Antitumorali metallo Complessi: Sintesi e citotossicità valutazione da parte del saggio MTT

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare farmaci metallici antitumorali e valutare la loro citotossicità mediante il test MTT. Ciò si ottiene sintetizzando prima composti antitumorali a base di metalli. Il secondo passo consiste nel preparare piastre a 96 pozzetti di cellule tumorali.

Successivamente, i composti antitumorali a base di metalli vengono inseriti nelle cellule tumorali. Il passo finale consiste nel misurare la vitalità cellulare mediante il test MTT, in cui viene misurata la riduzione di MTT da parte degli enzimi mitocondriali e citosolici per formare zen, in ultima analisi, l'attività antitumorale e la concentrazione inibitoria semimassima. Oppure vedo che vengono determinati 50 valori dei composti.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà perché si tratta di una procedura in più fasi che richiede la piena attenzione dell'operatore di laboratorio ed è posta su una tempistica rigorosa. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto la preparazione della piastra cellulare non è semplice perché lavorare con cellule vitali richiede di seguire linee guida particolari. Lavorando in una scatola a guanti, preparare il complesso vanadio cinque sciogliendo 0,42 millimoli del precursore del ligando in THF secco.

Quindi aggiungerlo a una soluzione di agitazione di quantità equivalenti di vanadio o ossido di tris isop in THF. Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per 15 minuti prima di rimuovere i volatili sotto vuoto. Quindi, aggiungi un esano freddo e rimuovilo sotto vuoto.

Una polvere viola scuro dovrebbe essere ottenuta in una resa quantitativa. Pesare otto milligrammi del composto ottenuto in una fiala di epiorfo. Per preparare il complesso di titanio quattro, sciogliere 0,35 millimoli del precursore del ligando in THF secco e aggiungerlo a una soluzione di agitazione di quantità equivalenti di ossido di tetra isop di titanio in THF.

Mescolare la miscela di reazione a temperatura ambiente per due ore. Quindi rimuovere i volatili sotto vuoto per ottenere un prodotto giallo in resa quantitativa. Pesare otto milligrammi del composto ottenuto in una fiala di eph per preparare le cellule HT 29 in una prima coltura su piastra a 96 pozzetti.

Le cellule in un pallone da 75 centimetri quadrati, come descritto nel protocollo di testo, rimuovono il terreno quando le cellule HT 29 raggiungono la massima cofluenza. Dopo aver lavato le cellule in un millilitro di soluzione di tripsina EDTA, aggiungere un millilitro della stessa soluzione e incubare per cinque minuti. Staccare le cellule HT 29 dal pallone e aggiungere 10 millilitri di terreno per disabilitare l'attività della tripsina.

Trasferire cinque millilitri della miscela cellulare in una provetta. Utilizzare una pipetta per trasferire alcune gocce della miscela cellulare in una controcamera. La controcamera comprende due parti di cinque per cinque quadrati.

Conta le cellule in cinque quadrati rappresentativi di ogni parte usando un microscopio. Quattro quadrati agli angoli e un quadrato al centro. Calcola la quantità stimata di cellule presenti.

Somma le celle nei cinque quadrati rappresentativi di ciascuna parte. Calcola la somma media delle due parti e dividi per 20. Quindi, dividi 0,6 per il quoziente.

Il numero ricevuto è la quantità di miscela di celle necessaria per piastra. Questo calcolo si riferisce a una piastra che contiene 9.000 celle per pozzetto. Utilizzando una pipetta, combinare la quantità di miscela cellulare necessaria per piastra con 13,2 millilitri di terreno.

Aggiungere il composto in una piastra da 96 pozzetti. Utilizzando una pipetta a 11 canali da 200 microlitri per pozzetto su sei linee contenenti 66 pozzetti in totale. Un pozzetto di ogni riga deve rimanere vuoto per il controllo vuoto.

Incubare la piastra a 37 gradi Celsius con il 5% di anidride carbonica per 24 ore per consentire alle cellule di attaccarsi alla piastra per inserire prima i composti, aggiungere 200 microlitri di THF secco a otto milligrammi del composto in peso. Diluire ulteriormente la soluzione composta aggiungendo prima 60 microlitri di THF in nove diverse lime einor. Per ogni soluzione, utilizzare una pipetta per trasferire 60 microlitri dalla soluzione composta alla prima lima einor.

