Name: Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano allinfezione da virus respiratorio sinciziale umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 1 s
Description: Scopri come stimolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano con il virus respiratorio sinciziale per analizzare le vie infiammatorie attivate. Questo metodo consente di valutare la risposta immunitaria cellulare mediante tecniche avanzate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

RSV A2 è stato gentilmente fornito dal Dr. R. de Swart (Erasmus MC, Rotterdam, Paesi Bassi). MV e GF sono supportati dal consorzio Virgo, finanziato dal progetto numero FES0908 del governo olandese, e dal progetto numero 050-060-452 della Netherlands Genomics Initiative (NGI). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

Nota:
Gli esperimenti con HRSV devono essere eseguiti in una cappa a sicurezza biologica all'interno di un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2. Raccogliere tutti i rifiuti virali e i materiali entrati in contatto con il virus per lo smaltimento appropriato a causa dei rischi biologici.
Devono essere adottate precauzioni particolari quando si utilizza sangue umano potenzialmente infetto.
È fondamentale utilizzare reagenti privi di endotossine in tutti i protocolli.
1. Coltura di HRSV A2
<ol>
	<li>Coltivare cellule HeLa o HEp-2 in mezzo DMEM + 10% siero fetale bovino (SFB) + 1% penicillina/streptomicina (P/S) in una fiasca da 175 cm2 fiasca di coltura fino a quando non raggiungono una confluenza di circa il 50%.</li>
	<li>Lavare le cellule tre volte con soluzione salina tamponata al fosfato a temperatura ambiente (PBS).</li>
	<li>Scongelare una provetta contenente il ceppo virale di HRSV da utilizzare come iniziatore di infezione a 37 °C in un bagno termico. Diluire il ceppo virale in modo da mantenere un MOI di 0,1 o inferiore. Questo impedirà la generazione di particelle difettive interferenti (DIPs). Diluire il ceppo virale in 4 ml/flacone di mezzo di infezione (DMEM + 1% P/S) e aggiungerlo alle cellule HeLa o HEp-2. Mantenere questo volume il più basso possibile senza causare l'essiccamento delle cellule. Minore è il volume, maggiore sarà il tasso di infezione.</li>
	<li>Incubare 2-4 ore a 37 °C, 5% CO₂2. Agitare delicatamente il matraccio ogni 15 minuti per ridistribuire il mezzo.</li>
	<li>Rimuovere l'inoculo e lavare una volta con PBS.</li>
	<li>Aggiungere 15 ml di mezzo di coltura (DMEM + 10% FCS + 1% P/S) e incubare per 3-5 giorni a 37 °C, 5% CO₂2. Osservare le cellule mediante microscopia in campo chiaro normale per rilevare eventuali alterazioni citopatologiche indotte dal virus, ad es. formazione di sincizi, morte e cellule in sospensione</li>
	<li>Quando compaiono alterazioni citopatiche, raccogliere l'HRSV raschiando le cellule e raccogliere la sospensione virale in un tubo sterile da 50 ml. Vortexare la sospensione cellulare. Il raschiamento e il vortexaggio delle cellule liberano un numero maggiore di particelle virali.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione virale per 10 min a temperatura ambiente a 1.800 x g per formare il pellet dei detriti cellulari. L'HRSV nel soprannatante non forma pellet a questa velocità ed il soprannatante può essere utilizzato direttamente per infettare più piastre da 175 cm2 fiasche o possono essere conservate a -80 °C come ceppo di semina in aliquote da 1 ml per un uso futuro. Congelare sempre rapidamente l'HRSV in azoto liquido per prevenire la perdita di particelle virali infettive.</li>
	<li>Come indicato sopra, il ceppo di inoculo preparato con il protocollo descritto viene utilizzato per infettare più fiasche da 175 cm2 flaconi di coltura. Ripetere esattamente il protocollo per produrre ulteriore virus da purificare. Purificare fino a 180 ml di sospensione virale in un singolo ciclo di ultracentrifugazione.</li>
