Test di suscettibilità agli antibiotici indotti dallo stress su un chip

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di determinare rapidamente la suscettibilità dei batteri agli antibiotici di interesse. Ciò si ottiene immobilizzando prima i batteri in fase logaritmica sul fondo di un canale microfluidico. Nella seconda fase, il terreno contenente l'antibiotico e una colorazione fluorescente morta viva viene quindi spinto attraverso il canale ad alta velocità, stressando i batteri e attivando i loro percorsi biochimici mirati agli antibiotici.

Le immagini di contrasto e fluorescenza della fase successiva vengono raccolte automaticamente ogni due minuti per un'ora per monitorare la vitalità batterica, le percentuali di morte batterica normalizzate vengono calcolate dalle immagini acquisite in ogni momento dell'esperimento. In definitiva, il fenotipo di suscettibilità agli antibiotici dei batteri è determinato da un aumento della percentuale di morte cellulare normalizzata nel tempo. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi di test di suscettibilità fenotipica esistenti come il brodo, la diluizione o la microcoltura, è che il nostro metodo non richiede il monitoraggio della divisione batterica.

Piuttosto, possiamo accedere al loro profilo di suscettibilità direttamente dalla piccola popolazione esistente. Le implicazioni di questa tecnica si estendono verso la diagnosi di infezioni batteriche resistenti poiché il metodo è rapido, può essere facilmente multiplexato e automatizzato Per creare lo strato PDMS, iniziare degassando una miscela viscosa PDMS appena preparata in una camera a vuoto a temperatura ambiente dopo un'ora, utilizzare una bilancia per riempire lo stampo in alluminio con una massa predefinita di miscela PDMS DGA. Versare lentamente il PDMS al centro dello stampo, avendo cura di mantenere lo stampo livellato e gli spilli scoperti.

Polimerizzare il PDMS durante la notte in un forno a 37 gradi Celsius. La mattina successiva, rilasciare la piastra superiore dello stampo e rimuovere con cura il PDMS polimerizzato dallo stampo per assemblare la cella di flusso. Innanzitutto, posizionare la finestra di vetro nella tasca della cella di flusso.

Quindi posare un vetrino rivestito sopra la finestra di vetro all'interno della tasca della cella di flusso con il lato attivo rivolto verso l'alto. Il livello PDMS appena creato con i canali rivolti verso il basso in modo che gli ingressi dei canali si allineino con i fori passanti nella piastra metallica. Spingere delicatamente l'aria fuori tra gli strati, quindi capovolgere il gruppo scorrevole in vetro PDMS in modo che il PDMS sia rivolto verso la finestra di vetro.

Sovrapporre gli ingressi del canale PDMS con i fori passanti nella piastra metallica, quindi posizionare la piastra di pressione sopra e serrare le viti. Ora posizionare la cella di flusso assemblata sotto il microscopio, impostare l'ingrandimento del microscopio su 60 x e preallineare le posizioni del canale per preparare i batteri della fase logaritmica per il caricamento nella cella di flusso mescolato 50 microlitri della colonia batterica di interesse coltivata durante la notte in 50 millilitri di brodo fresco MH due. Incubare per tre ore agitando a 250 giri/min e 37 gradi Celsius dopo la centrifuga di sottocoltura 10 millilitri di coltura per due minuti a 1, 650 volte G e temperatura ambiente.

Quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro di terreno fresco MH two. Quindi, collegare un breve tratto di tubo a una siringa da un millilitro e lavare il tubo con un millilitro di terreno, lasciando una piccola quantità di terreno nel tubo per evitare bolle d'aria durante l'aspirazione della sospensione batterica. Quindi caricare 0,7 millilitri di batteri nella siringa e riempire due canali della cella a flusso con la coltura cellulare batterica.

La trasparenza del canale cambia man mano che viene riempito con i batteri. Quindi incubare la cella a flusso per 45 minuti a 37 gradi Celsius per consentire ai batteri di attaccarsi alla superficie del vetrino. Preparare le soluzioni per l'esperimento.

Per prima cosa, riempire due siringhe da 60 millilitri con la soluzione di controllo appena preparata e due siringhe da 60 millilitri con la soluzione antibiotica appena preparata. Azionare le siringhe per rimuovere eventuali bolle d'aria, quindi collegare il tubo di ingresso spingendo le rispettive soluzioni attraverso l'estremità del tubo. Conservare le soluzioni avvolte in un foglio di alluminio per evitare la degradazione dei reagenti indotta dalla luce.

Ora monta le siringhe con la soluzione sperimentale sulla pompa, una alla volta. Spremere gli stantuffi se necessario per inserirli nella pompa. Bloccare le siringhe in posizione con la traversa di tenuta della siringa.

Impostare la velocità della pompa su un millilitro al minuto e il volume della pompa su 60 millilitri e lavare la pompa fino a quando non si vede un flusso di liquido costante da tutte le siringhe. Ora inizia l'esperimento rimuovendo la cella di flusso dall'incubatore e montandola sul tavolino del microscopio pre malallineato. Quindi, collegare un tubo di ingresso proveniente da una siringa e un tubo di uscita che va a un flacone di scarto a ciascuno dei canali della cella di flusso.

