Un modello in vitro per studiare le risposte immunitarie delle cellule mononucleate del sangue periferico umano all'infezione da virus respiratorio sinciziale umano

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare la risposta delle cellule immunitarie umane all'infezione da virus respiratorio sinciziale, o RSV. Questo viene ottenuto innanzitutto coltivando una ceppa infettiva di RSV su cellule helo. Nel secondo passaggio, la ceppa di RSV coltivata viene purificata mediante ultracentrifugazione.

In seguito, le cellule immunitarie primarie umane del sangue vengono isolate mediante centrifugazione su gradiente di densità. Nell'ultima fase, le cellule immunitarie isolate vengono stimolate con il virus. Infine, la risposta immunitaria cellulare all'infezione da RSV può essere valutata mediante ELIZA qPCR o citometria a flusso.

Questa tecnica rappresenta un importante contributo per lo studio delle infezioni virali del tratto respiratorio in situ. Il virus RSV è altamente adattato all'uomo. Pertanto, è fondamentale utilizzare cellule immunitarie umane per studiare le vie infiammatorie coinvolte nella patogenesi del virus.

Sebbene il virus utilizzato in questo video sia il VSR, questo metodo può essere facilmente adattato anche per lo studio di altri virus, come il virus dell'influenza o il rinovirus. Iniziare riscaldando una provetta contenente una scorta di VSR umano in un bagno d'acqua a 37 gradi Celsius. Una volta scongelato il virus, diluire la scorta in aliquote di quattro millilitri di mezzo di infezione per ogni fiala.

Mantenendo l'MOI a 0,1 o inferiore, aggiungere il virus alle cellule heli utilizzando il volume totale più basso possibile senza causare l'essiccamento delle cellule. Quindi incubare le colture per due-quattro ore a 37 gradi Celsius e 5%CO2, agitando delicatamente il flacone ogni 15 minuti per ridistribuire il mezzo. Successivamente, rimuovere l'inoculo e lavare le cellule una volta con PBS.

Quindi aggiungere 15 millilitri di mezzo di coltura nei flaconi e incubarli per tre-cinque giorni nelle stesse condizioni di coltura. Osservare le cellule una volta al giorno, ogni giorno, mediante microscopia ottica in campo chiaro per rilevare eventuali alterazioni citopatologiche indotte dal virus. Quando tali alterazioni vengono osservate, raschiare le cellule per raccogliere il virus della parainfluenza umana (RSV), quindi raccogliere la sospensione in un tubo sterile da 50 millilitri, centrifugare le cellule e poi centrifugarle per 10 minuti a 1800 G e temperatura ambiente per ottenere un pellet di detriti cellulari.

RSV non forma un pellet a questa velocità, quindi il soprannatante può essere conservato a meno 80 gradi Celsius come ceppo di inoculo in aliquote da un millilitro. Gli aliquote per usi futuri devono essere sempre congelati rapidamente in azoto liquido per prevenire la perdita di particelle virali infettive. Per purificare l'RSV, iniziare posizionando un tubo da centrifuga sterile in ogni alloggiamento di un ultracentrifugo.

Quindi aggiungere cinque millilitri di soluzione di saccarosio appena preparata e filtrata sterilmente sul fondo di ogni tubo. Successivamente, aggiungere molto lentamente 30 millilitri della soluzione di RSV sulla soluzione di saccarosio, avendo cura di non disturbare la soluzione di saccarosio e di mantenere distinte le due fasi. Poi, all'interno di una cappa a flusso laminare per mantenere la sterilità, bilanciare attentamente i sei secchi per ultracentrifugazione con PBS sterile, in modo che la differenza di peso tra di essi, tappi inclusi, non superi 0,1 grammi. Centrifugare il virus per 1,5 ore a 20.000 RCF e a quattro gradi Celsius.

E poi, al termine della centrifugazione, utilizzare una pinzetta sterile per rimuovere con cura i tubi della centrifuga dai portatubi. Le particelle virali avranno attraversato lo strato di saccarosio formando un pellet. Inclinare i tubi della centrifuga in un flacone per rifiuti virali e lasciare che il tubo si svuoti a testa in giù su una superficie sterile.

Non lasciare asciugare completamente il pellet. Successivamente, far scorrere con attenzione un millilitro di HPSS sul pellet e inclinare nuovamente il tubo da centrifuga per far defluire l'HPSS. Quindi capovolgere di nuovo il tubo, avendo cura di evitare che il pellet si secchi.

Ora risospendere il pellet 40 volte in un altro millilitro di HBSS, avendo cura di evitare la formazione di bolle poiché queste possono distruggere il virus. Successivamente, congelare rapidamente aliquote del virus in azoto liquido. Conservare il virus a meno 80 gradi Celsius fino alla quantificazione e all'uso successivo. Dopo aver ottenuto il sangue in provette da 10 millilitri con EDTA da volontari sani, diluire il sangue con PBS a temperatura ambiente fino a un massimo di 35 millilitri di sangue diluito in una provetta da 50 millilitri.

