Name: In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-17T09:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 12 s
Description: Scopri la riprogrammazione in vivo di epatociti adulti verso la pluripotenza mediante iniezione idrodinamica di fattori Yamanaka. Questo metodo sicuro e rapido avanza la ricerca sulla plasticità cellulare.

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Questo lavoro è stato parzialmente supportato dal Consiglio di Ricerca in Ingegneria e Scienze Fisiche (EPSRC, Swindon, Regno Unito) e dai programmi FP-7 della Commissione Europea NANONEUROHOP (PIEF-GA-2010-276051) e ANTICARB (HEALTH-2008-20157). AY è stata supportata da una borsa di dottorato a tempo pieno del Ministero dell'Istruzione (Turchia) e IL riconosce il sostegno parziale del British Council e della Fondazione CAIXA (Spagna). I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'analisi dei dati, nella decisione di pubblicare o nella preparazione del manoscritto.

1. Riprogrammazione in vivo del tessuto epatico mediante somministrazione HTV di pDNA
<ol>
	<li>Consentire ai topi femmina Balb/C, di 6 settimane, di acclimatarsi alla struttura per animali per una settimana prima di eseguire qualsiasi procedura.</li>
	<li>Preparare soluzione fisiologica allo 0,9% in acqua distillata e filtrare con microfiltro da 0,22 μm.</li>
	<li>Preparare una soluzione con 75 μg di pCX-OKS-2A e 75 μg di DNA plasmidico pCX-cMyc in 1,5 ml di soluzione fisiologica allo 0,9% per topo. nota: Il volume totale di iniezione deve essere compreso tra l'8 e il 10% del peso corporeo totale. 
	Nota: prima dell'iniezione, tenere i topi in una camera di riscaldamento a 37 °C fino a quando le vene della coda possono essere facilmente visualizzate e appaiono dilatate.</li>
	<li>Indurre l'anestesia con isoflurano prima (nella camera di riscaldamento) e durante l'iniezione (con una maschera anestetica).</li>
	<li>Somministrare la soluzione di pDNA o il controllo salino con una siringa da 27 G mediante iniezione di HTV. Nota: affinché la trasfezione abbia successo, il volume totale deve essere iniettato in non più di 5-7 secondi.</li>
	<li>Monitorare che gli animali si riprendano correttamente dall'iniezione.</li>
</ol>
2. Perfusione epatica e isolamento degli epattociti primari per studi qRT-PCR
<ol>
	<li>In diversi momenti, tra cui 2, 4, 8, 12 e 24 giorni dopo l'iniezione di HTV, indurre un'anestesia profonda con isoflurano.</li>
	<li>Spruzzare etanolo al 70% sull'addome dell'animale, praticare un'incisione attraverso la pelle sulla linea mediana ventrale con le forbici chirurgiche e sezionare lo strato muscolare addominale per esporre i visceri.</li>
	<li>Tagliare il diaframma per esporre la cavità toracica con le forbici e bloccare la vena cava con una pinza di bloccaggio.</li>
	<li>Spostare i visceri a destra e i lobi del fegato in modo che sia la cava inferiore che la vena porta siano facilmente accessibili.</li>
	<li>Incannulare la vena cava inferiore con un catetere da 22 G e tagliare la vena porta per evitare un eccesso di pressione.</li>
	<li>Iniziare la perfusione con 10 ml di tampone HBSS (privo di Ca2+ e Mg2+, con bicarbonato), preriscaldato a 37 °C. Perfondere lentamente il tampone con una siringa da 10 ml, fino a quando il fegato non sbianca (3 min).</li>
	<li>Continuare la perfusione con il Liver Digest Medium, preriscaldato a 37 °C, a una velocità di flusso di 0,6 ml/min (per 15 min) fino a quando il fegato non diventa gonfio e allentato. nota: Un'eccessiva digestione e perfusione possono danneggiare gli epatociti o le cellule riprogrammate.</li>
	<li>Continuare l'esperimento a 4 °C.</li>
	<li>Rimuovere il fegato con una pinza dopo aver tagliato i legamenti falciformi e coronarici e lavarlo con Hepatocyte Wash Medium, passandolo attraverso un colino cellulare da 100 μm per ottenere una sospensione cellulare.</li>
	<li>Raccogliere la sospensione cellulare in provette da 50 ml e regolare il volume a 15 ml con Hepatocyte Wash Medium.</li>
	<li>Centrifugare la sospensione cellulare a 50 g per 4 minuti. Mantenere la temperatura a 4 °C. Scartare il surnatante (che contiene Kupffer e cellule epiteliali) e risospendere il pellet cellulare (contenente gli epatociti) in 10 ml di terreno di lavaggio per epatociti. nota: Il pellet cellulare deve essere risospeso con molta attenzione, gli epatociti sono cellule molto fragili.</li>