	<li>Quando compaiono i segni di citopatia, raccogliere il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) raschiando le cellule e recuperando il sopranatante. Vortexare la sospensione virale. Centrifugare per 10 min a temperatura ambiente a 1.800 x g per formare il pellet dei detriti cellulari. L'HRSV presente nel sopranatante non forma pellet a questa velocità ed il sopranatante viene frazionato in aliquote da 15 ml in provette da 50 ml. Congelare rapidamente e conservare a -80 °C fino alla purificazione.</li>
</ol>
2. Purificazione di HRSV
Nota: prima di utilizzare un ultracentrifugo, tieni presente che si tratta di un apparecchio potenzialmente pericoloso. Leggi attentamente i manuali e esegui la prima centrifugazione in ultracentrifuga sotto la supervisione di una persona esperta.
<ol>
	<li>Pulire i rotori dell'ultracentrifuga con etanolo al 70% e lasciarli asciugare all'interno di una cappa a sicurezza biologica.</li>
	<li>Posizionare un tubo da centrifuga sterile in ciascun rotore.</li>
	<li>Preparare una soluzione di saccarosio al 30% (p/v) in soluzione PBS, sterilizzare per filtrazione (filtro da 0,2 μm) e aggiungere 5 ml alla base di ogni tubo da centrifuga. Per un protocollo più rapido, i tubi contenenti la soluzione di saccarosio possono essere congelati. Assicurarsi di mantenerli sterili.</li>
	<li>Se la soluzione di saccarosio non è stata congelata, aggiungere con molta attenzione 30 ml di soluzione di HRSV sopra la soluzione di saccarosio. Usare la pipetta lentamente per evitare di disturbare lo strato di saccarosio. Mantenere una netta demarcazione. Se i tubi erano congelati, versare la sospensione virale sopra la soluzione di saccarosio congelata e lasciarla poi scongelare.</li>
	<li>Bilanciare con attenzione i sei rotori dell'ultracentrifuga utilizzando PBS sterile. Posizionare la bilancia all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere sterilità. Riempire i tubi fino a 3-5 mm dal bordo, altrimenti i tubi da centrifuga potrebbero collassare. Bilanciare i rotori entro 0,1 g, includendo il tappo avvitabile, nel caso in cui i tappi non siano perfettamente uguali.</li>
	<li>Centrifugare nell'ultracentrifuga per 1,5 ore, a 4 °C e a 20.000 rcf.</li>
	<li>Rimuovere con attenzione il tubo da centrifuga dal rotore utilizzando pinze sterili. Le particelle virali avranno attraversato lo strato di saccarosio e formeranno un pellet. Al contrario, i fattori solubili secreti dalle cellule (e.g. citochine) rimarranno in soluzione. Inclinare il tubo da centrifuga per drenare tutto il liquido. Lasciarlo capovolto su una superficie sterile, e.g. una piastra per colture, per farlo asciugare, ma evitare che il pellet si secchi completamente.</li>
	<li>Aggiungere con attenzione 1 ml di soluzione salina equilibrata di Hank (HBSS) al pellet e inclinare il tubo da centrifuga per drenare l'HBSS. Lasciare nuovamente asciugare il tubo capovolto su una superficie sterile. Evitare che il pellet si secchi completamente.</li>
	<li>Risospendere il pellet in 1 ml di HBSS aspirando e dispensando 40 volte con la pipetta. Cercare di evitare la formazione di bolle d'aria, poiché potrebbero danneggiare il virus.</li>
	<li>Aliquotare il virus, congelare rapidamente in azoto liquido e conservare a -80 °C fino all'uso successivo. Utilizzare un nuovo aliquota di virus per ogni esperimento, poiché i cicli ripetuti di congelamento-scongelamento riducono il titolo infettivo. Durante lo scongelamento, sciogliere sempre il virus a 37 °C, poiché l'HRSV è meno stabile tra -20 e 15 °C.</li>
</ol>
3. Quantificazione di HRSV
Nota: per garantire dati riproducibili, ripetere la quantificazione almeno 3 volte in duplicato.
3.1. Infezione delle cellule A549
<ol>
	<li>Coltivare le cellule A549 in una piastra a 24 pozzetti fino a confluenza.</li>
	<li>Lavare le cellule A549 due volte con 1 ml di PBS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare diluizioni seriali 5-fold di HRSV nel mezzo con siero ridotto. Aggiungere 100 μl di virus diluito in entrambi i pozzetti. Preparare almeno 4 diluizioni (ad es. 4-, 20-, 100- e 500-fold). Includere due pozzetti aggiuntivi infettati con la dose più alta di virus (utilizzati per il controllo di isotipo) e includere due pozzetti non infettati (mock-infected).</li>
