Name: Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-10T21:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri la sintesi di complessi antitumorali a base di titanio e vanadio sensibili all'aria e la valutazione della loro citotossicità mediante saggio MTT su linee cellulari tumorali umane. Questo metodo permette di determinare i valori IC50.

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Il finanziamento è stato ricevuto dal Consiglio europeo della ricerca nell&#39;ambito del Settimo programma quadro della Comunità europea (FP7/2007-2013) / ERC accordo di sovvenzione no [239603]

<ol><li> Preparazione del V (V) complesso (Figura 2); 18 condotta passaggi 1.1-1.4 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, passare alla alternativa passaggi 2 (2.1-2.6). <ol><li> Sciogliere 0,42 mmol dei leganti H 2 L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di VO (O i Pr) 3 in THF. </li><li> Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 min, e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto. </li><li> Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa. </li><li> Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf. Passare al punto 3. </li></ol></li><li> Preparare il complesso V (V) usando una linea Schlenk. <ol><li> Sciogliere 0,42 mmol del legante H 2 L in THF anidro in un pallone Schlenk secco con un coperchio a diaframma, subordinare una linea Schlenk e diffusa alternata vuoto / gas inerte (N 2 o Ar) ambienti, si raccomanda di applicare tre sale turni e aspettare 2-5 minuti sulle fasi di vuoto. </li><li> Aggiungere THF anidro tramite siringa attraverso il coperchio a diaframma. </li><li> Aggiungere quantità equivalenti di VO (O i Pr) 3 in una soluzione di THF, che era stato preparato in modo simile agganciando un pallone Schlenk secco propria della linea, applicando un ambiente inerte e aggiungendo i reagenti attraverso una siringa dalla soluzione vanadio a quella di il ligando. </li><li> Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti e rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto, se c&#39;è una preoccupazione di prodotti instabili, effettuare tipo Schlenk distillazione di sostanze volatili in atmosfera inerte; utilizzare il flusso di gas inerte per fissare la vetreria necessaria che era stato Pre-essiccata . </li><li> Aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto. Una polvere viola scuro deve essere ottenuta con una resa quantitativa. </li><li> Pesare 8 mg del composto ottenuto in una fiala Eppendorf. </li></ol></li><li> Preparazione del Ti (IV) complesso (Figura 2); 28 </sup&gt; condotta passaggi 3.1-3.3 in un glove-box, se un glove-box non è disponibile, regolare le fasi alternative discusse per l&#39;analogo vanadio (passaggio 2) che impiegano una linea Schlenk invece. <ol><li> Sciogliere 0,35 mmol del legante H 2 L in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione di quantità equivalenti di Ti (O i Pr) 4 in THF. </li><li> Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 2 ore. Rimuovere le sostanze volatili sotto vuoto per dare un prodotto giallo in una resa quantitativa. </li><li> Pesare 8 mg del composto ottenuto in Eppendorf flaconcino. </li></ol></li><li> Preparazione di HT-29 cellule piastra a 96 pozzetti <ol><li> Culture HT-29 cellule in un pallone 75 centimetri 2 con mezzo RPMI-1640 contenente 1% di penicillina / streptomicina antibiotici, 1% di L-glutammina e 10% siero bovino fetale (FBS), a 37 ° C con 5% di CO 2 . </li><li> Rimuovere il mezzo quando il HT-29 cellule raggiungono la confluenza massima (90-100%, ogni 3-4 giorni senza sottocultura). Lavare con 1 mlsoluzione di tripsina (0,25%) / EDTA (0,05%) e rimuoverlo. </li><li> Aggiungere 1 ml di tripsina (0,25%) in soluzione / EDTA (0,05%) e incubare per 5 min. </li><li> Staccare le HT-29 cellule dal pallone e aggiungere 10 ml del mezzo per disabilitare l&#39;attività tripsina. Trasferire 5 ml della miscela cellule in una provetta. </li><li> Usare la pipetta per trasferire alcune gocce della miscela cellule nella camera del contatore. La camera di contatore include 5 x 5 caselle. </li><li> Contare le cellule in 5 quadrati rappresentativi utilizzando un microscopio: i 4 quadrati negli