	<li>Ripetere la procedura di centrifugazione per un totale di tre volte e risospendere il pellet finale in 10 ml di terreno di lavaggio per epatociti.</li>
	<li>Stimare il numero di cellule utilizzando un microscopio ottico e un emocitometro.</li>
	<li>Preparare aliquote di 2 x 106 cellule, centrifugare a 300 x g per recuperare tutte le cellule e scartare il surnatante.</li>
	<li>A questo punto, il pellet cellulare può essere congelato e conservato a -20 °C fino a un'ulteriore lavorazione o utilizzato immediatamente per l'estrazione dell'RNA.</li>
</ol>
3. Studio dell'espressione genica di epatociti isolati per la sovraregolazione di geni pluripotenti
<ol>
	<li>Estrarre l'RNA da 2 x 106 cellule con un kit di colonna di rotazione seguendo le istruzioni del fornitore.</li>
	<li>Utilizzare 1 μg di RNA estratto per eseguire la qRT-PCR in due fasi seguendo le istruzioni del fornitore.</li>
	<li>Utilizzare gli epatociti degli animali iniettati con soluzione salina come controllo per correggere l'espressione genica relativa dei marcatori di riprogrammazione, pluripotenza ed epatociti.</li>
</ol>
4. Analisi della citometria a flusso della pluripotenza potenziata a livello proteico
<ol>
	<li>Nei giorni 1 e 4 dopo l'iniezione, eseguire la perfusione epatica e isolare gli epatociti primari come indicato sopra.</li>
	<li>Regolare la densità cellulare a 1 x 107 cellule/ml e preparare aliquote da 100 μl.</li>
	<li>Fissare le cellule con il tampone di fissazione BD Cytofix e permeabilizzare con 1x tampone BD Perm/Wash.</li>
	<li>Incubare le cellule con OCT4-PerCP-Cy5.5 o Nanog-PE anti-topo per 30 minuti.</li>
	<li>Includi controlli negativi e isotipici.</li>
	<li>Analizza le cellule colorate con il citometro a flusso di ricerca ad alte prestazioni CyAn ADP.</li>
</ol>
5. Immunocolorazione delle sezioni epatiche per i marcatori di pluripotenza
<ol>
	<li>Quattro giorni dopo l'iniezione, perfondere il fegato come indicato sopra, ma solo con tampone HBSS per rimuovere il sangue dal tessuto epatico.</li>
	<li>Tagliare un pezzo di tessuto epatico e immergerlo in 2-metilbutano (preraffreddato in azoto liquido) per continuare con la criosezione.</li>
	<li>I tessuti congelati possono essere mantenuti a -80 °C o tagliati direttamente in sezioni di 14 μm di spessore utilizzando un criostato.</li>
	<li>Asciugare le sezioni di tessuto all'aria per 1 ora a temperatura ambiente e post-fissare con metanolo, preraffreddato a -20 °C per 10 minuti. Asciugare all'aria per 15 minuti e quindi lavare le sezioni due volte con PBS (5 minuti ciascuna).</li>
	<li>Incubare le sezioni in tampone bloccante (5% siero di capra-0,1% Triton in PBS pH 7,3) a temperatura ambiente per 1 ora, seguite da due fasi di lavaggio con tampone di lavaggio (1% BSA-0,1% Triton in PBS, pH 7,3).</li>
	<li>Incubare le sezioni di tessuto per una notte a 4 °C con anticorpi primari anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog.</li>
	<li>Il giorno successivo, lavare le sezioni 3 volte (5 minuti ciascuna) con il tampone di lavaggio e incubarle per 1,5 ore a temperatura ambiente con l'anticorpo secondario.</li>
	<li>Lavare le sezioni di fegato con PBS (3x, 5 min ciascuna) e montarle in DAPI e terreno contenente antifade.</li>
	<li>Visualizzare i vetrini al microscopio a epifluorescenza.</li>
</ol>
6. Colorazione con fosfatasi alcalina (ALP) di sezioni di tessuto epatico
<ol>
	<li>Ottenere sezioni di tessuto epatico come descritto in precedenza.</li>
	<li>Riscaldare le sezioni di tessuto a temperatura ambiente per 15 minuti prima di eseguire la colorazione.</li>
	<li>Fissare con paraformaldeide al 4% per 2 minuti. Nota: un tempo di fissazione eccessivo può ridurre l'attività ALP.</li>
	<li>Asciugare le sezioni all'aria per 30 minuti e poi incubare con substrato liquido BCIP/NBT a 37 °C per 30 minuti.</li>
	<li>Lavare i vetrini con acqua distillata e montarli con mezzi di montaggio acquosi.</li>
	<li>Cattura immagini casuali mediante microscopia ottica.</li>
</ol>
7. Quantificazione dei livelli di albumina ed enzimi epatici nel siero per valutare la tossicità epatica
<ol>
