In vivo ¹⁹ F MRI per il tracciamento cellulare

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di visualizzare e quantificare il numero di 19 cellule marcate con F in vivo utilizzando 19 FMRI. Questo può essere fatto in un contesto clinico o preclinico. Ciò si ottiene etichettando prima le celle con un agente 19 F adatto.

Questo è spesso fatto ex vivo. Il secondo passo consiste nel quantificare il contenuto di 19 F per cella, che può essere fatto utilizzando 19 F e MR con un riferimento noto. Si presume che il contenuto di 19 F per cella rimanga costante durante l'esperimento, altrimenti devono essere calcolati i fattori di correzione.

Successivamente, il soggetto viene ripreso in vivo utilizzando un FMRI H e 19 per localizzare le cellule marcate trasferite. Un riferimento noto e parametri di imaging appropriati sono essenziali per la quantificazione dei dati dell'immagine. Il passaggio finale consiste nell'elaborare i dati dell'immagine per calcolare il numero di celle.

L'istologia ex vivo o altre tecniche possono essere utilizzate per corroborare i dati, ove possibile. In definitiva, 19 FMRI per il tracciamento cellulare in vivo possono essere utilizzati per studiare le cellule trasferite in termini di localizzazione e numero nel periodo di tempo rilevante, date alcune ipotesi come delineato nel testo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come un HMRI che utilizza etichette di celle super paramagnetiche, è che non c'è alcun segnale di fondo confondente e che il numero di cellule può essere determinato direttamente dai dati dell'immagine.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo delle terapie cellulari, come ad esempio dove sono le cellule e quante sono presenti in vari momenti. Per iniziare questo protocollo, aggiungere prima un'etichetta 19 F alle cellule dendritiche immature a una concentrazione di quattro milligrammi per 1 milione di cellule in due millilitri di terreno. Quindi agitare delicatamente per mescolare.

Successivamente, incubare le cellule dendritiche con l'etichetta per tre giorni prima della maturazione e della raccolta. Quindi raccogliere le celle e rimuovere l'etichetta in eccesso lavando almeno tre volte. Nella conta dei PBS, le cellule risultanti si riattivano in un piccolo volume di PBS per l'iniezione o ulteriori test.

Si noti che il protocollo qui descritto è rilevante per queste specifiche cellule dendritiche e l'etichetta. Quindi, un protocollo per un altro tipo di cellula dovrà essere trovato in letteratura o ottimizzato dal ricercatore. Inserire un numero noto di cellule marcate in una provetta NMR.

Quindi aggiungere 10 microlitri di acido tri Fluor o acido al 5%, o TFA. Se la frequenza di risonanza del TFA non è adatta a causa della sovrapposizione con l'etichetta, utilizzare un composto solubile alternativo. Posizionare un campione in uno spettrometro NMR e ottenere lo spettro del fluoro 19.

Quindi calcolare le aree relative sotto i picchi del riferimento e del campione o del picco principale del campione, quindi calcolare il numero medio di fluoro per cella nel campione. Si noti che l'intero processo dovrebbe essere ripetuto in media per raggiungere la significatività statistica. Questo può essere fatto anche utilizzando la spettroscopia direttamente sullo scanner MRI.

Si noti inoltre che questa procedura rivela solo il carico medio di fluoro 19 per un gran numero di cellule, non la variabilità tra le cellule. Il controllo dell'uniformità dell'assorbimento cellulare richiede la presenza di un componente fluorescente con l'agente 19 F. Qui solo il terzo scenario mostra l'etichettatura omogenea delle cellule, anche se questo è sempre assunto nei calcoli, questo può essere verificato utilizzando tecniche complementari come la microscopia impostata per l'imaging posizionando un topo completamente anestetizzato in una culla e immobilizzandolo per impedire il movimento durante la scansione.

Inoltre, è possibile collegare il controllo della temperatura e della respirazione per il monitoraggio fisiologico durante la scansione. Se necessario, posizionare un riferimento esterno accanto all'animale, sia il riferimento che la regione di interesse dovrebbero essere al centro della bobina. Inizia l'acquisizione con una risonanza magnetica protonica convenzionale come riferimento anatomico per l'imaging 19 F.

Quindi sintonizzare il sistema sulla frequenza 19 F del marcatore cellulare ed eseguire una scansione a 19 FMRI. Idealmente, la scansione a 19 FMRI avrà lo stesso campo visivo e la stessa selezione della fetta di una risonanza magnetica convenzionale, anche se probabilmente con una risoluzione inferiore. Quindi, determinare il guadagno dell'impulso di riferimento di 19 F utilizzando la formula vista qui e acquisire uno spettro di 19 FNMR per determinare la frequenza di 19 F.

Stimare il fattore C dipendente dalla bobina di radiofrequenza in un esperimento in vitro separato. L'uso di una bobina a radiofrequenza con un profilo B uno omogeneo, come una bobina di superficie, può ostacolare la quantificazione dei dati 19 F. Poiché il segnale dipende non solo dalla concentrazione di 19 F, ma anche dalla distanza dalla bobina.

Pertanto, acquisire una mappa B one sul canale H per correggere retrospettivamente i dati 19 F. Ciò richiede che i profili della bobina di un H e 19 F siano identici ad eccezione del fattore di proporzionalità C e che venga fornito un segnale di fondo H sufficiente nelle regioni di 19 F. Qui vediamo le mappe dell'angolo di inversione dei tubi con TFA in acqua acquisita su un canale H e 19 F. Per correggere i dati di 19 F, acquisire prima una mappa dell'angolo di inversione di un H con il metodo a due angoli di inversione.

Utilizzare una scansione a gradiente con un TR molto lungo superiore a tre volte rispetto a uno HT con un angolo di ribaltamento stimato di poco inferiore a 90 gradi vicino alla bobina. Quindi acquisisci una seconda scansione eco sfumata con il doppio dell'angolo di capovolgimento della prima scansione. Calcola l'angolo di inversione alfa di un H a vle X, Y, Z tramite il segnale e il senso della prima e della seconda scansione ECHO a gradiente.

L'angolo di inversione di 19 F sarà identico tranne che per il fattore uno C a causa del profilo proporzionale B, l'attenuazione dell'intensità del segnale di 19 F da una sequenza di eco di spin con l'eccitazione, l'angolo di inversione alfa di rifocalizzazione dell'angolo di inversione due alfa durante la ricezione del segnale è visibile sullo schermo qui. L'attenuazione dovuta all'eccitazione imperfetta si vede qui. Quindi è possibile calcolare l'attenuazione complessiva.

Si noti che è normalizzato a uno in caso di perfetto angolo di inversione di rimessa a fuoco di 90 gradi, 180 gradi di eccitazione, quello B corretto 19 F intensità del segnale dell'immagine SI 19 F corretto vengono calcolati tramite questa formula per creare immagini sovrapposte a un H e 19 F. Esportare i dati dell'immagine e aprire i file in un programma di elaborazione delle immagini come l'immagine J, applicare le regolazioni dell'immagine se necessario, assicurandosi di mantenere le regolazioni uguali per tutte le immagini. Quindi renderizza le 19 immagini F in falsi colori e poi sovrapponile alle immagini H corrispondenti.

Per localizzare il segnale, selezionare l'immagine di magnitudine 19 F con le celle pertinenti e il riferimento visibile disegnare ROI sulle celle pertinenti, il riferimento e una regione al di fuori del soggetto per il valore del rumore come mostrato nel campione. Si noti che qui viene mostrata la scansione anatomica di un H per chiarezza. La semplice proporzionalità e il valore di 19 F per cella possono quindi essere utilizzati per stimare il numero di celle nel ROI.

Queste immagini provengono dai risultati tipici di un protocollo che prevede il trasferimento di 19 cellule marcate con F che si dirigono verso un linfonodo drenante. Qui vediamo uno spettro di 19 FNMR di 1 milione di cellule marcate utilizzando un riferimento TFA A, e qui vediamo un'immagine elaborata rappresentativa per l'imaging in vivo. Un riferimento costituito da un contenitore sigillato della stessa etichetta utilizzata per le cellule è stato posto tra i piedi del topo.

Applicando il protocollo descritto, abbiamo calcolato un numero di celle di circa 1,2 milioni sulla base dell'immagine grezza di magnitudine 19 F. L'immagine 19 F è sovrapposta in falsi colori all'immagine anatomica del protone in scala di grigi. Quando si imposta un nuovo esperimento, è importante convalidare il fluoro.

Risultati della risonanza magnetica con istologia, imaging ottico o altri metodi. Ad esempio, è importante notare che l'etichetta del fluoro può rimanere nei tessuti quando le cellule muoiono e portare a un segnale falso positivo.