In vitro per valutare l'impatto di immunoregolatorio Pathways su HIV-specifica CD4 T effettrici delle cellule di funzione

L'obiettivo generale di questa procedura è analizzare la secrezione di citochine, la trascrizione e l'impatto morfologico delle cellule T stimolate. In primo luogo, utilizzare un gradiente di chiamata FI per isolare le otto cellule mononucleate del sangue impoverite del CD periferiche dagli individui infetti da HIV incubano le cellule con il controllo dell'isotipo o con l'anticorpo bloccante di interesse. Quindi stimolare le cellule con l'antigene di interesse.

Successivamente, centrifugare le colture cellulari per raccogliere surnatanti per le misurazioni delle citochine e pellet cellulari per l'analisi fenotipica o l'analisi trascrizionale, se lo si desidera. Adattare questo protocollo per includere lo smistamento dei singoli tipi di cellule mediante citometria a flusso Risultati sulla secrezione di citochine. L'analisi fenotipica o trascrizionale può mostrare l'impatto del blocco anticorpale delle vie inibitorie sul ripristino della funzione effettrice delle quattro cellule T CD specifiche per l'HIV.

Questo test in vitro può essere efficacemente utilizzato per quantificare i livelli di citochine ripristinati dal blocco delle vie inibitorie, per studiare un ampio pannello di molecole effettrici e anche per valutare l'impatto delle citochine prodotte dalle cellule C specifiche per l'HIV per le cellule T su altri sottogruppi cellulari. Megan Hart, un tecnico di ricerca del nostro laboratorio, dimostrerà ora questa procedura, esaurire le otto cellule T positive CD aggiungendo il cocktail di deplezione CD umano a 50 microlitri per millilitro di sangue intero, mescolare bene e incubare per 20 minuti. A temperatura ambiente, mescolare il sangue intero con il tampone di matassa.

Ora sovrapporre con cura il sangue sull'impacco histo, quindi centrifugare il gradiente a 540 RCF per 30 minuti. Raccogliere lo strato di cellule mononucleate del sangue periferico. Trasferire le celle in un nuovo tubo conico da 50 millilitri e lavare due volte con 45 millilitri di RPMI 1640 completo.

Risospendere le celle lavate in RPMI 1640 completo. Quindi aliquotare 500 microlitri di sospensione cellulare per tubo fax. A seconda del percorso studiato, aggiungere gli anticorpi bloccanti.

Aggiungere anche i controlli isotipici alle provette appropriate. Incubare le cellule per 15 minuti nell'incubatore per colture cellulari. Successivamente, stimola le cellule con un pool di peptidi gag per l'HIV

Includi anche un controllo di assenza di stimolazione per ogni condizione di blocco. Continuare a coltivare le cellule per 48 ore. Pellettare le celle per centrifugazione senza disturbare il pellet.

Trasferire due volte 225 microlitri di surnatante in provette EOR per gli array di velocità luminex per inattivare il virus a 25 microlitri di interpolazione PBS allo 0,5%. Quindi misurare le concentrazioni di citochine desiderate utilizzando il kit Millipore luminex secondo il protocollo del produttore. Dopo aver lavato le cellule in tre millilitri di PBS colorare per la vitalità, quindi risospendere le cellule in 100 microlitri di PBS contenente l'1% di FBS se si colorano monociti o altre cellule presentanti antigene a 1,4 microlitri di vortice di reagente bloccante FCR per mescolare e incubare per 10 minuti a quattro gradi Celsius.

Quindi, aggiungere il vortice di anticorpi di superficie e incubare per 20 minuti a quattro gradi Celsius al buio. Dopo un lavaggio a 200 microlitri di para formaldeide al 4% e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti al buio. Dopo un lavaggio, sospendiamo le cellule in 250 microlitri di FBS all'1% per l'analisi su un citometro a flusso multilaser per lici quantitativi R-T-P-C-R le cellule in 300 microlitri di tampone kyogen, RLT contenente l'RNA isolato di etanolo cheto Beamer all'1%, utilizzando un kit di isolamento dell'RNA seguendo il protocollo del produttore.

Ora sintetizza il CD NA dall'RNA utilizzando un kit di sintesi CD NA e seguendo il protocollo del produttore. Quindi, crea una miscela di primer per ogni primer, inclusi i geni di pulizia, aggiungendo primer all'acqua priva di nucleasi e mantieni sul ghiaccio. Per ogni master mix di amplificazione, aggiungere 10,5 microlitri di acqua priva di nucleasi, 12,5 microlitri di cyber green e un microlitro di primer mix per piastra.