angoli e quello che è nel mezzo. </li><li> Calcolare la quantità stimata di cellule presenti. Sommare le celle nelle 5 piazze rappresentative e dividere per 20. </li><li> Dividere 0.6 dal risultato del punto 4.7. Il numero ricevuto è la quantità di miscela di cellule necessario per piastra. Questo calcolo si riferisce ad una piastra contenente 0,6 x 10 6 cellule (9.000 cellule per pozzetto). </li><li> Usare la pipetta per trasferire la quantità di miscela di cellule necessarie per pin ritardo (come calcolato nel paragrafo 4.8) e aggiungere 13,2 ml di terreno (200 microlitri per pozzetto × 66 pozzetti). </li><li> Aggiungere la miscela di piastra a 96 pozzetti con una pipetta 11 canali (200 microlitri per pozzetto, 6 linee, 66 pozzetti in totale). Un bene di ogni riga dovrebbe rimanere vuoto per il controllo del vuoto. </li><li> Incubare la piastra a 37 ° C con 5% di CO 2 per 24 ore per permettere alle cellule di attaccarsi alla piastra. </li></ol></li><li> Inserimento dei composti <ol><li> Aggiungere 200 microlitri (o quantità differente a seconda del campo di concentrazione desiderata) di THF anidro a 8 mg di ciascun composto pesato come descritto al punto 1.4 (o 2.6) o 3.3. Pesare 8 mg del legante H 2 L, anche. </li><li> Diluire ogni soluzione mescola ulteriormente con l&#39;aggiunta di 60 ml di THF in 9 diverse fiale Eppendorf. </li><li> Con una pipetta 60 microlitri della miscela nel paragrafo 5.1 al primo flaconcino Eppendorf, risospendere e trasferire 60 microlitri all&#39;altra fiala, e così via fino a 10 differenti concentrazioni sono obtained (compresa la miscela madre nel paragrafo 5.1). </li><li> Diluire 20 ml di ciascuna concentrazione in THF con 180 ml di mezzo. </li><li> Preparare una soluzione di controllo con un solo THF, 20 ml di THF con 180 ml di mezzo in ogni misurazione. </li><li> Aggiungere 10 microlitri della soluzione risultante (compreso il controllo THF), a ciascun pozzetto contenente già 200 microlitri della soluzione citata delle cellule nel mezzo di ottenere concentrazioni finali del composto di fino a 200 mg / L (intervallo di concentrazione può essere modificato secondo l&#39;attività composto). </li><li> Si può osservare una certa precipitazione alla concentrazione massima applicata a seconda della solubilità composto. </li><li> Ripetere ogni misurazione dei composti 3x (3 linee nella piastra dello stesso composto); ciascuna riga contiene: cellule trattate con il composto in 10 differenti concentrazioni, 1 pozzetto contenente cellule trattate con solvente solo per 1 pozzetto senza cellule per vuoto controllo. </li><li> Incubare la piastra caricata per 3 giorni a 37 ° C in 5% CO 2 nell&#39;atmosfera. </li></ol></li><li> Misurazione citotossicità usando il saggio MTT <ol><li> Preparare la soluzione MTT aggiungendo 1 g di polvere MTT ad una soluzione di mezzo RPMI-1640 200 ml senza rosso fenolo. La soluzione madre può essere diviso per provette da 15 ml e conservato a -20 ° C. </li><li> Aggiungere 20 ml di soluzione di MTT ad ogni pozzetto con una pipetta 11 canali (tranne che per i pozzetti di controllo in bianco, senza le cellule dal punto 4.10), e incubare la piastra per ulteriori 3 ore. </li><li> Rimuovere la soluzione intermedia, da ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 200 ml di isopropanolo a ciascun pozzetto per sciogliere formazano. Mescolare la piastra per 0,5 ore fino a raggiungere omogeneità. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 550 nm per 200 microlitri della soluzione citata da uno spettrofotometro per micropiastre. </li><li> Ripetere ogni misurazione (che include 3 ripetizioni, vedere il punto 5.8) per 3 giorni diversi. </li><li> Calcola tegli percentuale di vitalità cellulare detraendo il valore di assorbanza del bianco di controllo dal valore misurato, dividendo il risultato per l&#39;assorbanza del valore di controllo solvente THF e moltiplicando per 100%. </li><li> Calcola IC 50 valori utilizzando il software GraphPad Prism (o equivalente). </li><li> La IC 50 è riportata la media di tutti i valori di IC 50 raccolti su almeno tre diversi giorni, e il valore di errore è la deviazione standard. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari in competizione.