Quindi sospendere e trasferire 60 microlitri nella fiala successiva e così via fino ad ottenere 10 concentrazioni diverse. Procedere a diluire 20 microlitri di ciascuna concentrazione in THF con 180 microlitri di terreno. Inoltre, preparare una soluzione di controllo a solo solvente aggiungendo 20 microlitri di THF a 180 microlitri di terreno.

Quindi, aggiungere 10 microlitri da ciascuna soluzione risultante a ciascun pozzetto. Questo contiene già 200 microlitri della suddetta soluzione di cellule nel terreno per dare concentrazioni finali del composto fino a 200 milligrammi per litro. Ogni linea contiene cellule trattate con il composto in 10 diverse concentrazioni.

Un pozzetto di controllo contenente cellule trattate solo con solvente e un pozzetto senza celle Per il controllo del bianco, impostare le linee in modo da ripetere ogni misurazione del composto tre volte. Incubare la piastra caricata per tre giorni a 37 gradi Celsius in atmosfera di anidride carbonica al 5%. Preparare la soluzione MTT come descritto nel protocollo di testo utilizzando una pipetta a 11 canali.

Aggiungere 20 microlitri di soluzione MTT a ciascun pozzetto ad eccezione dei pozzetti di controllo in bianco. Incubare la piastra per altre tre ore dopo l'incubazione. Rimuovere la soluzione di terreno da ogni pozzetto e aggiungere 200 microlitri di isopropanolo a ciascun pozzetto.

Per sciogliere la formina, mescolare la piastra per 30 minuti fino a renderla omogenea. Misurare l'assorbanza a 550 nanometri per 200 microlitri della soluzione omogenea mediante un lettore di micropiastre, spettrofotometro che ripete ogni misurazione in tre giorni diversi. Successivamente, calcolare la percentuale di vitalità cellulare sottraendo il valore di assorbanza di controllo del bianco dal valore misurato, dividendo il risultato per l'assorbanza del valore di controllo del solvente THF e moltiplicando per il 100%Calcolare i valori di concentrazione inibitoria semimassimale utilizzando il software di rappresentazione grafica.

L'IC 50 riportato è la media di tutti i valori IC 50 raccolti in almeno tre giorni diversi e il valore di errore è la deviazione standard. I dati ricevuti dal test MTT vengono analizzati per valutare la citotossicità del composto. Le misure devono essere eseguite su un intervallo di concentrazioni che produrrà un grafico che mostra una distribuzione di punti pari, almeno tre punti su ciascun altopiano e tre punti per definire la pendenza.

Misurazioni insufficienti ad alte o basse concentrazioni compromettono l'adattamento di regressione non lineare della curva richiesto per la determinazione dei valori IC 50 e, di conseguenza, ne diminuiscono l'accuratezza. I valori relativi di IC 50 determinati dall'adattamento di regressione non lineare corrispondono alle concentrazioni che portano al 50% dell'inibizione della crescita cellulare possibile dal composto testato. Questo è calcolato come il punto medio tra la vitalità cellulare massima e minima misurata, che non sono necessariamente rispettivamente del 100% e dello 0%.

Durante l'ispezione dei risultati degli esperimenti descritti nel protocollo. È chiaro che il cisplatino e i complessi di titanio e vanadio sono altamente attivi. Si nota anche che più il valore massimo di inibizione di un dato composto è vicino al 100%, più il valore relativo di IC 50 è vicino a quello assoluto quando si confrontano i valori di IC 50 tra i diversi composti.

Il complesso di titanio quattro ha la più alta citotossicità e i suoi valori di IC 50 sono inferiori a quelli del cisplatino e del complesso di vanadio cinque. Tuttavia, il ligando libero mostra un'attività marcatamente ridotta dopo l'aggiunta del ligando a diverse concentrazioni. La vitalità cellulare non diminuisce in modo così significativo come per i suoi complessi.

Ciò assicura che l'elevata attività antitumorale dei complessi si basi sui centri metallici durante il tentativo di questa procedura. È importante mantenere sempre condizioni sterili. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come valutare la citotossicità dei tuoi composti antitumorali mediante M-T-T-S-A.