Trasformazione e clonazione del lievito

Lievito o Saccharomyces cerevisiae, è un diffuso organismo modello eucariotico semplice utilizzato nello studio della genetica e della biologia cellulare che può dare approfondimenti sui processi cellulari umani. Questo video discute la trasformazione – l’assorbimento di DNA estraneo da parte della cellula di lievito. Introdurrà plasmidi di lievito, come preparare le cellule di lievito per la trasformazione, una procedura di trasformazione passo-passo e fornirà alcune applicazioni di questa tecnica fondamentale.

Prima di parlare della trasformazione del lievito, parliamo prima di un tipo di DNA utilizzato nella trasformazione: il plasmide. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che può supercoil in modo che possa facilmente passare attraverso i pori in una membrana cellulare.

I plasmidi contengono un sito di clonazione multipla o MCS in cui le endonucleasi di restrizione, alias “enzimi di restrizione”, possono tagliare il DNA. Frammenti di DNA di interesse tagliati con gli stessi enzimi possono quindi essere ligati nella MCS. I plasmidi contengono anche un’origine di replicazione o ORI che segnala alla cellula dove dovrebbe iniziare la replicazione. Inoltre, i plasmidi hanno un marcatore selezionabile, che consente alle cellule di lievito che contengono il plasmide di crescere in condizioni ambientali specifiche. I lieviti che non incorporano con successo il plasmide non sopravviveranno nei mezzi contenenti il marcatore selezionabile. I marcatori selezionabili possono codificare per geni che consentono la resistenza ai farmaci o geni che codificano enzimi che consentono a un ceppo di lievito di sintetizzare amminoacidi che altrimenti non potrebbero produrre.

I vettori shuttle sono plasmidi che possono replicarsi in più di una specie ospite. Ad esempio, un plasmide di E. Coli può crescere nel lievito. I plasmidi di lievito possono essere non integranti o integranti, il che significa che il plasmide si combina con il DNA genomico o rimane indipendente.

Esistono cinque diversi tipi generali di plasmidi o vettori che vengono utilizzati nel lievito. I due che vengono utilizzati più spesso nella trasformazione del lievito sono il plasmide episomiale del lievito o YEp e il plasmide centrometico del lievito o YCp . Entrambi questi tipi di vettori contengono una sequenza di replica autonoma o ARS. L’ARS contiene l’origine della replicazione e consente la replicazione extracromosomiale nel lievito.

Esistono diverse procedure che possono essere utilizzate per trasformare il lievito che includono il metodo dello sferoplasto, l’elettroporazione e la trasformazione mediata dall’acetato di litio. Per questo video ci concentreremo sulla procedura di acetato di litio.

In questo metodo di trasformazione i cationi di litio caricati positivamente neutralizzano le cariche sulla membrana cellulare e il DNA plasmidico DNA a singolo filamento – aggiunto alla miscela di trasformazione – si lega alla parete cellulare del lievito e lascia il DNA plasmidico disponibile per l’assorbimento da parte delle cellule di lievito. L’esposizione a un improvviso aumento della temperatura o shock termico crea una differenza di pressione tra l’interno e l’esterno della cellula creando pori che il DNA plasmidico può attraversare. Quando la temperatura è diminuita, la parete cellulare del lievito si riformerà e la trasformazione sarà completa.

Iniziamo con una procedura passo-passo su come preparare il lievito per la trasformazione. Le cellule di lievito devono essere preparate raccogliendo prima una colonia da una piastra di agar e amplificando la colonia in estratto di lievito peptone destrosio medio, abbreviato YPD – un mezzo completo per la crescita del lievito.

Dopo che la colonia è stata prelevata da un piatto e posta in un mezzo YPD, la coltura viene incubata durante la notte a 30 ° C con agitazione su uno shaker o un apparato a rulli, come vedete qui. Le cellule di lievito vengono pellettizzate mediante centrifugazione e il supernante viene rimosso. Le celle pellette vengono risusese con il tampone desiderato o acqua sterile. Queste cellule di lievito preparate competenti saranno utilizzate nella procedura di trasformazione.

Una volta preparate le cellule di lievito, la trasformazione può essere effettuata preparando prima la miscela di trasformazione.

Questa miscela di reagenti dovrebbe includere: acqua distillata sterile; una soluzione di polietilenglicole al 50% o PEG, 1M di acetato di litio, 10 mg/ml di DNA a singolo filamento, DNA plasmidico e cellule di lievito competenti. Le proporzioni esatte di ogni soluzione devono essere calcolate prima di iniziare l’esperimento consultando il protocollo standard del laboratorio per la trasformazione del lievito.

La miscela viene quindi incubata a 30 °C per 30 minuti con agitazione. La soluzione deve essere miscelata, non vorticosa, per garantire che le cellule di lievito non si rompano.

Le celle sono scioccate dal calore dal posizionamento in un bagno d’acqua a 42 °C per 15 minuti seguito dal raffreddamento su ghiaccio per 2 minuti. Le cellule vengono quindi raccolte mediante centrifugazione.

Le cellule vengono riaspense in acqua a doppio distillato e sono placcate su piastre di agar che selezioneranno i trasformanti desiderati. Le piastre di trasformazione vengono quindi incubate a 30 °C per due o quattro giorni fino alla formazione di colonie.

Le procedure di trasformazione dovrebbero sempre includere piastre di controllo positive e negative fino a quando non vengono ottimizzate. Il controllo positivo dovrebbe essere una sospensione di cellule di lievito con DNA plasmidico su una piastra YPD che non contiene alcun marcatore selezionabile. Questo dimostra che le cellule sono sane seguendo la procedura di trasformazione. La piastra di controllo negativa dovrebbe essere una sospensione di cellule di lievito su una piastra di selezione appropriata, come una che contiene antibiotici. La piastra non dovrebbe avere colonie e mostra che non c’è contaminazione.

Ci sono una miriade di applicazioni diverse per la trasformazione del lievito. Un’applicazione del lievito trasformato è quella di utilizzare un sistema ibrido lievito-due per identificare le proteine che interagiscono con la proteina di interesse o la proteina esca. Quando un plasmide da una libreria di partner leganti candidati, o proteine preda, viene trasformato e c’è un’interazione, viene rilasciato un fattore di trascrizione che attiverà un gene reporter, come la beta-galattosidasi. Il gene reporter trasformerà le colonie che hanno un’interazione blu quando si trovano su piastre che contengono X-gal – un substrato per la beta-galadosidasi.

Le delezioni multiple possono essere ingegnerizzate in lievito attraverso una tecnica che utilizza il ciclo sessuale. Le cellule aploidi che contengono un reporter e un locus eliminato vengono combinate in un’unica cellula attraverso un assortimento casuale o una ricombinazione meiotica. I marcatori selezionabili vengono utilizzati per selezionare i lieviti che hanno incorporato con successo le delezioni. In questo caso, la citometria a flusso viene utilizzata per selezionare le cellule che esprimono GFP.

Il lievito può essere trasformato con proteine che sono etichettate in modo fluorescente per visualizzare l’effetto delle mutazioni sulle interazioni proteina-proteina. Questo video-articolo ha utilizzato la microscopia fluorescente per studiare gli effetti di diverse mutazioni sulle interazioni proteina-proteina essenziali per l’endocitosi.

Hai appena visto il video di JoVES sulla trasformazione del lievito. Ora dovresti capire gli aspetti di base di un plasmide, come preparare le cellule di lievito per la trasformazione e come eseguire la procedura di trasformazione. Come sempre, grazie per aver guardato!