	<li>Nei giorni 4, 8, 12 e 120 dopo la trasfezione, raccogliere 300 μl di sangue direttamente dal ventricolo cardiaco.</li>
	<li>Mantenere il sangue sul ghiaccio mentre i diversi campioni vengono raccolti per evitare la coagulazione.</li>
	<li>Una volta che tutti i campioni sono pronti, incubare per 30 minuti a 37 °C fino a quando il sangue non si coagula.</li>
	<li>Centrifugare i campioni a 2.000 x g per 5 minuti.</li>
	<li>Pipettare con cura il siero (nel surnatante) in una nuova provetta Eppendorf e congelare a -80 °C fino al trattamento dei campioni.</li>
	<li>Analizza i livelli sierici di albumina, ALT, AST, ALP e GLDH.</li>
</ol>
8. Ematossilina ed eosina (H&E) e colorazione periodica acido-schiff (PAS) di sezioni epatiche per valutare la tossicità epatica
<ol>
	<li>In diversi momenti, tra cui 2, 4, 8, 12, 24, 50 e 120 giorni dopo l'iniezione di HTV; eseguire la perfusione epatica con tampone HBSS solo come descritto in precedenza.</li>
	<li>Tagliare un pezzo di tessuto epatico e fissarlo con paraformaldeide al 4%.</li>
	<li>Incorporare il tessuto epatico in blocchi di paraffina, sezionare e colorare con colorazione H&E o PAS.</li>
	<li>Cattura immagini casuali mediante microscopia ottica.</li>
</ol>

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<li>Vandenberghe, L. H., Auricchio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Adeno-Associated+Viral+Vectors+For+Retinal+Gene+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Novel Adeno-Associated Viral Vectors For Retinal Gene Therapy.</a> Gene Ther. 19, 162-168 (2012).</li>
<li>Herweijer, H., Wolff, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progress+And+Prospects%3A+Naked+Dna+Gene+Transfer+And+Therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Progress And Prospects: Naked Dna Gene Transfer And Therapy.</a> Gene Ther. 10, 453-458 (2003).</li>
<li>Wolff, J. A., Budker, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Mechanism+Of+Naked+Dna+Uptake+And+Expression%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Genet%22%5BJournal%5D)">The Mechanism Of Naked Dna Uptake And Expression.</a> Adv. Genet. 54, 3-20 (2005).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Questo studio fornisce prove di principio della riprogrammazione cellulare in vivo verso la pluripotenza a seguito dell'efficiente trasferimento e della sovraespressione dei fattori OKSM al fegato di topo adulto. Con l'aiuto di diverse tecniche come la qRT-PCR, la citometria a flusso, l'IHC o l'analisi del siero, il tessuto bersaglio è stato studiato per osservare la riprogrammazione cellulare in vivo . Molto rapidamente dall'induzione della sovraespressione del fattore OKSM nel tessuto, i marcatori di pluripotenza sono stati sovraregolati a livello di mRNA e proteine (entro 48 ore). Durante questi esperimenti, tra il 5 e il 15% delle cellule estratte dal tessuto si sono dimostrate positive a Nanog e Oct3/4. Inoltre, non sono state osservate anomalie strutturali o funzionali nel fegato per 120 giorni. L'espressione di transgeni mediante iniezione di DNA plasmidico in tessuti diversi dal fegato (polmone, milza, rene e cuore) è stata precedentemente riportata, tuttavia i livelli di espressione genica erano almeno 3 ordini di grandezza inferiori a quelli degli epatociti30. I dati di questo studio indicano che la riprogrammazione delle cellule somatiche verso uno stato pluripotente in vivo è sicura, veloce ed efficiente. Alla luce della maggior parte delle attuali metodologie di riprogrammazione cellulare in vitro che generalmente raggiungono la generazione di cellule pluripotenti (iPS) entro 3 settimane con meno dell'1% di efficienza32, la riprogrammazione in vivo alla pluripotenza può offrire alternative molto interessanti. Ipotizziamo che il concetto di riprogrammazione in vivo alla pluripotenza possa essere applicato a vari tipi di cellule somatiche ad alta efficienza (a seconda del vettore utilizzato), tuttavia sarà necessario determinare il livello di pluripotenza funzionale raggiunto nelle cellule riprogrammate in vivo . Inoltre, con lo sviluppo di protocolli e tecnologie migliorate, le cellule riprogrammate in vivo potrebbero potenzialmente essere estratte e utilizzate per scopi di medicina rigenerativa.