	<li>Incubare le cellule per 2 ore a 5% CO2, 37 °C. Agitare delicatamente la piastra a 24 pozzetti ogni 15 minuti per evitare l'essiccamento.</li>
	<li>Rimuovere la sospensione virale e lavare le cellule una volta con 1 ml di PBS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Preparare l'albumina sierica bovina (BSA) al 4% (p/v) nel mezzo con siero ridotto. Sterilizzare mediante filtrazione (filtro da 0,2 μm) e aggiungere 500 μl in ogni pozzetto.</li>
	<li>Incubare a 5% CO2, 37 °C per 22 ore.</li>
</ol>
3.2. Preparazione per la FACS
<ol>
	<li>Rimuovere il mezzo e lavare le cellule una volta con 1 ml di PBS a temperatura ambiente.</li>
	<li>Aggiungere 200 μl di tripsina preriscaldata (37 °C) in ogni pozzetto e incubare per 10 min a 37 °C, 5% CO2.</li>
	<li>Verificare al microscopio il distacco delle cellule. Se le cellule si sono staccate, aggiungere 800 μl di DMEM + 10% FCS + 1% P/S per neutralizzare la tripsina. Risospendere le cellule.</li>
	<li>Trasferire le cellule in una piastra 96 pozzetti conica, non trattata per colture cellulari. Centrifugare per 5 min a 400 x g a temperatura ambiente. Risospendere il pellet in 200 μl di PBS freddo.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 200 μl di PBS freddo.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 150 μl di acetone al 80% ghiacciato.</li>
	<li>Fissare le cellule a temperatura ambiente per 15 min.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 200 μl di PBS freddo + 0,1 % BSA.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 50 μl di anti-NP-RSV-FITC (diluito 1:50 in PBS + 1% BSA) oppure in 50 μl di IgG2 anti topo-FITC (questo è un controllo di isotipo; pertanto utilizzare la stessa concentrazione anticorpale).</li>
	<li>Per il resto del protocollo, mantenere i tubi al buio. Incubare almeno 1 ora a 4 °C, ma l'incubazione può essere prolungata fino a tutta la notte.</li>
	<li>Aggiungere 150 μl di PBS freddo + 0,1% BSA.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 200 μl di PBS freddo + 0,1% BSA.</li>
	<li>Centrifugare per 5 min a 400 x g a 4 °C. Eliminare il soprannatante e risospendere in 200 μl di PBS freddo + 0,1% BSA. Mantenere la piastra sul ghiaccio e al buio fino alla misurazione in FACS.</li>
	<li>Misurare le cellule infette mediante citometria a flusso.</li>
</ol>
3.3. Calcolo del FITC-50
<ol>
	<li>Utilizzare un programma di analisi di citometria a flusso per impostare la soglia utilizzando il controllo negativo (controllo isotipico). Utilizzare il tipo di grafico a pseudocolore. Disegnare una gate a quadrante, dove le cellule positive si trovano nel quadrante Q3. La percentuale di falsi positivi deve essere inferiore allo 0,2% in entrambi i controlli isotipici.</li>
	<li>Esportare i dati in un programma di foglio elettronico e preparare una tabella con la percentuale di cellule FITC+ per ogni diluizione. Sottrarre il valore medio dei falsi positivi (determinato tramite il controllo isotipico) da ciascun valore sperimentale.</li>
	<li>Aprire un nuovo file (grafico a dispersione XY, singola X e colonne multiple di Y) in un programma statistico. Copiare i dati in questo programma: X = diluizione, Y = % di cellule infette, n = 3, utilizzando la media di due misurazioni per ogni diluizione. Eseguire una regressione non lineare con analisi statistica di decadimento esponenziale monofasico. Verificare se la curva si adatta ai punti dati; in caso contrario, scegliere un’analisi statistica differente.</li>
	<li>Copiare l'equazione della curva e i valori corrispondenti in un programma di foglio elettronico. Calcolare il valore di X per Y = 50%. Determinare di conseguenza il valore FITC-50 calcolando le Particelle Infettive Rilevate con FITC/ml (FIP/ml) alla diluizione alla quale si verifica il 50% di infezione, utilizzando la seguente equazione: 
	<img alt="Formula di calcolo del FITC50; diagramma che illustra l'equazione di misurazione dell'intensità di fluorescenza." fo:src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50766/50766eq1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Equazione 1"> 
