Protocolli per l'implementazione di un Escherichia coli Sulla base TX-TL cellulare-Free Expression System per la biologia sintetica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un sistema di espressione libera da cellule basato su e coli denominato traduzione della trascrizione o TX tl. Ciò si ottiene creando prima tre componenti iniziali per l'estratto di cellule grezze TX TL, la soluzione di amminoacidi e la soluzione energetica. La soluzione di amminoacidi e la soluzione energetica saranno successivamente combinate per formare il tampone TX TL.

Il secondo passo consiste nel calibrare l'estratto cellulare grezzo per determinare le concentrazioni ottimali di magnesio, potassio e DTT per produrre reazioni TX TL con i massimi livelli di espressione. Successivamente, i risultati della calibrazione vengono utilizzati per realizzare un sistema TX TL a tre tubi costituito da estratto di cellule grezze tampone e DNA. Il passaggio finale consiste nell'eseguire una reazione TX TL utilizzando i reagenti appena realizzati.

In definitiva, TX TL viene utilizzato per dimostrare circuiti di biologia sintetica e applicazioni tradizionali di espressione senza cellule. Questo metodo può aiutare a testare i circuiti nel campo della biologia sintetica fornendo un ambiente equo in vitro, che emula quello in vivo. Le implicazioni di questa tecnica si estendono all'aumento della velocità della progettazione biologica sintetica, eliminando la necessità di condurre tutte le fasi di prototipazione in vivo.

Ad assistere a una procedura sarà Claire Hayes, un'assistente di ricerca del nostro gruppo. Si prega di notare che questo video passerà solo attraverso sezioni selezionate del protocollo critico per le riprese. Il protocollo completo è disponibile con l'articolo di testo.

All'inizio di questo protocollo, le cellule batteriche sono state coltivate e pellettate. Ora le cellule batteriche verranno lisate utilizzando un battitore di perline. Tenere in ghiaccio tutte le provette Falcon da 50 millilitri contenenti sospensione cellulare.

Ai fini di questo video, la perlina sarà dimostrata per un solo tubo. Le perline devono essere aggiunte in modo intermittente al tubo Falcon in tre aliquote ciascuna utilizzando un terzo delle perline totali. Aggiungere la prima aliquota di perline al vortice del tubo per 30 secondi e mettere sul ghiaccio.

Allo stesso modo, aggiungere la seconda aliquota di perline, vorticare e mettere sul ghiaccio. Dopo aver aggiunto l'ultima aliquota e aver fatto in modo che le perle siano distribuite uniformemente, dopo la terza fase di vortice dovrebbe formarsi una pasta densa. Metti il tubo sul ghiaccio.

Preparare un puntale per pipetta da cinque millilitri utilizzando un paio di forbici sterili per tagliare l'estremità. Per creare un'apertura di tre o quattro millimetri, regolare la pipetta a due millilitri. Mettere 20 tubi sterili per perline sul ghiaccio.

Utilizzare la pipetta modificata per verificare l'elevata viscosità della soluzione di bead cell. Deve essere viscoso al punto da uscire a malapena dal puntale della pipetta. Durante l'espulsione, rimuovere la soluzione di perline dal tubo Falcon e trasferirla in un tubo di perline.

Riempiendolo per tre quarti di centrifuga completa in modo estremamente breve in una mini centrifuga. Per rimuovere le bolle d'aria senza ridistribuire le perline, finire di aggiungere la soluzione di perline al tubo per formare un menisco concavo. Quindi, aggiungere una piccolissima goccia di soluzione di perline all'interno di un tappo del tubo per perline.

Facendo attenzione a non mettere la soluzione nel bordo esterno del tappo. In caso contrario, il tubo di perline non si chiuderà a sufficienza. Picchiettare il tappo su una superficie piana e verificare che non ci siano bolle d'aria sul fondo del tappo.

Tappare il tubo battitore di perline. Se fatto correttamente, il tappo deve essere ben sigillato. Da qui in poi non dovrebbero essere visibili bolle d'aria e da qui in poi dovrebbe traboccare poca o nessuna soluzione di perline, sono necessarie due persone per eseguire la perlatura in modo efficiente.

Consegnare il tubo riempito a un assistente per la perlatura delle perline, mentre il primo dimostratore continua a riempire altre provette con la soluzione di perline rimanente. Prendi il tubo di perline pieno e mettilo sul ghiaccio. Una volta riempiti, due tubi per perline sono stati raccolti e sono stati messi in ghiaccio per almeno un minuto.

Iniziare a bordare un tubo per 30 secondi a 46 giri/min. Mettere a testa in giù sul ghiaccio per 30 secondi mentre si sbatte l'altro tubo. Ripetere la perlina e la glassa in modo tale che ogni tubo di perline pieno venga battuto per un totale di un minuto.