Il metodo descritto in questo manoscritto unisce la sintesi chimica con saggio biologico vitalità cellulare. Come con tutti i metodi biologici relativi cellule vitali, è fondamentale per lavorare in una cappa laminare, e mantenere condizioni di sterilità, compreso l&#39;uso di solventi organici sterili. Inoltre, la preparazione e lo stoccaggio di farmaci a base di metallo idroliticamente instabile devono essere effettuate in condizioni inerti, per i quali dovrebbero essere utilizzati tecniche vano portaoggetti o di line...

La chemioterapia è ancora uno dei principali cicli di trattamenti impiegati in clinica per varie malattie tumorali, e quindi grande quantità di ricerca è condotta in tutto il mondo con l&#39;obiettivo di sviluppare nuovi e migliori farmaci antitumorali. Tali studi principalmente iniziano a livello chimico, con la progettazione e la preparazione di composti, seguita da valutazione biologica delle proprietà citotossiche in vitro. La vitalità cellulare può essere valutata da vari saggi che forniscono informazioni sulle attività cellulare 1-2. Cisplatino è un esempio di un complesso di platino che è ampiamente utilizzato come farmaco chemioterapico, che è considerato un trattamento efficace soprattutto per testicolari e ovarico 3-4. Tuttavia, la sua ristretta gamma di attività e di gravi effetti collaterali innescare studi di altri complessi di metalli di transizione potente 5-8. Tra gli altri, titanio (IV) e vanadio (V) complessi hanno mostrato risultati promettenti alta attività e ridottiTossicità 9-16. Ti (IV) complessi sono stati i primi ad entrare in studi clinici, dopo cisplatino causa di queste proprietà, tuttavia, hanno fallito le prove a causa delle difficoltà di formulazione e di instabilità idrolitica. Vi è quindi l&#39;esigenza attuale lo sviluppo di nuove derivati ​​di questi complessi metallici che possono combinare elevata attività antitumorale con resistenza all&#39;acqua 15,17-21. Una sfida nella preparazione di Ti (IV) e V (V) complessi riferisce alla instabilità idrolitica dei reagenti precursori, pertanto, atmosfera inerte deve essere mantenuta. La preparazione di Ti (IV) e V (V) composti è condotta sotto N 2 o Ar condizioni in una scatola portaoggetti o utilizzando tecniche di linea Schlenk. Un metodo comune per valutare l&#39;attività anti-cancro è basato sul MTT (3 - (4,5-dimethylthiazolyl) -2,5-diphenyltetrazolium bromuro) saggio. Questo saggio è un saggio colorimetrico vitalità che è stato presentato nel 1983 da Mosmann22. È estremamente ben studiato e caratterizzato, ed è considerato molto efficace quando si valuta l&#39;efficacia di nuovi composti citotossici per la sua precisione, rapidità, ed la sua capacità di essere applicato su varie linee cellulari. Questo saggio redditività si basa sul cambiamento di colore della molecola MTT quando è esposto a cellule vitali. Misurazione dell&#39;assorbanza, che è proporzionale al numero di cellule vitali, e rispetto a controlli non trattati, ha la valutazione delle capacità di inibizione della crescita cellulare del composto testato. Il saggio colorimetrico MTT è condotto in un formato di piastra da 96 pozzetti 23. Le cellule possono richiedere preincubazione nei pozzetti prima dell&#39;aggiunta del farmaco testato. I tempi di preincubazione possono variare 0-24 ore secondo le proprietà della linea cellulare. Cellule sono solitamente esposte al farmaco per 24-96 ore a seconda dell&#39;attività farmaco. Soluzione di MTT è quindi aggiunta alle cellule trattate, dove il urlanoow MTT è ridotto a formazano viola da una varietà di enzimi mitocondriali e citosolici che sono operativi in cellule vitali (Figura 1) 24. La molecola MTT non è diminuito di cellule morte o globuli rossi (cellule metabolicamente inattivi), cellule della milza (cellule di riposo) e di linfociti A-stimolata concanavalina (cellule attivate) 22. Dopo 3-4 ore di incubazione con MTT precipitati formazano. La formazione del formazano inizia dopo 0,5 ore di incubazione, ma per ottenere risultati ottimali è meglio esporre le cellule ad MTT per almeno 3 ore 22. Di conseguenza, il terreno di coltura viene rimosso e il formazano viene disciolta in un solvente organico, preferibilmente isopropanolo 