	A = numero medio di cellule A549/per pozzetto 
	B = μl di virus per pozzetto utilizzati per l'infezione 
	C = diluizione alla quale si verifica il 50% di infezione</li>
</ol>
4. Isolamento di cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) dal sangue di volontari sani
<ol>
	<li>Prelieva sangue venoso in provette da 10 ml con EDTA da volontari sani dopo consenso informato. Un volume di 10 ml di sangue produrrà circa 107 PBMC.</li>
	<li>Da questo momento in poi, lavora in condizioni sterili all'interno di una cappa a flusso laminare.</li>
	<li>Diluisci il sangue di 2 volte con PBS a temperatura ambiente in una provetta da 50 ml. Per ogni provetta da 50 ml, può essere utilizzato un volume massimo totale di 35 ml di sangue diluito.</li>
	<li>Prendi una siringa sterile da 50 ml e applica un ago con connessione Luer lock sterilizzato. Aspira il mezzo di gradiente di densità nella siringa. Posiziona l'ago sul fondo di una provetta contenente il sangue diluito e pipetta con attenzione 15 ml di mezzo di gradiente di densità al di sotto del sangue diluito. Mantieni una netta separazione tra il mezzo di gradiente di densità e il sangue.</li>
	<li>Centrifuga a 800 x g a temperatura ambiente per 20 minuti con accelerazione a 9 (massima) e freno disattivato. Imposta la temperatura della centrifuga a 4 °C dopo l'uso.</li>
	<li>La centrifugazione su gradiente di densità produrrà diversi strati. Sul fondo si formerà un pellet di eritrociti, con uno strato argentato in superficie contenente i neutrofili. Lo strato chiaro sopra questo pellet contiene il mezzo di gradiente di densità. Uno strato sottile tra il mezzo di gradiente di densità e lo strato superiore di plasma sanguigno contiene i PBMC.</li>
	<li>Raccogli con attenzione i PBMC mediante pipetta di Pasteur e trasferisci le cellule in una nuova provetta da 50 ml. Da questo momento in poi, mantieni i PBMC sul ghiaccio e utilizza PBS freddo. Aggiungi PBS freddo fino a un volume di 50 ml e centrifuga a 400 x g per 10 minuti a 4 °C (con il freno impostato a 9).</li>
	<li>Elimina il soprannatante per aspirazione, risospendi il pellet in 50 ml di PBS freddo e centrifuga a 400 x g per 10 minuti a 4 °C, ripeti il procedimento 2 volte.</li>
	<li>Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungi 1 ml di mezzo freddo (RPMI + 1% P/S) e conta le cellule utilizzando una camera di conta.</li>
	<li>Regola la concentrazione cellulare a 5 x 106 PBMC/ml.</li>
</ol>
5. Stimolazione di PBMC con HRSV vivo
<ol>
	<li>Preparare l'allestimento dell'esperimento; includere duplicati sperimentali per ogni condizione.</li>
	<li>Diluire tutti gli stimoli necessari nel mezzo (RPMI + 1% P/S). Tenere presente che il volume finale per pozzetto sarà di 200 μl. Verranno aggiunti 50 μl di stimolo, quindi preparare stock di stimolazione concentrati 4 volte.</li>
	<li>Aggiungere 100 μl della sospensione cellulare sopra menzionata in ogni pozzetto di una piastra 96 pozzetti a fondo rotondo (5 x 105 PBMC/pozzetto).</li>
	<li>Aggiungere 50 μl degli stimoli diluiti in ogni pozzetto. È possibile aggiungere due stimoli diversi, per un volume totale di 200 μl. Se è richiesto un solo stimolo, portare il volume a 200 μl aggiungendo mezzo.</li>
	<li>Incubare la piastra a 96 pozzetti per il periodo di incubazione richiesto a 37 °C in un incubatore con 5% di CO2. Per la maggior parte delle citochine, un'incubazione di 24 ore sarà sufficiente.</li>
</ol>
6. Lettura dell'attivazione
<ol>
	<li>Trascorso il periodo di incubazione, centrifugare la piastra a 96 pozzetti per 5 min a temperatura ambiente a 450 x g per raccogliere le cellule sul fondo.</li>
	<li>Raccogliere il sopranatante (prelevando un volume massimo di 180 μl) e conservarlo per analisi successive di citochine (-20 °C) o per la produzione di virus (-80 °C).</li>
	<li>I PBMC stimolati presenti nel pellet possono essere analizzati mediante qPCR o Western blot aggiungendo un buffer di lisi oppure, in alternativa, possono essere marcati per l'analisi in citometria a flusso.</li>
</ol>