Una volta che tutti i tubi di perline riempiti sono stati lavorati, costruire un apparato filtrante da un tubo di falco da 15 millilitri. Per prima cosa, aggiungere un nuovo tappo per perline con la parte piatta rivolta verso l'alto fino al fondo del tubo. Quindi rimuovere il tappo da un tubo di perline lavorato e premere saldamente una colonna per microcromatografia sull'estremità del tubo di perline lavorato fino a quando non è completamente sigillato.

Staccare l'estremità eluciana della colonna per microcromatografia e posizionarla in luciano. Terminare in un tubo di perline vuoto. Metti questo complesso nel tubo di falco da 15 millilitri.

Costruire gli apparecchi di filtraggio per tutti i tubi di battitura delle perle pieni e tenerli sul ghiaccio. Una volta completata la centrifuga, il filtro apparecchiature Falcon tubo aperto a 6, 000 G per cinque minuti a quattro gradi Celsius per separare l'estratto e il pellet dalle perle. Dopo la centrifugazione, verificare che ogni provetta per perline abbia prodotto un estratto vitale.

L'estratto correttamente battuto non sarà torbido e il pellet avrà due strati distinti come illustrato dal tubo a sinistra. I tubi torbidi, come mostrato nell'esempio a destra, devono essere eliminati. Trasferire il surnatante dalle provette non turidi in singole provette da microcentrifuga da 1,75 millilitri, prelevando il minor pellet possibile.

Tenere in ghiaccio fino a quando tutti i tubi di perline sono stati lavorati. Quindi, centrifugare le provette della microcentrifuga e raccogliere il surnatante. Dopo aver consolidato 500 microlitri di surnatante senza pellet in un nuovo tubo per perline.

Incubare le provette con i tappi rimossi a 220 giri/min e 37 gradi Celsius per 80 minuti. Questo digerisce gli acidi nucleici rimanenti utilizzando l'esonucleasi endogena rilasciata durante il processo di beading. Al termine dell'incubazione, l'estratto dovrebbe apparire torbido.

Consolidare l'estratto in provette da microcentrifuga da 1,75 millilitri fino a 1,5 millilitri per centrifuga a provette a 12.000 G per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Utilizzando una pipetta, consolidare il surnatante senza pellet in una provetta per microcentrifuga da 1,75 millilitri per rese inferiori o in una provetta con falco da 15 millilitri per rese maggiori su ghiaccio. Tappare il tubo e mescolare bene invertendolo.

Conservare 10 microlitri di surnatante sul ghiaccio per la successiva misurazione della concentrazione proteica. Determinare la quantità totale di estratto prodotto e idratare il numero necessario di cassette per dialisi con cut-off di 10 pesi molecolari immergendole nel tampone S 30 B per due minuti. Caricare cassette con un massimo di 2,5 millilitri di estratto.

Ogni becher può contenere fino a due cassette, dializzare, mescolando a quattro gradi Celsius per tre ore. Fare riferimento all'articolo scritto per le fasi di elaborazione dopo la dialisi. Una reazione di traduzione della trascrizione di base ha tre parti, estratto di cellule grezze, tampone e DNA.

Sebbene le reazioni possano variare di volume, questo protocollo utilizza un modello pre-scritto per condurre una reazione da 10 microlitri. Qui. Gli elementi in viola indicano i valori di input dell'utente e gli elementi in blu indicano ulteriori reagenti da aggiungere al progetto di reazione dell'esperimento in sili utilizzando la sezione di preparazione della miscela master e la sezione di preparazione del DNA. Generalmente le costanti possono essere inserite nella sezione di preparazione della miscela principale, mentre le variabili possono essere inserite nella sezione di preparazione del DNA.

Ridurre al minimo i campioni per esperimento per evitare l'evaporazione dei campioni e la distorsione dell'orario di inizio dell'esperimento. In questa tabella viene illustrata una configurazione di esempio. Per preparare i campioni di DNA per ogni campione, l'aliquota identificativa dell'acqua di DNA indicata e degli articoli forniti dall'utente in una provetta da microcentrifuga.

A temperatura ambiente, preparare la miscela master composta da estratto tampone e qualsiasi elemento fornito dall'utente globale mantenendo il ghiaccio e il vortice. Dopo l'aggiunta di ciascun elemento, aggiungere la quantità appropriata di master mix a ciascun campione di DNA e conservare a temperatura ambiente. Considera questo come l'ora di inizio della reazione.

Agitare ogni campione e centrifugare a 10.000 G per 30 secondi a temperatura ambiente per ridurre eventuali residui di campione e ridurre le bolle. Eseguire la reazione in una piastra a 384 pozzetti a 29 gradi Celsius. I tempi di esecuzione variano a seconda dell'esperimento, ma in genere durano meno di otto ore.