25, sebbene DMSO può anche essere utilizzato 26. L&#39;eliminazione del mezzo è fondamentale per ottenere risultati accurati da rosso fenolo, che è molto comune nel terreno di coltura, e precipitando proteine ​​possono interferire con la misurazione dell&#39;assorbanza 25. Quando la formasoluzione zan raggiunge omogenea, l&#39;assorbanza della soluzione viene misurata utilizzando uno spettrofotometro per micropiastre. L&#39;assorbanza a 550 nm è direttamente proporzionale al numero di celle in serie di 200-50,000 cellule per pozzetto, e quindi molto piccole quantità di cellule può essere rilevata 22. L&#39;assorbanza indica la quantità di cellule vitali residuo dopo il trattamento con il farmaco, e viene confrontato con l&#39;assorbanza di cellule di controllo che non sono stati esposti al farmaco. Analisi dei risultati per il software corretto prevede l&#39;(concentrazione di inibizione; 50%) IC 50 valori ei loro errori statistici basati su diverse ripetizioni della misura. Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità per lo screening di nuovi composti antitumorali, grazie alla sua precisione e la relativa semplicità. Tuttavia, quando si utilizza il saggio MTT, che è dipesa reazione enzimatica, si deve considerare che i vari inibitori enzimatici possono influenzare la riduzione di un MTTd portare a falsi risultati 27. Inoltre, il saggio MTT non fornisce alcuna informazione sul meccanismo molecolare dell&#39;attività citotossica del farmaco 2.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Biological Industries</td><td>04-007-1A</td><td></td></tr><tr><td>Hexane AR</td><td>Gadot</td><td>830122313</td><td>Essiccato utilizzando un sistema di essiccazione a solvente</td></tr><tr><td>HT-29 linea cellulare</td><td>ATCC</td><td>HTB-38</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanolo AR</td><td>Gadot</td><td>830111370</td><td></td></tr><tr><td>L-glutammina</td><td>Biological Industries</td><td>03-020-1B</td><td></td></tr><tr><td>MTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655-1G</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotici penicillina/streptomicina</td><td>Biological Industries</td><td>03-031-1B</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640 con rosso fenolo con L-glutammina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8758</td><td></td></tr><tr><td>RPMI senza rosso fenolo</td><td>Biological Industries</td><td>01-103-1A</td><td></td></tr><tr><td>Tetraidrofurano (THF) AR</td><td>Gadot</td><td>830156391</td><td>essiccato utilizzando un sistema di essiccazione a solvente</td></tr><tr><td>Ti(OiPr)4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>205273-500ML</td><td>sensibile all'umidità</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA</td><td>Biological Industries</td><td>03-052-1B</td><td></td></tr><tr><td>VO(OiPr)3</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>404926-10G</td><td>umidità sensitive</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Pipetta a 12 canali 30-300 &mu; l</td><td>Pipetta Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>a 12 canali 5-50 &mu; l</td><td>Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>75 cm2 pallone</td><td>NUNC</td><td>156472</td><td></td></tr><tr><td>piastra a 96 pozzetti con coperchio (fondo piatto)</td><td>NUNC</td><td>167008</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Legante per incubatore</td><td></td><td>APT.line C150</td><td></td></tr><tr><td>Controcamera</td><td>Marienfeld-Superior</td><td>650030</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf fiala</td><td>KARTELL</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Scatola a guanti</td><td>M. Braun</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cappa a flusso laminare</td><td>ADS LAMINAIRE</td><td>OPTIMALE 12</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro lettore di micropiastre</td><td>Bio-Tek</td><td>El-800</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio</td><td>Nikon</td><td>Eclipse TS100</td><td></td></tr><tr><td>Pipetta 20-200 &mu; l</td><td>Pipetta Finnpipette</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5-50 &mu; l</td><td>Pipetta</td><td></td><td></td> a pinna</tr></tbody></table>