Ci sono alcuni passaggi critici da seguire per riprogrammare le cellule somatiche adulte in vivo con alta efficienza. Il raggiungimento di alti livelli di espressione genica nel tessuto bersaglio è un prerequisito. In questo studio questo è stato illustrato utilizzando l'efficiente trasferimento ed espressione del DNA plasmidico agli epatociti mediante iniezione di HTV. I fattori più importanti per l'iniezione di HTV sono il volume, che dovrebbe essere compreso tra l'8-10% del peso corporeo totale dell'animale, e la velocità di iniezione, che deve essere eseguita entro 5-7 secondi. I topi di età inferiore alle 6 settimane non devono essere usati, poiché l'iniezione di HTV può causare più danni ai tessuti nel fegato, che possono influenzare l'efficienza della riprogrammazione cellulare. Il background genetico degli animali non ha avuto alcun impatto nel determinare l'efficienza della riprogrammazione in vivo , poiché abbiamo precedentemente riportato livelli simili di riprogrammazione sia nei topi Balb/C che in quelli TNG-A, quest'ultimo è un ceppo transgenico che trasporta il reporter eGFP inserito nel locus Nanog ed è allevato sul fondo Sv12929.
Ipotizziamo che la riprogrammazione cellulare in vivo a uno stato pluripotente (che dovrà essere determinato) possa essere applicata ad altri tipi di tessuto a condizione che i fattori OKSM siano erogati in modo efficiente alle cellule bersaglio, consentendo alti livelli di espressione genica. Una varietà di vettori di consegna genica non virale e virale è stata studiata in studi preclinici e clinici al fine di colpire diversi tipi di cellule e tessuti33. Ad esempio, per i tessuti neurali o oculari i virus adeno-associati sono stati il vettore preferito per un efficiente trasferimento genico in vivo 34-37, mentre nel tessuto muscolare è stato dimostrato che le iniezioni di DNA plasmidico nudo determinano livelli relativamente elevati di espressione genica38,39. Pertanto, il metodo del vettore di trasferimento genico dovrebbe essere attentamente selezionato in base al tipo di tessuto al fine di ottenere una riprogrammazione cellulare in vivo efficiente e rapida verso uno stato pluripotente.

Le preoccupazioni etiche sull'uso delle cellule staminali embrionali sono state una delle limitazioni nello sviluppo della ricerca sulle cellule staminali. Tuttavia, la scoperta di Yamanaka e colleghi che l'espressione forzata di quattro fattori di trascrizione (vale a dire: Oct3/4, Klf4, Sox2, c-Myc (OKSM)) potrebbe portare alla riprogrammazione in vitro di cellule somatiche in cellule pluripotenti, denominate cellule staminali pluripotenti indotte (iPS), ha aperto nuove opportunità. Il trasferimento genico virale1-5 e6-10 non virale, la traslocazione citoplasmatica delle proteine11,12 e la trasfezione del miRNA13-16 sono tra i vari metodi utilizzati oggi per generare cellule iPS. Tuttavia, tali metodologie di riprogrammazione soffrono di vari problemi che ne limitano la traduzione in clinica, come ad esempio: a) gravi limitazioni nell'efficienza della riprogrammazione cellulare; b) l'uso prevalente di vettori virali; c) protocolli lunghi e a più fasi delle condizioni di coltura; e d) il rischio di tumorigenicità per impianto delle cellule iPS17-20 generate in vitro.
Il trasferimento genico di fattori di trascrizione definiti3-5 da parte dei retrovirus è il metodo più comunemente usato per riprogrammare le cellule somatiche. Tuttavia, contiene i rischi derivanti dalla possibilità di mutagenesi inserzionale, trasduzione stabile ed espressione proto-oncogenica a lungo termine21,22. Sono stati esplorati anche vettori di trasferimento genico non virali come il DNAplasmidico 6,7,23 o la somministrazione di RNA10 mediante liposomi o elettroporazione. Sebbene più sicuri rispetto ai virus, questi vettori offrono un'efficienza di trasduzione e riprogrammazione significativamente limitata24,25 .
Uno dei dogmi centrali di questo campo emergente è che l'impianto in vivo di cellule iPS porterà alla loro differenziazione incontrollata e alla formazione di una massa simile a un tumore (teratoma), composta da vari tessuti provenienti dai tre diversi strati germinali. Pertanto, il concetto di riprogrammazione alla pluripotenza è stato principalmente focalizzato su manipolazioni in vitro di cellule somatiche primarie estratte (più comunemente fibroblasti). Tuttavia, come descritto in precedenza, questo principio soffre di protocolli di coltura cellulare lunghi e complessi, inclusi cicli multipli di trattamento (trasferimento genico, fattori di crescita, antibiotici, antiossidanti) che possono aumentare i rischi di formazione di teratomi o altre forme di tumorigenesi dopo l'impianto delle cellule24-28.