<ol><li>Nair, H., Nokes, D. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+burden+of+acute+lower+respiratory+infections+due+to+respiratory+syncytial+virus+in+young+children%3A+a+systematic+review+and+meta-analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet%22%5BJournal%5D)">Global burden of acute lower respiratory infections due to respiratory syncytial virus in young children: a systematic review and meta-analysis.</a> Lancet. 375, 1545-1555 (2010).</li>
<li>Falsey, A. R., Hennessey, P. A., Formica, M. A., Cox, C., Walsh, E. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+in+elderly+and+high-risk+adults%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Eng.+J.+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection in elderly and high-risk adults.</a> N. Eng. J. Med. , 352-1749 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antiviral+Immune+Responses+and+Lung+Inflammation+after+Respiratory+Syncytial+Virus+Infection%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Am.+Thorac.+Soc%22%5BJournal%5D)">Antiviral Immune Responses and Lung Inflammation after Respiratory Syncytial Virus Infection.</a> Proc. Am. Thorac. Soc. 2 (2), 121-125 (2005).</li>
<li>Openshaw, P. J., Tregoning, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immune+responses+and+disease+enhancement+during+respiratory+syncytial+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbio.+Rev%22%5BJournal%5D)">Immune responses and disease enhancement during respiratory syncytial virus infection.</a> Clin. Microbio. Rev. 18 (3), 541-555 (2005).</li>
<li>Villenave, R., Thavagnanam, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+modeling+of+respiratory+syncytial+virus+infection+of+pediatric+bronchial+epithelium%2C+the+primary+target+of+infection+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">In vitro modeling of respiratory syncytial virus infection of pediatric bronchial epithelium, the primary target of infection in vivo.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (13), 5040-5045 (2012).</li>
<li>Tulic, M. K., Hurrelbrink, R. J., Prêle, C. M., Laing, I. A., Upham, J. W., Le Souef, P., Sly, P. D., Holt, P. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR4+polymorphisms+mediate+impaired+responses+to+respiratory+syncytial+virus+and+lipopolysaccharide%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR4 polymorphisms mediate impaired responses to respiratory syncytial virus and lipopolysaccharide.</a> J. Immunol. 179 (1), 132-140 (2007).</li>
<li>Vissers, M., Remijn, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+infection+augments+NOD2+signaling+in+an+IFN-%CE%B2-dependent+manner+in+human+primary+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus infection augments NOD2 signaling in an IFN-β-dependent manner in human primary cells.</a> Eur. J. Immunol. 42 (10), 2727-2735 (2012).</li>
<li>Cherukuri, A., Patton, K., Gasser, R. A. Jr, Zuo, F., Woo, J., Esser, M. T., Tang, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adults+65+years+old+and+older+have+reduced+number+of+functional+memory+T+cells+to+respiratory+syncytial+virus+fusion+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Vacc.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Adults 65 years old and older have reduced number of functional memory T cells to respiratory syncytial virus fusion protein.</a> Clin. Vacc. Immunol. 20 (2), 239-247 (2013).</li>
<li>Shafique, M., Wilschut, J., de Haan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+mucosal+and+systemic+immunity+against+respiratory+syncytial+virus+by+inactivated+virus+supplemented+with+TLR9+and+NOD2+ligands%5BTitle%5D)+AND+%22Vaccine%22%5BJournal%5D)">Induction of mucosal and systemic immunity against respiratory syncytial virus by inactivated virus supplemented with TLR9 and NOD2 ligands.</a> Vaccine. 30, 597-606 (2012).</li>
<li>Kwilas, S., Liesman, R. M., Zhang, L., Walsh, E., Pickles, R. J., Peeples, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+grown+in+Vero+cells+contains+a+truncated+attachment+protein+that+alters+its+infectivity+and+dependence+on+glycosaminoglycans%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus grown in Vero cells contains a truncated attachment protein that alters its infectivity and dependence on glycosaminoglycans.</a> J. Virol. 83 (20), 10710-10718 (2009).</li>
<li>Treuhaft, M. W., Beem, M. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Defective+interfering+particles+of+respiratory+syncytial+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Infect.+Immun%22%5BJournal%5D)">Defective interfering particles of respiratory syncytial virus.</a> Infect. Immun. 37 (2), 439-444 (1982).</li>
<li>Korns Johnson, D., Homann, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accelerated+and+improved+quantification+of+lymphocytic+choriomeningitis+virus+%28LCMV%29+titers+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Accelerated and improved quantification of lymphocytic choriomeningitis virus (LCMV) titers by flow cytometry.</a> PLoS One. 7 (5), e37337(2012).</li>
<li>Wurfel, M. M., Park, W. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+high+and+low+responders+to+lipopolysaccharide+in+normal+subjects%3A+an+unbiased+approach+to+identify+modulators+of+innate+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Identification of high and low responders to lipopolysaccharide in normal subjects: an unbiased approach to identify modulators of innate immunity.</a> J. Immunol. 175 (4), 2570-2578 (2005).</li>
<li>Kimpen, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Respiratory+syncytial+virus+and+asthma.+The+role+of+monocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Respir.+Crit.+Care+Med%22%5BJournal%5D)">Respiratory syncytial virus and asthma. The role of monocytes.</a> Am. J. Respir. Crit. Care Med. 163, 7-9 (2001).</li>
<li>Wang, S. Z., Forsyth, K. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+of+neutrophils+with+respiratory+epithelial+cells+in+viral+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Respirology%22%5BJournal%5D)">The interaction of neutrophils with respiratory epithelial cells in viral infection.</a> Respirology. 5 (1), 1-10 (2000).</li>
<li>San-Juan-Vergara, H., Sampayo-Escobar, V., Reyes, N., Cha, B., Pacheco-Lugo, L., Wong, T., Peeples, M. E., Collins, P. L., Castano, M. E., Mohapatra, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cholesterol-rich+microdomains+as+docking+platforms+for+respiratory+syncytial+virus+in+normal+human+bronchial+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Virol%22%5BJournal%5D)">Cholesterol-rich microdomains as docking platforms for respiratory syncytial virus in normal human bronchial epithelial cells.</a> J. Virol. 86 (3), 1832-1843 (2012).</li>
<li>Davidson, D., Zaytseva, A., Miskolci, V., Castro-Alcaraz, S., Vancurova, I., Patel, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+expression+profile+of+endotoxin-stimulated+leukocytes+of+term+new+born%3A+control+of+cytokine+gene+expression+by+interleukin-10%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Gene expression profile of endotoxin-stimulated leukocytes of term new born: control of cytokine gene expression by interleukin-10.</a> Plos One. 8 (1), e53641(2013).</li>
</ol>