antitumorali metallo complessi: sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio mtt

Anticancer Metal Complexes: Synthesis and Cytotoxicity Evaluation by the MTT Assay

Titanio (IV) e vanadio (V) complessi sono agenti antitumorali molto potenti. Una sfida nella loro sintesi si riferisce alla loro instabilità idrolitica; quindi la loro preparazione deve essere condotta in atmosfera inerte. Valutazione dell&#39;attività antitumorale di questi complessi può essere ottenuto mediante il saggio MTT. Il saggio MTT è un saggio colorimetrico basato sulla redditività riduzione enzimatica della molecola MTT a formazano quando è esposto a cellule vitali. Il risultato della riduzione è un cambiamento di colore della molecola MTT. Misure di assorbanza relativi a un controllo determinano la percentuale rimanente cellule tumorali vitali dopo il loro trattamento con diverse concentrazioni di un composto in esame, che si traduce per l&#39;attività antitumorale componenti ei valori di IC 50. Il saggio MTT è molto comune negli studi di citotossicità grazie alla sua precisione, rapidità e relativa semplicità. Qui abbiamo preinviato un protocollo dettagliato per la sintesi di farmaci a base di metallo sensibile dell&#39;aria e la misurazione della vitalità cellulare, compresa la preparazione delle piastre delle celle, incubazione dei composti con le cellule, misure di vitalità usando il saggio MTT, e determinazione dei valori di IC 50.

I complessi sono stati preparati sulla base delle procedure stabilite 18,28 e la loro purezza può essere valutata mediante analisi NMR ed elementare. I dati ricevuti dal saggio MTT viene analizzata per valutare la citotossicità del composto 18,21. In primo luogo, viene eseguita la sottrazione del valore di assorbanza del bianco di controllo da tutti gli altri valori. In secondo luogo, il valore del controllo del solvente THF è impostato su 100% vitalità, come è stato ag...

Un metodo per la sintesi di titanio e vanadio agenti antitumorali-vie sensitive è descritto, insieme con la valutazione della loro attività citotossica verso la linea di cellule di cancro umano dal saggio MTT.

Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT

Titanium (IV) and vanadium (V) complexes are highly potent anticancer agents. A challenge in their synthesis refers to their hydrolytic instability; ...