Proponiamo che la riprogrammazione di cellule somatiche adulte in vivo mediante la sovraespressione transitoria dei fattori di trascrizione OKSM non porti alla successiva formazione di teratomi29. Il metodo per raggiungere questo obiettivo dipenderà dal raggiungimento di alti livelli di espressione del fattore di trascrizione all'interno del tessuto bersaglio nel modo più sicuro possibile. In questo studio, abbiamo selezionato una tecnologia di trasferimento genico priva di virus che ha dimostrato di colpire in modo efficiente il fegato al fine di riprogrammare le cellule alla pluripotenza in vivo. Questa tecnologia prevede l'iniezione rapida e rapida di DNA plasmidico30,31 in un grande volume e idrodinamica della vena caudale (HTV). Alti livelli di espressione di geni trasfettati possono essere raggiunti negli epatociti adulti seguendo questo metodo di trasferimento genico non virale. Inoltre, questa tecnologia riduce al minimo i potenziali rischi derivanti dall'uso di vettori virali (ad es. inserimento genomico permanente, mutagenesi inserzionale).

<table><tbody><tr><td>pCX-OKS-2A pDNA</td><td>Addgene</td><td>19771</td><td>Ottenuto da Addgene come pugnalata batterica, produzione di plasmidi eseguita in Plasmid Factory (Germania)</td></tr><tr><td>pCX-cMyc</td><td>Addgene</td><td>19772</td><td>Ottenuto da Addgene come pugnalata batterica, produzione di plasmidi eseguita in Plasmid Factory (Germania)</td></tr><tr><td>0.22 &mu; m filtro</td><td>Milliopore</td><td>SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Abbott</td><td>B505</td><td></td></tr><tr><td>HBSS tampone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H6648</td><td>Ca2+ e Mg2+ libero, con bicarbonato</td></tr><tr><td>Liver Digest Medium</td><td>Gibco</td><td>17703-034</td><td></td></tr><tr><td>Hepatocyte Wash Medium</td><td>Gibco</td><td>17704-024</td><td></td></tr><tr><td>100 & Mu; filtro cellulare m</td><td>BD Biosciences</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Kit Nucleospin RNA II</td><td>Macherey-Nagel</td><td>740955.25</td><td>Kit per l'isolamento dell'RNA da cellule e tessuti</td></tr><tr><td>Kit di sintesi del cDNA iScript</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8890</td><td></td></tr><tr><td>iO SYBR Green Supermix</td><td>Bio-Rad</td><td>170-8880</td><td></td></tr><tr><td>Oct3/4 primer in avanti</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>fornita nei commenti</td><td>TGAGAACCTTCAGGAGATATGCAA</td></tr><tr><td>Oct3/4 primer inverso</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>CTCAATGCTAGTTCGCTTTTTCTCTTC</td></tr><tr><td>Sox2 primer diretto</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>GGTTACCTCTTCCCCCCACTCCAG</td></tr><tr><td>Sox2 primer inverso</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>TCACATGTGCGACGACAGGGGCAG</td></tr><tr><td>C-myc primer in avanti</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>CAGAGGAGGAACGAGGAGCTGAAGCGC</td></tr><tr><td>C-myc primer inverso</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>TTATGCACCAGAGTTTCGAAGCTGTTCG</td></tr><tr><td>Nanog primer in avanti Sequenza</td><td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>CAGAAAAACCAGTGGTTGAAGACTAG</td></tr><tr><td>Nanog primer inverso Sequenza</td><td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>GCAATGGATGCTGGGATACTC</td></tr><tr><td>Ecat1 primer in avanti</td> Sequenza <td>Sigma</td><td> indicato nei commenti</td><td>TGTGGGGCCCTGAAAGGCGAGCTGAGAT</td></tr><tr><td>Ecat1 primer inverso</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>fornita nei commenti</td><td>ATGGGCCGCCATACGACGACGCTCAACT</td></tr><tr><td>Rex1 primer in avanti</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>fornita nei commenti</td><td>ACGAGTGGCAGTTTCTTCTTGGGA</td></tr><tr><td>Rex1 primer inverso</td> Sequenza <td>Sigma</td><td>fornita nei commenti</td><td>TATGACTCACTTCCAGGGGGCACT</td></tr><tr><td>Alb primer in avanti</td><td>Sigma</td><td>sequenza data nei commenti</td><td>GTTCGCTACACCCAGAAAGC</td></tr><tr><td>Alb reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequenza data nei commenti</td><td>CCACACAAGGCAGTCTCTGA</td></tr><tr><td>Aat forward primer</td><td></td><td>Sigma data nei commenti</td><td>CAGAGGAGGCCAAGAAAGTG</td></tr><tr><td>Aat reverse