Non abbiamo nulla da rivelare.

In questo studio, dimostriamo che l'infezione da PBMC con HRSV è un sistema modello veloce e affidabile in cui è possibile studiare le vie infiammatorie. Al fine di stimolare le PBMC, è necessario preparare e quantificare uno stock di HRSV.
Più linee cellulari sono suscettibili all'infezione da HRSV. Le linee cellulari più utilizzate per la coltura di HRSV sono le cellule HEp-2, HeLa e Vero. Tuttavia, non raccomandiamo l'uso di cellule Vero per la coltura di HRSV perché è stato dimostrato che ...

Il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) è la causa più comune di infezioni del tratto respiratorio inferiore nei bambini. Ogni anno, oltre 33 milioni di bambini di età inferiore ai cinque anni vengono infettati da HRSV, causando oltre tre milioni di ricoveri e quasi 200.000decessi1. Un numero crescente di prove suggerisce che l'HRSV rappresenta anche una minaccia significativa per gli anziani e gli adulti con malattie croniche sottostanti2.
La maggior parte delle infezioni da HRSV nei bambini piccoli si presenta con sintomi lievi, paragonabili al comune raffreddore, e non richiede un intervento clinico. Tuttavia, una piccola percentuale di pazienti richiede il ricovero in ospedale e la ventilazione meccanica a causa di una grave bronchiolite.
Parte della patogenesi della malattia HRSV è la risposta immunitaria iperesuberante e inadeguata dell'ospite all'infezione3,4. Ciò è illustrato da diverse osservazioni. Il periodo di massima malattia è spesso preceduto dal picco di infezione virale e coincide meglio con l'infiltrazione cellulare dei tessuti infetti e il rilascio di citochine infiammatorie3. Un'altra linea di prova proviene dagli studi sull'HRSV inattivato in formalina (FI-RSV) negli anni '60. Invece di indurre protezione nei neonati, il vaccino ha provocato una risposta immunitaria esagerata con conseguente aumento della malattia respiratoria e maggiore morbilità e mortalità.
Sono stati sviluppati diversi modelli per studiare la patogenesi delle infezioni da HRSV. Linee cellulari continue, come HEp-2 e A549, sono state ampiamente utilizzate per studiare l'infezione da HRSV in vitro. Le cellule epiteliali sono i bersagli primari dell'infezione da HRSV5, quindi molta attenzione è stata rivolta a questi tipi di cellule. Tuttavia, la situazione in vivo è molto più complessa e non si limita a un solo tipo di cellula. Al fine di esaminare queste complesse interazioni, sono stati sviluppati diversi modelli di infezione animale per studiare la patogenesi dell'HRSV. Finora, sono state impiegate due diverse strategie, concentrandosi sia su modelli eterologhi (non umani) che su modelli affini ospite-pneumovirus. Esempi di modelli eterologhi per l'HRSV includono scimpanzé, pecore, ratti di cotone e topi. L'infezione da RSV nel suo ospite naturale è stata studiata nei bovini e nei topi, utilizzando rispettivamente l'RSV bovino e lo pneumovirus.
Sebbene ciascuno di questi modelli abbia fornito importanti informazioni sulla patogenesi della malattia, l'HRSV è altamente adattato all'uomo. Pertanto, in aggiunta alle linee cellulari e ai modelli animali attualmente utilizzati, proponiamo di utilizzare le PBMC primarie umane come modello per la stimolazione con HRSV. Le PBMC umane possono essere ottenute da una serie di individui per rispondere a specifiche domande di ricerca, tra cui bambini piccolidi 6 anni, individui immunocompromessi e adulti sani7 o individui anziani8. Le PBMC possono essere utilizzate per studiare gli aspetti innati dell'infezione e la risposta adattativa al virus. Le vie infiammatorie attivate, importanti per la patogenesi della malattia da HRSV, possono essere studiate a livello di mRNA e proteine. Inoltre, l'infezione virale di (sottogruppi di) cellule immunitarie può essere determinata mediante citometria a flusso. Abbiamo precedentemente utilizzato questo modello per identificare gli effetti sinergici dell'infezione da HRSV insieme al ligando batterico muramyl dipeptide (MDP) sull'induzione di citochine proinfiammatorie7. Proponiamo di utilizzare la stimolazione con HRSV di PBMC primarie umane come modello in vitro robusto, facile e veloce per studiare le vie infiammatorie coinvolte nella patogenesi della malattia da HRSV.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent</td></tr><tr><td>PBS</td><td>Lonza</td><td>BE17-516F</td><td>PBS senza Ca2+ Mg2+ o rosso fenolo</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Invitrogen</td><td>14025-100</td><td>HBSS, Calcio, Magnesio, senza Rosso fenolo</td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Invitrogen</td><td>31966-047</td><td>DMEM, Alto glucosio, GlutaMAX, Piruvato</td></tr><tr><td>RPMI</td><td>Invitrogen</td><td>72400054</td><td>RPMI 1640 Medium, GlutaMAX, HEPES</td></tr><tr><td>Reduced Serum Medium (Opti-MEM)</td><td>Invitrogen</td><td>51985-026</td><td>Opti-MEM I Reduced Serum Medium, GlutaMAX</td></tr><tr><td>FCS</td><td>Greiner Bio-one</td><td></td><td>FBS (Fetal Bovine Serum)</td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>Albumina da siero bovino</td></tr><tr><td>P/S</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td>Penicillina-Streptomicina, tripsina liquida</td></tr><tr><td></td><td>Invitrogen</td><td>25300-054</td><td>0,05% Tripsina-EDTA (1x), fenolo rosso</td></tr><tr><td>HeLa cellule</td><td>ATCC</td><td>CCL-2</td><td></td></tr><tr><td>A549 cellule</td><td>ATCC</td><td>CCL-185</td><td></td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7903</td><td>Saccarosio BioXtra, &ge; 99,5%</td></tr> <tr><td>IgG2 anti-topo-FITC</td><td>BD Pharmingen</td><td>555057</td><td>Ms IgG2b K FITC controllo dell'isotipo</td></tr><tr><td>Anti-NP-RSV-FITC</td><td>Abcam</td><td>ab25849</td><td>Anti-Respiratory Syncytial Virus antibody [671] (FITC)</td></tr><tr><td>Gradiente di densità medio (Lymphoprep)</td><td>Axis-Shield</td><td>1114545</td><td></td></tr><tr><td>provette EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>367525</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Merck Millipore</td><td>1000141000</td><td>Acetone per analisi</td></tr><tr><td colspan="4">Materiale </td></tr><tr><td>Provette da centrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td>Thinwall, Polyallomero, 38,5 ml, 25 mm x 89 mm</td></tr><tr><td>SureSpin 630 Rotore con secchi da 36 ml</td><td>Sorvall</td><td>79368</td><td>Rotore in titanio a secchiello oscillante</td></tr><tr><td>Sorvall WX80 Ultracentrifuge</td><td>Sorvall</td><td>46900</td><td></td></tr><tr><td>CB 150l CO2</td><td>Legante</td><td></td><td></td> per incubatori</tr></tbody></table>