A questo punto, l'esperimento è completamente configurato ed è pronto per iniziare. Impostare il tempo di acquisizione del contrasto di fase su 10 millisecondi e il tempo di acquisizione della fluorescenza su 1600 millisecondi, quindi ottenere immagini a contrasto di fase e a fluorescenza per ogni posizione prima di avviare il flusso. Si prega di notare che prima dell'inizio dell'immagine del flusso, la messa a fuoco sul fondo del canale potrebbe essere impossibile a causa dell'elevata densità di batteri caricati all'interno del canale.

Ora avvia il flusso del liquido. Controllare immediatamente che il microscopio sia focalizzato sul fondo dei canali. Quindi acquisire immagini a contrasto di fase e fluorescenza delle aree target entro il primo minuto di flusso.

Acquisire le immagini ogni due minuti dopo la prima serie di immagini fino a quando non si sono verificati 60 minuti di flusso. Rifocalizzando se necessario per garantire che l'esperimento proceda correttamente, è possibile esaminare i dati acquisiti sul contrasto di fase e sulla fluorescenza. In questo campione di dati, una deformazione suscettibile è stata caricata nei canali uno e due, mentre una deformazione di resistenza è stata caricata nei canali tre e quattro.

Al termine dell'esperimento, eseguire un ciclo di pulizia con applicazione sequenziale di candeggina e acqua. Riempire quattro siringhe da 20 millilitri con 10 millilitri di una soluzione di candeggina al 10% e quattro siringhe da 60 millilitri con acqua. Dopo la bollatura, collegare le siringhe riempite di candeggina alla cella di flusso e impostare la velocità della pompa su un millilitro al minuto e il volume della pompa su tre millilitri.

Far funzionare la pompa per tre minuti, monitorare la pulizia del canale sullo schermo. Dopo tre minuti, sostituire le siringhe di candeggina con siringhe ad acqua e far funzionare per 30 minuti a un millilitro al minuto. Infine, conta il numero di batteri in ogni immagine utilizzando il software di elaborazione delle immagini.

Calcola la percentuale normalizzata di morte delle cellule batteriche in funzione del tempo utilizzando questa formula dove NF è uguale al numero di batteri morti conteggiati nel conteggio dell'immagine a fluorescenza. E NP è uguale al numero totale di batteri determinato dall'immagine a contrasto di fase. Le immagini mostrate qui illustrano la risposta dipendente dal tempo di un ceppo di stafilococco aria suscettibile all'oxacillina all'interno di una cella a flusso microfluidico.

Questi quadranti mostrano le immagini a contrasto di fase acquisite un minuto dopo l'inizio dell'esperimento e a un'ora con le corrispondenti immagini di fluorescenza mostrate qui. Alla fine dell'esperimento si osserva un aumento significativo del numero di batteri fluorescenti, indicando la morte cellulare all'interno del canale e la suscettibilità del ceppo all'antibiotico a causa della non uniformità stocastica dei singoli vetrini rivestiti con resina epossidica. Potrebbe esserci una perdita di cellule batteriche durante l'esperimento sotto stress puro e sostenuto per tenere conto di questa variazione, ogni immagine di fluorescenza di una popolazione di cellule morte viene normalizzata con l'immagine di contrasto di fase co-acquisita che fornisce la popolazione cellulare totale entro un secondo dallo stesso punto temporale.

Questi ingrandimenti dimostrano che l'algoritmo di conteggio è più efficace nel contare con precisione i singoli batteri nelle immagini a fluorescenza rispetto alle immagini a contrasto di fase densamente popolate. La colorazione delle cellule morte fornisce un elevato contrasto di fluorescenza per i singoli batteri morti. Poiché il numero di batteri fluorescenti raramente supera il 5% del numero totale, ogni batterio è molto luminoso rispetto allo sfondo.

Pertanto, i batteri fluorescenti possono essere facilmente contati con un alto grado di precisione. Ad esempio, in questo esperimento dei 5.828 batteri totali rilevati, evidenziati in rosso, 174 sono stati determinati come morti qui. I dati normalizzati MSSA e Mr.RSA per tre diversi esperimenti sono illustrati come previsto per i ceppi resistenti, la morte cellulare normalizzata è di bassa entità inferiore allo 0,5% e non cambia nel corso dell'esperimento.

I ceppi sensibili, tuttavia, mostrano un aumento costante della morte cellulare e un valore più alto superiore all'1% entro la fine dell'esperimento. L'inizio della morte cellulare per i ceppi sensibili varia leggermente tra gli esperimenti, ma di solito avviene tra i 10 e i 30 minuti. Non dimenticare che lavorare con agenti patogeni resistenti agli antibiotici può essere estremamente pericoloso e che durante l'esecuzione di questa procedura è sempre necessario prendere precauzioni come una tecnica settica.

Questa tecnica aprirà la strada ai ricercatori per esplorare il modo in cui i batteri rispondono allo stress e influenzerà lo sviluppo di nuovi strumenti diagnostici rapidi e la scoperta di nuovi farmaci.