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare farmaci metallocomplessi antitumorali e valutarne la citotossicità mediante il saggio MTT. Questo viene realizzato innanzitutto sintetizzando composti antitumorali a base di metalli. Il secondo passaggio consiste nel preparare piastre a 96 pozzetti contenenti cellule tumorali.Successivamente, i composti anticancerogeni a base di metalli vengono inseriti nelle cellule tumorali. L'ultimo passaggio consiste nel misurare la vitalità cellulare mediante il saggio MTT, in cui si misura la riduzione del MTT da parte di enzimi mitocondriali e citosolici per formare lo zen, determinando infine l'attività anticancerogena e la concentrazione inibitoria massima al 50%. Oppure vengono determinati i valori di IC50 dei composti.Generalmente, le persone alle prime armi con questo metodo possono incontrare difficoltà poiché si tratta di una procedura articolata in più passaggi che richiede la massima attenzione da parte dell'operatore ed è vincolata a una tempistica rigorosa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché la preparazione della piastra cellulare non è immediata, in quanto il lavoro con cellule vitali richiede il rispetto di specifiche linee guida. All'interno di una camera a flusso laminare, preparare il complesso del vanadio cinque sciogliendo 0,42 millimoli del precursore del legante in THF anidro.Quindi aggiungerlo a una soluzione in THF contenente quantità equivalenti di vanadio o tris isoprossido in agitazione. Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti prima di rimuovere i componenti volatili sotto vuoto. Successivamente, aggiungere esano freddo e rimuoverlo sotto vuoto.Si dovrebbe ottenere una polvere di colore viola scuro con resa quantitativa. Pesare otto milligrammi del composto ottenuto in un vial epi o orph. Per preparare il complesso di titanio quattro, sciogliere 0,35 millimoli del precursore del legante in THF anidro e aggiungerlo a una soluzione sotto agitazione contenente quantità equimolari di tetraisopropilato di titanio in THF.Agitare la miscela di reazione a temperatura ambiente per due ore. Successivamente, rimuovere i componenti volatili sotto vuoto per ottenere un prodotto giallo con resa quantitativa. Pesare otto milligrammi del composto ottenuto in una provetta eppendorf per preparare le cellule HT 29 in una piastra a 96 pozzetti per la prima coltura.Le cellule in un fiasco da 75 centimetri quadrati come descritto nel protocollo del testo, rimuovere il mezzo quando le cellule HT 29 raggiungono la massima confluenza. Dopo aver lavato le cellule con un millilitro di soluzione di tripsina EDTA, aggiungere un millilitro della stessa soluzione e incubare per cinque minuti. Staccare le cellule HT 29 dal fiasco e aggiungere 10 millilitri di mezzo per inibire l'attività della tripsina.Trasferire cinque millilitri della miscela cellulare in un tubo. Utilizzare una pipetta per trasferire alcune gocce della miscela cellulare in una camera di conta. La camera di conta comprende due parti composte da quadrati cinque per cinque.Contare le cellule in cinque quadrati rappresentativi di ogni parte utilizzando un microscopio. Quattro quadrati agli angoli e un quadrato al centro. Calcolare la quantità stimata di cellule presenti.Sommare le cellule nelle cinque quadratine rappresentative di ogni parte. Calcolare la somma media delle due parti e dividere per 20. Successivamente, dividere 0,6 per il quoziente ottenuto.Il numero ottenuto corrisponde alla quantità di miscela cellulare necessaria per ogni piastra. Questo calcolo si riferisce a una piastra contenente 9.000 cellule per pozzetto. Utilizzando una pipetta, unire la quantità di miscela cellulare necessaria per ogni piastra con 13,2 millilitri di mezzo di coltura.Aggiungere la miscela in una piastra a 96 pozzetti. Utilizzare una pipetta a 11 canali con un volume di 200 microlitri per pozzetto su sei linee, per un totale di 66 pozzetti. Un pozzetto per ogni linea deve rimanere vuoto come controllo bianco.Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per consentire alle cellule di aderire alla piastra. Per inserire i composti, aggiungere prima 200 microlitri di THF anidro a otto milligrammi del composto in peso. Diluire ulteriormente la soluzione del composto aggiungendo prima 60 microlitri di THF in nove diversi tubi Eppendorf. Per ogni soluzione, utilizzare una pipetta per trasferire 60 microlitri dalla soluzione del composto al primo tubo Eppendorf.Quindi risospendere e trasferire 60 microlitri nel vial successivo e così via fino a ottenere 10 concentrazioni diverse. Procedere diluendo 20 microlitri di ciascuna concentrazione in THF con 180 microlitri di mezzo. Inoltre, preparare una soluzione controllo contenente solo il solvente aggiungendo 20 microlitri di THF a 180 microlitri di mezzo.Successivamente, aggiungere 10 microlitri da ciascuna soluzione risultante in ciascun pozzetto, che contiene già 200 microlitri della suddetta soluzione di cellule nel mezzo, per ottenere concentrazioni finali del composto fino a 200 milligrammi per litro. Ogni riga contiene cellule trattate con il composto in 10 concentrazioni diverse.Un pozzetto di controllo contenente cellule trattate solo con solvente e un pozzetto senza cellule per il controllo in bianco; impostare le linee in modo da ripetere ogni misurazione del composto tre volte. Incubare la piastra caricata per tre giorni a 37 gradi Celsius in un'atmosfera al 5% di anidride carbonica. Preparare la soluzione di MTT come descritto nel protocollo testuale, utilizzando una pipetta a 11 canali.Aggiungere 20 microlitri di soluzione MTT in ogni pozzetto, tranne nei pozzetti di controllo in bianco. Incubare la piastra per ulteriori tre ore dopo l'incubazione. Rimuovere la soluzione del mezzo da ogni pozzetto e aggiungere 200 microlitri di isopropanolo in ciascun pozzetto.Per sciogliere la formina, agitare la piastra per 30 minuti fino a ottenere una soluzione omogenea. Misurare l'assorbanza a 550 nanometri per 200 microlitri della soluzione omogenea mediante un lettore di micropiastre o uno spettrofotometro, ripetendo ogni misurazione in tre giorni diversi. Successivamente, calcolare la percentuale di vitalità cellulare sottraendo il valore di assorbanza del controllo in bianco dal valore misurato, dividendo il risultato per l'assorbanza del controllo con solvente THF e moltiplicando per 100%. Calcolare i valori della concentrazione inibitoria massima al 50% utilizzando un software di analisi grafica.L'IC50 riportato è la media di tutti i valori di IC50 raccolti in almeno tre giorni diversi, e il valore di errore corrisponde alla deviazione standard. I dati ottenuti dal saggio MTT vengono analizzati per valutare la citotossicità del composto. Le misurazioni devono essere effettuate su un intervallo di concentrazioni che consenta di ottenere un grafico con una distribuzione uniforme dei punti, almeno tre punti su ciascuna delle due piattaforme e tre punti per definire la pendenza.Misurazioni insufficienti ad alte o basse concentrazioni comprometteranno l'adattamento della curva tramite regressione non lineare, necessario per la determinazione dei valori di IC 50, riducendone di conseguenza l'accuratezza. I valori relativi di IC 50, ottenuti mediante l'adattamento della regressione non lineare, corrispondono alle concentrazioni che determinano il 50% dell'inibizione della crescita cellulare ottenibile con il composto testato. Tale valore viene calcolato come punto medio tra la massima e la minima vitalità cellulare misurata, che non sono necessariamente pari al 100% e allo 0% rispettivamente.Quando si esaminano i risultati degli esperimenti descritti nel protocollo, è evidente che il cisplatino, così come i complessi di titanio e vanadio, sono altamente attivi. È inoltre osservabile che più il valore massimo di inibizione di un determinato composto si avvicina al 100%, più il valore relativo di IC50 si avvicina a quello assoluto confrontando i valori di IC50 tra i diversi composti.Il complesso del titanio quattro presenta la citotossicità più elevata e i suoi valori di IC50 sono inferiori a quelli del cisplatino e del complesso del vanadio cinque. Tuttavia, il ligando libero mostra un'attività notevolmente ridotta, poiché dopo l'aggiunta del ligando a diverse concentrazioni, la vitalità cellulare non diminuisce in modo altrettanto significativo rispetto ai suoi complessi.Ciò assicura che l'elevata attività antitumorale dei complessi dipenda dai centri metallici durante il tentativo di questa procedura. È importante mantenere condizioni sterili in ogni momento. Dopo aver visto questo video, dovreste avere una buona comprensione di come valutare la citotossicità dei vostri composti antitumorali mediante il saggio M-T-T-S-A.

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Chimica

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