primer</td><td>Sigma</td><td>sequenza data nei commenti</td><td>ATGGACAGTCTGGGGGGAAGTG</td></tr><tr><td>Trf forward primer</td><td>Sigma</td><td>sequenza data nei commenti</td><td>ACCATGTTGTGGTCTCACGA</td></tr><tr><td>Trf reverse primer</td><td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>ACAGAAGGTCCTTGGTGGTG</td></tr><tr><td>B actina primer in avanti Sequenza</td><td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>GACCTCTATGCCAACACAGT</td></tr><tr><td>B actina reverse primer</td><td>Sigma</td><td>data nei commenti</td><td>AGTACTTGCGCTCAGGA</td></tr><tr><td>BD Cytofix fixation buffer</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td>560585</tr><tr><td>1x BD Perm/Wash buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo OCT4-PerCP-Cy5.5</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>anti-topo Nanog-PE</td><td>BD Biosciences</td><td>560585</td><td></td></tr><tr><td>2-Methylbutane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M32631</td><td></td></tr><tr><td>X100-Triton</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Siero di capra</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9023</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A2153</td><td></td></tr><tr><td>coniglio pAb anti-OCT4</td><td>Abcam</td><td>ab19857</td><td>Utilizzare ad una concentrazione di 3 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>coniglio pAb anti-SOX2</td><td>Abcam</td><td>ab97959</td><td>Utilizzare ad una concentrazione di 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>coniglio pAb anti-Nanog</td><td>Abcam</td><td>ab80892</td><td>Utilizzare ad una concentrazione di 1 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>mAb di topo anti-SSEA1</td><td>Abcam</td><td>ab16285</td><td>Utilizzare ad una concentrazione di 20 &mu; g/ml</td></tr><tr><td>di capra pAb anti-coniglio IgG marcato con Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>111-165-003-JIR</td><td>Utilizzare a una concentrazione di 1/250</td></tr><tr><td>di pAb di capra anti-IgG di topo marcato con Cy3</td><td>Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc.</td><td>115-165-003-JIR</td><td>Utilizzare a una concentrazione di 1/250</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VECTASHIELD con DAPI</td><td>Vector Laboratories</td> Sistema di substrato liquido <td>H-1200</td><td></td></tr><tr><td>BCIP/NBT</td><td>Sigma</td><td>B1911</td><td></td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio acquoso</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>16% Paraformaldeide</td><td>Fisher</td><td>AA433689M</td><td>La soluzione madre è al 16%, utilizzarla al 4%</td></tr> di <tr><td>ematossilina e eosin</td><td>Sigma</td><td>GH53/HT110216</td><td></td></tr><tr><td>colorazione PAS</td><td>Sigma</td><td>395B</td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori yamanaka

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Le cellule staminali pluripotenti indotte (iPS) che derivano dalla riprogrammazione di cellule somatiche in uno stato pluripotente mediante l'espressione forzata di fattori definiti stanno offrendo nuove opportunità per la medicina rigenerativa. Tali applicazioni cliniche delle cellule iPS sono state finora limitate, principalmente a causa della scarsa efficienza delle metodologie di riprogrammazione esistenti e del rischio delle cellule iPS generate di formare tumori dopo l'impianto.
Abbiamo ipotizzato che la riprogrammazione delle cellule somatiche verso la pluripotenza potrebbe essere ottenuta in vivo mediante il trasferimento genico di fattori di riprogrammazione. Al fine di riprogrammare in modo efficiente le cellule in vivo, è necessario che alti livelli dei fattori di trascrizione Yamanaka (OKSM) siano espressi nel tessuto bersaglio. Ciò può essere ottenuto utilizzando diversi vettori genici virali o non virali a seconda del tessuto bersaglio. In questo particolare studio, l'iniezione idrodinamica di DNA plasmidico della vena di coda (HTV) è stata utilizzata per fornire i fattori OKSM agli epatociti di topo. Ciò ha fornito la prova della riprogrammazione in vivo di cellule somatiche adulte verso uno stato pluripotente con alta efficienza e cinetica veloce. Inoltre, non è stata osservata alcuna formazione di tumore o teratoma in situ.