Al termine della corsa, i dati possono essere letti da un lettore di piastre. Questo articolo presenta un protocollo di cinque giorni per la preparazione di un sistema di trascrizione endogeno basato su e coli o TXTL cell-free. Le condizioni di espressione di questo sistema sono state ottimizzate attraverso test sugli effetti di diversi metodi di processamento plasmidico e del tampone eluciano.

Alcune variabili introdotte nel sistema TXTL devono essere calibrate in anticipo per la tossicità, ad esempio, nel confronto dei metodi di elaborazione dei plasmidi nel metodo di purificazione si utilizza solo un kit di preparazione mini spin kaya prep mentre nel metodo di purificazione due, il plasmide viene preparato utilizzando lo stesso kit di preparazione mini e quindi post-processo con un kayak. Kit di purificazione rapida PCR. Questo grafico mostra la fluorescenza del punto finale dopo otto ore e il tasso massimo di produzione di proteine basato su un movimento di 12 minuti. Le barre di errore medie sono una deviazione standard da quattro esecuzioni indipendenti in giorni diversi.

La differenza di espressione osservata è dovuta alla differenza nel contenuto di sale. Tuttavia, altri elementi potrebbero non mostrare alcun effetto sul TXTL come il buffer elucian. Diverse concentrazioni di cloruro TS sono state confrontate in una reazione di espressione libera da cellule basata sull'espressione di un anomolare di plasmide.

Le concentrazioni indicate sono le concentrazioni finali di tris cloruro. Nella reazione il tampone eluciano utilizzato è di 10 millimolari di tris cloruro, le barre di errore sono una deviazione standard da tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi. Questa figura mostra i tipici grafici di calibrazione per l'estratto di cellule grezze, calibrati per ulteriori livelli di glutammato di magnesio, glutammato di potassio e DTT.

Vengono mostrati la fluorescenza finale dopo otto ore e il tasso massimo di produzione di proteine basato su una media mobile di 12 minuti. Si noti che ogni estratto di cella grezza deve essere calibrato in modo indipendente per queste tre variabili. In generale, i risultati indicano che l'estratto cellulare grezzo è più sensibile ai livelli di glutammato di magnesio, seguiti dai livelli di glutammato di potassio.

Sulla base di questi grafici, un intervallo accettabile di glutammato di magnesio aggiuntivo è di quattro millimolari, il glutammato di potassio è compreso tra 60 e 80 millimolari e il DTT è compreso tra zero e tre millimolari di aerazione sul lato inferiore. L'efficienza finale di ogni preparazione di estratto di cella grezza può variare in base alla competenza dell'utente e alle condizioni ambientali. Sebbene la variazione tipica della resa sia compresa tra il 5 e il 10%, qui viene mostrata la fluorescenza di due estratti grezzi preparati in date diverse.

Le barre di errore sono una deviazione standard di tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi. Per dimostrare il sistema di espressione cell-free, è stato costruito un ciclo di feedback negativo basato sulla repressione del Tet e testato lo stesso circuito eseguito con e senza un TC ha mostrato un'espressione finale settupla. Cambio del reporter D-E-G-F-P dopo otto ore di espressione, le barre di errore sono una deviazione standard da tre esecuzioni indipendenti in giorni diversi.

Il circuito genetico è mostrato nel riquadro. Questa cifra finale illustra il costo e l'analisi dell'espressione degli estratti di cellule grezze concorrenti. Il grafico a torta in a suddivide i costi della manodopera e dei materiali del sistema di espressione senza cellule TX TL in base ai costi dei reagenti a dicembre 2012 e ai costi di manodopera di 14 all'ora.

Il pannello B confronta i costi del sistema di espressione libera da cellule TX rispetto ad altri sistemi commerciali. I costi sono suddivisi per microlitro, anche se i volumi di reazione possono variare a seconda del kit. I costi del materiale per questo sistema sono di circa 3 centesimi per reazione in microlitro, che rappresenta una riduzione dei costi del 98% rispetto ai sistemi commerciali comparabili senza celle.

Il pannello C mostra un confronto tra la resa del sistema di espressione libera da cellule TX TL rispetto ad altri sistemi commerciali. Questo sistema è in grado di produrre fino a 0,75 milligrammi per millilitro di proteina reporter utilizzando un promotore basato su Sigma 70 con operatori fagici Lambda o un promotore guidato da T sette. Questi confronti indicano che il sistema di espressione libera da cellule TX TL può produrre quantità equivalenti di proteine poiché i sistemi basati su T sette aggiungono un'enorme riduzione dei costi a sistemi commerciali simili.

Speriamo che questa tecnica apra la strada alla semplificazione del processo ingegneristico nella biologia sintetica.