Successivamente, applicare un ago sterile con blocco a vite su una siringa sterile da 50 millilitri ed aspirare il mezzo a gradiente di densità nella siringa. Posizionare l'ago sul fondo del tubo contenente il sangue diluito ed aggiungere con attenzione 15 millilitri di mezzo a gradiente di densità al di sotto del sangue, mantenendo una netta separazione tra il gradiente di densità e il sangue. A questo punto, separare le cellule per 20 minuti a 800 GS a temperatura ambiente, con accelerazione massima e freno disattivato. Al termine della separazione, gli eritrociti si trovano nel pellet in fondo al tubo, con uno strato argentato di neutrofili posto al di sopra.

Lo strato chiaro sopra il pellet contiene il mezzo a gradiente di densità e lo strato sottile tra il mezzo a gradiente di densità e lo strato superiore di plasma sanguigno contiene i PBMC. Utilizzare una pipetta Pasteur per raccogliere con attenzione i PBMC, quindi trasferire le cellule in un nuovo tubo da 50 millilitri posto sul ghiaccio. Aggiungere PBS freddo di ghiaccio fino a un volume di 50 millilitri e centrifugare per raccogliere il pellet cellulare al termine della centrifugazione.

Aspirare il soprannatante e lavare il pellet in 50 millilitri di PBS freddo due volte; dopo il secondo lavaggio, aggiungere un millilitro di mezzo freddo al pellet, contare le cellule e regolare la concentrazione cellulare a cinque per 10 alla sesta pbmc per millilitro. Per stimolare le pbmc con RSV vivo, aggiungere prima 100 microlitri di pbmc in ogni pozzetto di una piastra a 96 pozzetti con fondo rotondo. Quindi aggiungere 50 microlitri di due stimoli appena diluiti a ciascun pozzetto.

Incubare bene la piastra per 24 ore a 37 gradi Celsius e 5% CO2, quindi centrifugare la piastra e raccogliere il sopranatante per un'analisi successiva mediante ELISA. I PBMC stimolati nel pellet possono essere analizzati mediante QPCR o colorati per la citometria a flusso. Quando si esegue un esperimento di stimolazione A-P-B-M-C, si consiglia il metodo della frazione di stimoli con questa procedura.

Le condizioni sono suddivise in condizioni di stimoli standard come RPMI o RSV umano e condizioni con frazioni di test come mial, dipeptide o LPS. È importante notare che in ogni esperimento vengono sempre inclusi un controllo negativo, come RPMI da solo, e un controllo positivo, come LPS. Dopo 24 ore di stimolazione con RSV, diverse popolazioni di PBMC mostrano un tasso di infezione dipendente dalla dose e una differenza nell'efficienza di infezione da RSV. Dopo 24 ore di stimolazione con il virus, l'analisi mediante qPCR dell'espressione di TNF-α o interferone-γ nei PBMC dimostra che l'RSV induce un forte aumento della trascrizione di queste due citochine infiammatorie. Al contrario, la stimolazione con mial, dipeptide o LPS determina soltanto una debole espressione di mRNA.

Quando i BMC di P vengono stimolati sia con RSV che con il dipeptide MIAL contemporaneamente, si osserva un forte effetto sinergico di upregolazione. I PBMC stimolati sono stati inoltre analizzati per la produzione di TNF alfa o interferone gamma mediante ELIZA. A differenza di quanto osservato a livello trascrizionale, l'RSV è un debole induttore della secrezione di proteine di TNF alfa e interferone gamma; la stimolazione dei BMC p con il dipeptide MIAM induce la produzione di basse quantità di TNF alfa e di nessun interferone gamma.

Simile alle analisi trascrizionali, sia il TNF alfa che l'interferone gamma mostrano un'upregolazione sinergica quando vengono co-stimolati con RSV e il dipeptide MIAM, utilizzato come controllo per verificare se l'induzione delle citochine dipenda dalla replicazione del RSV. I PBMC sono stati stimolati con RSV vivo o inattivato mediante beta-propionolattone, come illustrato nei grafici: sia il RSV vivo che quello inattivato hanno indotto la produzione di citochine pro-infiammatorie. Non dimenticare che gli esperimenti con il RSV devono essere eseguiti all'interno di una cappa di sicurezza biologica in un laboratorio di livello di sicurezza biologica 2.

Inoltre, è fondamentale ricordare, durante l'applicazione di questo metodo, di utilizzare reagenti e materiali privi di endotossine in tutte le fasi della procedura. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una chiara comprensione di come stimolare i PBMC umani con RSV e di diversi saggi che possono essere utilizzati per analizzare la risposta immunitaria.