Si può concludere che la riprogrammazione delle cellule somatiche in vivo può offrire un potenziale approccio per indurre una maggiore pluripotenza in modo rapido, efficiente e sicuro rispetto ai protocolli eseguiti in vitro e può essere applicata a diversi tipi di tessuto in futuro.

Figura 1 mostra una panoramica della procedura che prevede il trasferimento genico di plasmidi codificanti OKSM nel fegato di topi e le diverse tecniche eseguite per osservare la riprogrammazione cellulare in vivo. Dopo l'iniezione HTV dei plasmidi, è stato osservato un significativo aumento dell'espressione genica dei fattori di riprogrammazione trasfettati (Oct3/4, Sox2, Klf4 e cMyc) a livello di mRNA al secondo giorno dall'iniezione. L'espressione di questi fattori diminuisce nel tempo dopo l'iniezione, come mostrato nella Figura 2a. Per quanto riguarda l'espressione dei marcatori endogeni di pluripotenza (Nanog, Ecat1 e Rex1), i loro livelli sono risultati significativamente aumentati rispetto a quelli dei epatociti di animali iniettati con soluzione salina al secondo e quarto giorno dall'iniezione, tornando ai livelli di base a partire dall'ottavo giorno (Figura 2b). Allo stesso tempo, la dedifferenziazione della popolazione di epatociti è stata confermata dalla riduzione dell'espressione di geni specifici degli epatociti (Alb, Aat e Trf), riduzione statisticamente significativa al quarto giorno e tornata ai livelli di base a partire dall'ottavo giorno (Figura 2d).
L'espressione di Oct3/4 e Nanog a livello proteico è stata analizzata mediante citometria a flusso. Come mostrato nella Figura 2c, solo Oct3/4 è espresso al giorno 1 dopo l'iniezione di HTV, mentre per l'espressione del marcatore endogeno di pluripotenza Nanog è stato necessario attendere fino al giorno 4.
La ricomparsa di una riprogrammazione cellulare in vivo è stata ulteriormente confermata mediante analisi immunohistochimica di tessuti epatici con anticorpi anti-OCT4, anti-SOX2 e anti-Nanog e mediante colorazione specifica per l'attività della fosfatasi alcalina (ALP). Cellule positive per tutti i marcatori e per l'attività enzimatica vengono ritrovate in modo riproducibile nei tessuti epatici di animali trattati con OKSM, ma non nei controlli trattati con soluzione salina (Figura 3).
Gli eventuali effetti collaterali tossici e la formazione di teratomi a seguito della riprogrammazione cellulare in vivo mediante iniezione endovenosa di pDNA sono stati valutati quantificando i livelli degli enzimi epatici nel siero, nonché mediante colorazione con ematossilina-eosina (H&amp;E) e colorazione PAS su sezioni di tessuto epatico nel periodo di 120 giorni. Sono stati osservati segni transitori e non gravi di danno tissutale fino al giorno 2, ma non oltre. Non è stata osservata formazione di teratomi né alcun segno di displasia o alterazioni morfologiche durante tutto il periodo di studio (Figura 4). Non si sono verificate anomalie strutturali o funzionali epatiche nel corso dello studio in nessuno degli animali, come confermato dai livelli di albumina e degli enzimi epatici e dalla colorazione del glicogeno nelle sezioni di tessuto (Figure 4b e c).
<img alt="Iniezione di fattori di riprogrammazione in vivo, diagramma del topo, plasmide, analisi del tessuto, PCR, citometria." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Panoramica schematica della procedura di riprogrammazione in vivo e della sua analisi. Il protocollo comprende due fasi principali: (i) somministrazione in vivo di fattori di riprogrammazione e (ii) estrazione del tessuto e analisi del campione. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig1large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Analisi dell'espressione genica; grafici a barre con dati di espressione relativa nel tempo; figure da a a d; risultati scientifici." fo:content-width="6.5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Sovraespressione in vivo dei fattori di trascrizione di Yamanaka nel fegato di topo adulto. Topi Balb/C sono stati iniettati mediante HTV con sola soluzione salina allo 0,9%, oppure con 75 μg di pCX-OKS-2A e 75 μg di pCX-cMyc in soluzione salina allo 0,9%, e a 2, 4, 8, 12, 24 giorni è stata effettuata un’analisi RT-qPCR degli epatociti per determinare l’espressione genica relativa di: (a) fattori di trascrizione trasfettati (OKSM) e (b) marcatori endogeni della pluripotenza; (c) analisi mediante citometria a flusso di cellule positive per OCT3/4 e positive per Nanog; (d) espressione genica relativa dei marcatori degli epatociti determinata mediante RT-qPCR. Tutti i livelli di espressione genica sono stati normalizzati rispetto al gruppo iniettato con soluzione salina tramite HTV. (* p&lt;0,05 indica una differenza statisticamente significativa rispetto ai gruppi iniettati con soluzione salina tramite HTV, ottenuta mediante analisi della varianza e confronto multiplo di Tukey). Figura adattata da Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig2large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Confronto mediante microscopia a fluorescenza immunitaria di OCT4, SOX2, NANOG in cellule trattate con soluzione fisiologica rispetto a cellule trattate con OKSM." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. Riprogrammazione cellulare in vivo su tessuto epatico adulto di topo mediante immunoistochimica. Topi Balb/C sottoposti a iniezione HTV con sola soluzione fisiologica 0,9% oppure con 75 μg di pCX-OKS-2A e 75 μg di pCX-cMyc in soluzione fisiologica 0,9%. Al quarto giorno, i fegati sono stati prelevati e sezioni di tessuto congelato sono state colorate con anticorpi anti-OCT4, anti-SOX2 o anti-Nanog per valutare l'immunoreattività, oppure con BCIP/NBT per determinare l'attività della fosfatasi alcalina nel tessuto (40X). Le barre della scala corrispondono a 100 μm. Figura adattata da Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig3large.jpg" target="_blank"> Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Liver histology, enzyme levels, and albumin in saline vs. OKSM treatment, experiment results." fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50837/50837fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. L'effetto di in vivo riprogrammazione cellulare sulla funzionalità epatica e sull'istopatologia Topi Balb/C inoculati con HTV iniettato 75 μg di pCX-OKS-2A e 75 μg pCX-cMyc in soluzione salina allo 0,9% o soluzione salina allo 0,9% da sola. Nei giorni 2, 4, 8, 12, 50 e 120 sono stati isolati tessuti epatici e sieri e sottoposti a elaborazione per: (a) H&amp;colorazione con E; (b) livelli degli enzimi epatici; (c) livelli di albumina; (d) Colorazione PAS. Le immagini rappresentative sono state acquisite mediante microscopia ottica (10X). Le barre della scala indicano 100 μm. Figura adattata da Yilmazer et al.29 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50837/50837fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.

Questo studio dimostra la riprogrammazione delle cellule somatiche verso la pluripotenza in vivo senza la generazione di teratomi. Abbiamo utilizzato l'iniezione idrodinamica della vena caudale di DNA plasmidico codificante i fattori Yamanka per indurre la riprogrammazione in vivo di epatociti adulti in cellule di maggiore pluripotenza.

In vivo riprogrammazione di età somatiche celle a pluripotenza da iperespressione di fattori Yamanaka

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è quello di indurre e valutare la riprogrammazione delle cellule somatiche verso la pluripotenza nel loro microambiente in vivo. Ciò si ottiene caricando una siringa con DNA plasmidico che codifica per i fattori Yamanaka e iniettandoli idrodinamicamente nella vena caudale di un topo A BC come secondo passo. Gli epatociti primari sono isolati dai tessuti epatici e i livelli di espressione genica e proteica rilevanti sono studiati mediante Q-R-T-P-C-R in tempo reale e citometria a flusso.Successivamente, i tessuti epatici interi vengono sezionati e colorati con diverse tecniche al fine di confermare la riprogrammazione del tessuto e valutare la tossicità della procedura. Si ottengono risultati che mostrano differenze nell'espressione genica e proteica dei marcatori di riprogrammazione, pluripotenza e specifici degli epatociti. Inoltre, la sicurezza dell'approccio è convalidata anche con prove biochimiche e istologiche.Il vantaggio principale della riprogrammazione delle cellule somatiche in vivo è che avviene in modo rapido, efficiente e transitorio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della riprogrammazione. Ad esempio, gli esiti dell'induzione della pluripotenza nell'adulto in vivo.Per iniziare ad anestetizzare, una femmina di topo bulby di sei settimane. Quindi preparare una soluzione di DNA plasmidico ENC codificante i fattori Yamanaka e un controllo salino come descritto nel protocollo di testo allegato Affinché la trasfezione abbia successo, iniettare l'intera dose in non più di cinque-sette secondi in punti temporali predeterminati dopo l'iniezione. Isolare gli epatociti primari esponendo la cavità toracica e perfondendo il fegato con un tampone HBSS preriscaldato e quindi digerire il terreno perfuso a una velocità di flusso di 0,6 litri al minuto per 15 minuti fino a quando il fegato diventa gonfio e allentato.Quindi rimuovere il fegato con una pinza dopo aver tagliato il falor e i legamenti coronarici. Per maggiori dettagli sull'isolamento delle cellule epatiche primarie, vedere i passaggi in questo video aggiuntivo di JoVE. