S. cerevisiae sono eucarioti unicellulari che sono un organismo modello comunemente usato nella ricerca biologica. Nel corso del loro lavoro, i ricercatori di lieviti si affidano alla tecnica fondamentale di trasformazione (l’assorbimento di DNA estraneo da parte della cellula) per controllare l’espressione genica, indurre delezioni genetiche, esprimere proteine ricombinanti ed etichettare strutture subcellulari.
Questo video fornisce una panoramica di come e perché la trasformazione del lievito viene effettuata in laboratorio. Verranno presentate le importanti caratteristiche dei plasmidi di lievito, insieme alla procedura necessaria per preparare le cellule di lievito a incorporare nuovi plasmidi. La presentazione include anche un protocollo passo-passo per il metodo di trasformazione del lievito con acetato di litio. Infine, verranno forniti esempi delle numerose applicazioni di questa tecnica essenziale.
Lievito o Saccharomyces cerevisiae, è un diffuso organismo modello eucariotico semplice utilizzato nello studio della genetica e della biologia cellulare che può dare approfondimenti sui processi cellulari umani. Questo video discute la trasformazione – l’assorbimento di DNA estraneo da parte della cellula di lievito. Introdurrà plasmidi di lievito, come preparare le cellule di lievito per la trasformazione, una procedura di trasformazione passo-passo e fornirà alcune applicazioni di questa tecnica fondamentale.
Prima di parlare della trasformazione del lievito, parliamo prima di un tipo di DNA utilizzato nella trasformazione: il plasmide. Un plasmide è un DNA piccolo, circolare, a doppio filamento che può supercoil in modo che possa facilmente passare attraverso i pori in una membrana cellulare.
I plasmidi contengono un sito di clonazione multipla o MCS in cui le endonucleasi di restrizione, alias “enzimi di restrizione”, possono tagliare il DNA. Frammenti di DNA di interesse tagliati con gli stessi enzimi possono quindi essere ligati nella MCS. I plasmidi contengono anche un’origine di replicazione o ORI che segnala alla cellula dove dovrebbe iniziare la replicazione. Inoltre, i plasmidi hanno un marcatore selezionabile, che consente alle cellule di lievito che contengono il plasmide di crescere in condizioni ambientali specifiche. I lieviti che non incorporano con successo il plasmide non sopravviveranno nei mezzi contenenti il marcatore selezionabile. I marcatori selezionabili possono codificare per geni che consentono la resistenza ai farmaci o geni che codificano enzimi che consentono a un ceppo di lievito di sintetizzare amminoacidi che altrimenti non potrebbero produrre.
I vettori shuttle sono plasmidi che possono replicarsi in più di una specie ospite. Ad esempio, un plasmide di E. Coli può crescere nel lievito. I plasmidi di lievito possono essere non integranti o integranti, il che significa che il plasmide si combina con il DNA genomico o rimane indipendente.
Esistono cinque diversi tipi generali di plasmidi o vettori che vengono utilizzati nel lievito. I due che vengono utilizzati più spesso nella trasformazione del lievito sono il plasmide episomiale del lievito o YEp e il plasmide centrometico del lievito o YCp . Entrambi questi tipi di vettori contengono una sequenza di replica autonoma o ARS. L’ARS contiene l’origine della replicazione e consente la replicazione extracromosomiale nel lievito.
Esistono diverse procedure che possono essere utilizzate per trasformare il lievito che includono il metodo dello sferoplasto, l’elettroporazione e la trasformazione mediata dall’acetato di litio. Per questo video ci concentreremo sulla procedura di acetato di litio.
In questo metodo di trasformazione i cationi di litio caricati positivamente neutralizzano le cariche sulla membrana cellulare e il DNA plasmidico DNA a singolo filamento – aggiunto alla miscela di trasformazione – si lega alla parete cellulare del lievito e lascia il DNA plasmidico disponibile per l’assorbimento da parte delle cellule di lievito. L’esposizione a un improvviso aumento della temperatura o shock termico crea una differenza di pressione tra l’interno e l’esterno della cellula creando pori che il DNA plasmidico può attraversare. Quando la temperatura è diminuita, la parete cellulare del lievito si riformerà e la trasformazione sarà completa.
Iniziamo con una procedura passo-passo su come preparare il lievito per la trasformazione. Le cellule di lievito devono essere preparate raccogliendo prima una colonia da una piastra di agar e amplificando la colonia in estratto di lievito peptone destrosio medio, abbreviato YPD – un mezzo completo per la crescita del lievito.
Dopo che la colonia è stata prelevata da un piatto e posta in un mezzo YPD, la coltura viene incubata durante la notte a 30 ° C con agitazione su uno shaker o un apparato a rulli, come vedete qui. Le cellule di lievito vengono pellettizzate mediante centrifugazione e il supernante viene rimosso. Le celle pellette vengono risusese con il tampone desiderato o acqua sterile. Queste cellule di lievito preparate competenti saranno utilizzate nella procedura di trasformazione.
Una volta preparate le cellule di lievito, la trasformazione può essere effettuata preparando prima la miscela di trasformazione.
Questa miscela di reagenti dovrebbe includere: acqua distillata sterile; una soluzione di polietilenglicole al 50% o PEG, 1M di acetato di litio, 10 mg/ml di DNA a singolo filamento, DNA plasmidico e cellule di lievito competenti. Le proporzioni esatte di ogni soluzione devono essere calcolate prima di iniziare l’esperimento consultando il protocollo standard del laboratorio per la trasformazione del lievito.
La miscela viene quindi incubata a 30 °C per 30 minuti con agitazione. La soluzione deve essere miscelata, non vorticosa, per garantire che le cellule di lievito non si rompano.
Le celle sono scioccate dal calore dal posizionamento in un bagno d’acqua a 42 °C per 15 minuti seguito dal raffreddamento su ghiaccio per 2 minuti. Le cellule vengono quindi raccolte mediante centrifugazione.
Le cellule vengono riaspense in acqua a doppio distillato e sono placcate su piastre di agar che selezioneranno i trasformanti desiderati. Le piastre di trasformazione vengono quindi incubate a 30 °C per due o quattro giorni fino alla formazione di colonie.
Le procedure di trasformazione dovrebbero sempre includere piastre di controllo positive e negative fino a quando non vengono ottimizzate. Il controllo positivo dovrebbe essere una sospensione di cellule di lievito con DNA plasmidico su una piastra YPD che non contiene alcun marcatore selezionabile. Questo dimostra che le cellule sono sane seguendo la procedura di trasformazione. La piastra di controllo negativa dovrebbe essere una sospensione di cellule di lievito su una piastra di selezione appropriata, come una che contiene antibiotici. La piastra non dovrebbe avere colonie e mostra che non c’è contaminazione.
Ci sono una miriade di applicazioni diverse per la trasformazione del lievito. Un’applicazione del lievito trasformato è quella di utilizzare un sistema ibrido lievito-due per identificare le proteine che interagiscono con la proteina di interesse o la proteina esca. Quando un plasmide da una libreria di partner leganti candidati, o proteine preda, viene trasformato e c’è un’interazione, viene rilasciato un fattore di trascrizione che attiverà un gene reporter, come la beta-galattosidasi. Il gene reporter trasformerà le colonie che hanno un’interazione blu quando si trovano su piastre che contengono X-gal – un substrato per la beta-galadosidasi.
Le delezioni multiple possono essere ingegnerizzate in lievito attraverso una tecnica che utilizza il ciclo sessuale. Le cellule aploidi che contengono un reporter e un locus eliminato vengono combinate in un’unica cellula attraverso un assortimento casuale o una ricombinazione meiotica. I marcatori selezionabili vengono utilizzati per selezionare i lieviti che hanno incorporato con successo le delezioni. In questo caso, la citometria a flusso viene utilizzata per selezionare le cellule che esprimono GFP.
Il lievito può essere trasformato con proteine che sono etichettate in modo fluorescente per visualizzare l’effetto delle mutazioni sulle interazioni proteina-proteina. Questo video-articolo ha utilizzato la microscopia fluorescente per studiare gli effetti di diverse mutazioni sulle interazioni proteina-proteina essenziali per l’endocitosi.
Hai appena visto il video di JoVES sulla trasformazione del lievito. Ora dovresti capire gli aspetti di base di un plasmide, come preparare le cellule di lievito per la trasformazione e come eseguire la procedura di trasformazione. Come sempre, grazie per aver guardato!
Yeast or Saccharomyces cerevisiae, is a widespread simple eukaryotic model organism used in the study of genetics and cell biology that can give insights into human cellular processes. This video discusses transformation – the uptake of foreign DNA by the yeast cell. It will introduce yeast plasmids, how to prepare yeast cells for transformation, a step-by-step transformation procedure, and will provide some applications of this fundamental technique.
Before we talk about the transformation of yeast, let’s first discuss a type of DNA used in transformation: the plasmid. A plasmid is a small, circular, double-stranded DNA that can supercoil so it can easily pass through pores in a cell membrane.
Plasmids contain a multiple cloning site or MCS where restriction endonucleases, AKA “restriction enzymes”, can cut DNA. DNA fragments of interest cut with the same enzymes can then be ligated into the MCS. Plasmids also contain an origin of replication or ORI that signals to the cell where replication should begin. In addition, plasmids have a selectable marker, which allows the yeast cells that contain the plasmid to grow under specific environmental conditions. Yeast that don’t successfully incorporate the plasmid will not survive in media containing the selectable marker. The selectable markers can encode for genes that enable drug-resistance or genes that encode enzymes that enable a yeast strain to synthesize amino acids that they otherwise cannot produce.
Shuttle vectors are plasmids that can replicate in more than one host species. For instance, a plasmid from E. Coli can grow in yeast. Yeast Plasmids can be non-integrating or integrating, mean that the plasmid either combines with the genomic DNA or remains independent.
There are five different general types of plasmids or vectors that are used in yeast. The two that are used most often in the transformation of yeast are the yeast episomal plasmid or YEp and the yeast centrometic plasmid or YCp . Both of these types of vectors contain an autonomous replication sequence or ARS. The ARS contains the origin of replication and allows for extrachromosomal replication in yeast.
There are several different procedures that can be used to transform yeast which include the spheroplast method, electroporation, and lithium acetate-mediated transformation. For this video we will focus on the lithium acetate procedure.
In this transformation method positively-charged lithium cations neutralize charges on the cell membrane and plasmid DNA Single-stranded DNA – added to the transformation mixture – binds to the cell wall of the yeast and leaves the plasmid DNA available for uptake by the yeast cells . The exposure to a sudden increase in temperature, or heat shock creates a pressure difference between the inside and outside of the cell creating pores that plasmid DNA can pass through. When the temperature is decreased, the yeast cell wall will reform and transformation is complete.
Let’s begin with a step-by-step procedure of how to prepare yeast for transformation. Yeast cells must be prepared by first picking a colony from an agar plate and amplifying the colony in yeast extract peptone dextrose medium, abbreviated YPD – a complete medium for yeast growth.
After the colony is picked from a plate and placed into YPD medium, the culture is incubated overnight at 30 °C with agitation on a shaker or roller apparatus, like you see here. The yeast cells are pelleted by centrifugation and the supernant is removed. The pelleted cells are resuspend with the desired buffer or sterile water. These competent prepared yeast cells will be used in the transformation procedure.
Once yeast cells have been prepared, transformation can be carried out by first preparing the transformation mixture.
This reagent mixture should include: sterile distilled water; a solution of 50% polyethylene glycol or PEG, 1M lithium acetate, 10 mg/ml solution of single-stranded DNA, plasmid DNA and competent yeast cells. The exact proportions of each solution should be calculated before beginning the experiment by consulting your laboratory’s standard protocol for yeast transformation.
The mixture is then incubated at 30 °C for 30 minutes with shaking. The solution should be mixed, not vortexed, to ensure the yeast cells do not break apart.
The cells are heat-shocked by placement in a 42 °C water bath for 15 minutes followed by cooling on ice for 2 minutes. The cells are then harvested by centrifugation.
Cells are resuspended in double-distilled water and are plated on agar plates that will select for the desired transformants. Transformation plates are then incubated at 30 °C for two to four days until colonies form.
Transformation procedures should always include positive and negative control plates until they are optimized. The positive control should be a yeast cell suspension with plasmid DNA on a YPD plate that does not contain any selectable marker. This shows that the cells are healthy following the transformation procedure. The negative control plate should be a yeast cell suspension on an appropriate selection plate, such as one that contains antibiotics. The plate should have no colonies and shows that there is no contamination.
There are a myriad of different applications for yeast transformation. One application of transformed yeast is to use a yeast-two hybrid system to identify proteins that interact with your protein of interest, or the bait protein. When a plasmid from a library of candidate binding partners, or prey proteins, are transformed and there is an interaction, a transcription factor is released that will activate a reporter gene, such as Beta-galactosidase. The reporter gene will turn colonies that have an interaction blue when on plates that contain X-gal — a substrate for beta-galadosidase.
Multiple deletions can be engineered into yeast through a technique using sexual cycling. Haploid cells that contain a reporter and deleted locus are combined into one cell through random assortment or meiotic recombination. Selectable markers are used to select for yeast that have successfully incorporated the deletions. In this case, flow cytometry is used to select for cells that express GFP.
Yeast can be transformed with proteins that are fluorescently labeled to view the effect of mutations on protein-protein interactions. This video-article used fluorescent microscopy to study the effects of different mutations on protein-protein interactions essential for endocytosis.
You’ve just watched JoVEs video on yeast transformation. You should now understand the basic aspects of a plasmid, how to prepare yeast cells for transformation and how to perform the transformation procedure. As always, thanks for watching!
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