un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Le infezioni da virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) presentano un ampio spettro di gravità della malattia, che va da infezioni lievi a bronchiolite pericolosa per la vita. Una parte importante della patogenesi della malattia grave è una risposta immunitaria potenziata che porta all'immunopatologia.	Qui, descriviamo un protocollo utilizzato per studiare la risposta immunitaria delle cellule immunitarie umane a un'infezione da HRSV. In primo luogo, descriviamo i metodi utilizzati per la coltivazione, la purificazione e la quantificazione dell'HRSV. Successivamente, descriviamo un modello umano in vitro in cui le cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) vengono stimolate con HRSV vivo. Questo sistema modello può essere utilizzato per studiare molteplici parametri che possono contribuire alla gravità della malattia, tra cui la risposta immunitaria innata e adattativa. Queste risposte possono essere misurate a livello trascrizionale e traduzionale. Inoltre, l'infezione virale delle cellule può essere facilmente misurata utilizzando la citometria a flusso. Nel complesso, la stimolazione della PBMC con HRSV vivo fornisce un sistema modello rapido e riproducibile per esaminare i meccanismi coinvolti nella malattia indotta da HRSV.

Il metodo di coltivazione e purificazione di HRSV A2 descritto qui fornirà un rendimento compreso tra 2 x 107 e 2 x 108 particelle virali infettive quantificate con FITC-50/ml. I risultati dell'analisi microscopica, in cui sono state contate le cellule infette marcate con FITC (risultati non mostrati), sono stati confrontati con i risultati della quantificazione mediante FACS (Figura 1). Entrambi i metodi hanno prodotto titoli simili, sebbene il metodo FACS abbia presentato una devi...

Il virus respiratorio sinciziale umano (HRSV) può causare grave bronchiolite nei neonati. Parte della patogenesi della malattia grave da HRSV è causata dalla risposta immunitaria dell'ospite. La stimolazione delle cellule immunitarie umane primarie con HRSV fornisce un sistema modello rapido e riproducibile per studiare l'attivazione delle vie infiammatorie e delle infezioni.

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la risposta delle cellule immunitarie umane all'infezione da virus respiratorio sinciziale, o RSV. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una ceppa infettiva di RSV su cellule helo. Nel secondo passaggio, la ceppa di RSV coltivata viene purificata mediante ultracentrifugazione.In seguito, le cellule immunitarie primarie umane del sangue vengono isolate mediante centrifugazione su gradiente di densità. Nell'ultima fase, le cellule immunitarie isolate vengono stimolate con il virus. Infine, la risposta immunitaria cellulare all'infezione da RSV può essere valutata mediante ELIZA qPCR o citometria a flusso.Questa tecnica rappresenta un importante contributo per lo studio delle infezioni virali del tratto respiratorio in situ. Il virus RSV è altamente adattato all'uomo. Pertanto, è fondamentale utilizzare cellule immunitarie umane per studiare le vie infiammatorie coinvolte nella patogenesi del virus.Sebbene il virus utilizzato in questo video sia il VSR, questo metodo può essere facilmente adattato anche per lo studio di altri virus, come il virus dell'influenza o il rinovirus. Iniziare riscaldando una provetta contenente una

an-vitro-model-to-study-immune-responses-human-peripheral-blood

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus sinciziale respiratorio umano

Questo metodo permette la caratterizzazione di batteri estesa co-coltura con EpiAirways, primario dei tessuti epiteliali respiratorie umane cresciute all'interfaccia aria-liquido, un biologicamente...

L&#39;uso del Modello EpiAirway per Caratterizzare a lungo termine interazioni ospite-patogeno

Questo video dimostra una tecnica in vitro per stimolare i linfociti tramite Haemophilus influenzae (NTHi) non tipizzabile e per valutare la risposta immunitaria. L'incubazione di cellule mononucleate isolate del sangue periferico (PBMC) con NTHi fa sì che le cellule batteriche stimolino i linfociti T, portando alla produzione di citochine. Dopo aver inibito la secrezione di citochine, viene eseguita la colorazione in immunofluorescenza per rilevare le citochine intracellulari accumulate nei...

Una tecnica in vitro per stimolare i linfociti attraverso batteri patogeni

Questo video dimostra l'infezione ex vivo del tessuto mucoso uterino umano con il virus dell'immunodeficienza umana di tipo 1, HIV-1, e il loro mantenimento sopra spugne di gelatina all'interfaccia aria-liquido. Questo metodo consente di monitorare la replicazione e la patogenesi dell'HIV-1 all'interno dei tessuti umani.

Un modello di infezione della mucosa cervicale umana per studiare la patogenesi dell'HIV in condizioni ex vivo

Questo video mostra un test per misurare gli anticorpi neutralizzanti contro il virus respiratorio sinciziale (RSV). La pre-incubazione con siero contenente anticorpi neutralizzanti l'RSV neutralizza le particelle virali, riducendo l'infezione cellulare e la formazione di placche. Le cellule infettate dal virus vengono quindi sottoposte a fissazione, blocco e marcatura degli anticorpi coniugati con fluorofori per la visualizzazione della placca. Questo processo consente l'identificazione della...

Un test per misurare il titolo anticorpale neutralizzante specifico per il virus respiratorio sinciziale

Questo video dimostra una tecnica in vitro per identificare le cellule immunitarie che risiedono nei polmoni murini. Dopo aver isolato le cellule immunitarie bersaglio dal tessuto polmonare murino, queste vengono marcate in superficie utilizzando un cocktail di anticorpi marcati con fluorofori contro marcatori specifici su cellule immunitarie innate e adattative. Inoltre, i monociti, i macrofagi e le cellule dendritiche vengono marcati utilizzando un marcatore intracellulare. I vari tipi di...

Un metodo in vitro per identificare le cellule immunitarie innate e adattative che risiedono nei polmoni murini

C'è una generale mancanza di conoscenza su come funzionano i vaccini. Qui proponiamo l'uso combinato della genetica inversa e dei topi chimerici del midollo osseo per ottenere informazioni sulle risposte immunitarie precoci dell'ospite ai vaccini, con particolare attenzione alle cellule dendritiche e all'immunità delle cellule T.

Intranasale somministrazione di ricombinante Influenza vaccini nei modelli chimerico topo per studiare immunità delle mucose

La co-infezione umana è difficile da replicare in vitro. Tuttavia, i parassiti della malaria umana possono essere facilmente coltivati in vitro, così come le cellule mononucleate del sangue periferico umano appena isolate e naturalmente infettate dall'HIV. Ciò fornisce un modello eccellente per studiare le risposte immunitarie precoci ai parassiti della malaria nel contesto della co-infezione da HIV.

Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Modello per la misurazione Risposte immunitarie Malaria nel contesto della coinfezione da HIV

Questo studio descrive un throughput elevato, basato su formazione immagine di analisi di micro-neutralizzazione per determinare il titolo degli anticorpi neutralizzanti specifici per il virus respiratorio sinciziale (RSV). Questo formato di dosaggio è stato testato su tipi di campioni diversi.

Un'analisi di Micro-neutralizzazione del Virus respiratorio sinciziale (RSV) migliorata e ad alta velocità di trasmissione

Descriviamo un metodo per la generazione e amplificando geneticamente modificate virus sinciziale respiratorio (ad) e un saggio della placca ottimizzato per ad. Illustriamo questo protocollo creando due virus ricombinanti che rispettivamente permettono di quantificazione della replica di RSV e live analisi dei corpi di inclusione di RSV e dinamiche di granuli di corpi di inclusione-collegata.

Generazione, amplificazione e titolazione del virus sinciziale respiratorio ricombinante

Questo protocollo descrive in dettaglio un'indagine sulle prime interazioni tra cellule epiteliali nasali infettate viralmente e attivazione cellulare innata. I singoli sottoinsiemi di cellule immunitarie possono essere distinti in base alla loro attivazione in risposta alle infezioni virali. Possono quindi essere ulteriormente studiati per determinare i loro effetti sulle prime risposte antivirali.

Modello di co-coltura senza contatto per lo studio dell'attivazione delle cellule immunitarie innate durante l'infezione da virus respiratorio

Questo protocollo fornisce istruzioni per la somministrazione intranasale di IAV e l'analisi a valle del danno polmonare di topo e delle modifiche trascrizionali associate ai tipi di cellule polmonari.

Modellazione della riparazione alveolare polmonare displastica e funzionale dopo l'infezione influenzale

Scopri come stimolare le cellule mononucleate del sangue periferico umano con il virus respiratorio sinciziale per analizzare le vie infiammatorie attivate. Questo metodo consente di valutare la risposta immunitaria cellulare mediante tecniche avanzate.

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano allinfezione da virus respiratorio sinciziale umano (Video) | JoVE Journal

Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

Esplora altri video