tossicità, ad esempio, nel confronto dei metodi di elaborazione dei plasmidi nel metodo di purificazione si utilizza solo un kit di preparazione mini spin kaya prep mentre nel metodo di purificazione due, il plasmide viene preparato utilizzando lo stesso kit di preparazione mini e quindi post-processo con un kayak. Kit di purificazione rapida PCR. Questo grafico mostra la fluorescenza del punto finale dopo otto ore e il tasso massimo di produzione di proteine basato su un movimento di 12 minuti. Le barre di errore medie sono una deviazione standard da quattro esecuzioni indipendenti in giorni diversi.La differenza di espressione osservata è dovuta alla differenza nel contenuto di sale. Tuttavia, altri elementi potrebbero non mostrare alcun effetto sul TXTL come il buffer elucian. Diverse concentrazioni di cloruro TS sono state confrontate in una reazione di espressione libera da cellule basata sull'espressione di un anomolare di plasmide.Le concentrazioni indicate sono le concentrazioni finali di tris cloruro. Nella reazione il tampone eluciano utilizzato è di 10 millimolari di tris cloruro, le barre di errore sono una deviazione standard da tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi. Questa figura mostra i tipici grafici di calibrazione per l'estratto di cellule grezze, calibrati per ulteriori livelli di glutammato di magnesio, glutammato di potassio e DTT.Vengono mostrati la fluorescenza finale dopo otto ore e il tasso massimo di produzione di proteine basato su una media mobile di 12 minuti. Si noti che ogni estratto di cella grezza deve essere calibrato in modo indipendente per queste tre variabili. In generale, i risultati indicano che l'estratto cellulare grezzo è più sensibile ai livelli di glutammato di magnesio, seguiti dai livelli di glutammato di potassio.Sulla base di questi grafici, un intervallo accettabile di glutammato di magnesio aggiuntivo è di quattro millimolari, il glutammato di potassio è compreso tra 60 e 80 millimolari e il DTT è compreso tra zero e tre millimolari di aerazione sul lato inferiore. L'efficienza finale di ogni preparazione di estratto di cella grezza può variare in base alla competenza dell'utente e alle condizioni ambientali. Sebbene la variazione tipica della resa sia compresa tra il 5 e il 10%, qui viene mostrata la fluorescenza di due estratti grezzi preparati in date diverse.Le barre di errore sono una deviazione standard di tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi. Per dimostrare il sistema di espressione cell-free, è stato costruito un ciclo di feedback negativo basato sulla repressione del Tet e testato lo stesso circuito eseguito con e senza un TC ha mostrato un'espressione finale settupla. Cambio del reporter D-E-G-F-P dopo otto ore di espressione, le barre di errore sono una deviazione standard da tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi.Il circuito genetico è mostrato nel riquadro. Questa cifra finale illustra il costo e l'analisi dell'espressione degli estratti di cellule grezze concorrenti. Il grafico a torta in a suddivide i costi della manodopera e dei materiali del sistema di espressione senza cellule TX TL in base ai costi dei reagenti a dicembre 2012 e ai costi di manodopera di 14 all'ora.Il pannello B confronta i costi del sistema di espressione libera da cellule TX rispetto ad altri sistemi commerciali. I costi sono suddivisi per microlitro, anche se i volumi di reazione possono variare a seconda del kit. I costi del materiale per questo sistema sono di circa 3 centesimi per reazione in microlitro, che rappresenta una riduzione dei costi del 98% rispetto ai sistemi commerciali comparabili senza celle.Il pannello C mostra un confronto tra la resa del sistema di espressione libera da cellule TX TL rispetto ad altri sistemi commerciali. Questo sistema è in grado di produrre fino a 0,75 milligrammi per millilitro di proteina reporter utilizzando un promotore basato su Sigma 70 con operatori fagici Lambda o un promotore guidato da T sette. Questi confronti indicano che il sistema di espressione libera da cellule TX TL può produrre quantità equivalenti di proteine poiché i sistemi basati su T sette aggiungono un'enorme riduzione dei costi a sistemi commerciali simili.Speriamo che questa tecnica apra la strada alla semplificazione del processo ingegneristico nella biologia sintetica.

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