Bene, ora pipetta 24 microlitri di master mix in ogni reazione. Beh, aggiungi anche un microlitro di CD NA a ciascuno, bene secondo il modello. Tappare i pozzetti e centrifugare la piastra per tre minuti a 1500 RCF.

Quindi eseguire la piastra su una macchina QRT PCR R per la colorazione della superficie cellulare. Aggiungere le colorazioni felden e monin circa sei ore prima della colorazione intracellulare con citochine. Quindi lavare le cellule con l'1% di FBS in PBS e colorare per le citochine intracellulari utilizzando un kit di soluzione di permeazione di fissazione e un protocollo dopo aver lavato le cellule.

Una volta sospesi i pellet in 250 microlitri di FBS all'1%, eseguiamo i campioni su un citometro a flusso multilaser 16 ore dopo la colorazione di stimolazione per la vitalità utilizzando il kit di colorazione di cellule morte riparabili vive. Secondo il protocollo del produttore, dopo un lavaggio PBS, sospendiamo le cellule in 100 microlitri di FBS all'1% nel vortice di anticorpi di superficie per mescolare e incubare le cellule su ghiaccio al buio per 20 minuti. Lavare le cellule una volta e sospendere le cellule in 500 microlitri di freddo complementato RPMI 1640.

I terreni filtrano quindi le cellule attraverso un tappo del filtro cellulare in un tubo inferiore rotondo di polistirene da cinque millilitri. Segue 200 microlitri di terreno RPMI 1640 complementato per ogni provetta di raccolta. Mantenendo tutte le provette sul ghiaccio durante lo smistamento dal vivo, smistamento dei sottoinsiemi cellulari di interesse su uno strumento situato in una struttura attrezzata per la coltura di materiali a rischio biologico.

Le celle ordinate per il periodo di tempo desiderato. Dopo l'analisi delle analisi luminex e PCR in questo esperimento, la stimolazione di pbmc impoverita CD otto con un pool di peptidi gag HIV V si traduce in un aumento mediano di 800 volte per la produzione di interferone gamma. Il livello di trascritti di interferone gamma è aumentato di dieci volte mediana dopo la stimolazione.

In questo, l'analisi in vitro dei risultati della funzione delle cellule T CD quattro specifici per l'HIV indicano una forte correlazione tra la secrezione proteica dell'interferone gamma e i livelli di mRNA dell'interferone gamma. È interessante notare che la stimolazione da parte del pool di peptidi gag dell'HIV provoca una maggiore secrezione di interferone gamma rispetto agli antigeni batterici del tetano. Ulteriori risultati del tossoide con la secrezione di IL 13 indicano i diversi profili di citochine dell'HIV e le risposte specifiche delle cellule T del CD.

Il blocco della prima via PD generalmente non ha un impatto significativo sulla secrezione di citochine senza alcuna stimolazione antigenica, ma aumenta la secrezione di interferone gamma e IL due. Quando le cellule vengono stimolate con l'HIV, si accumula un peptide gag. Quando le cellule CD 3 sono deplete dal pbmc, non c'è interferone gamma o IL 2 prodotto in risposta alla stimolazione dell'antigene.

Questi dati indicano che la secrezione di interferone gamma e IL 2 è indotta in risposta alla stimolazione specifica delle cellule T CD 4 e dell'antigene specifico per l'HIV. Questo esperimento utilizza il flusso di lavoro dimostrato utilizzando quattro cellule T CD selezionate per esaminare l'impatto del blocco PD 1 sull'interferone gamma e IL due. Un vantaggio chiave di questo metodo è la capacità di valutare come le molecole immunoregolatorie regolano l'interazione delle cellule T CD 4 specifiche per l'HIV con le cellule presentanti l'antigene.

In questo caso, il protocollo è stato adattato per eseguire la colorazione intracellulare delle citochine a 48 ore dopo la stimolazione. I risultati mostrano che i monociti sono la fonte primaria di IL 12 dopo la stimolazione con pool di peptidi gag per l'HIV. Questo approccio sperimentale in vitro consente ai ricercatori nel campo dell'immunologia delle cellule T di esplorare l'impatto dei percorsi immunoregolatori nella regolazione dell'effetto efficace delle cellule Addison specifiche in campioni umani.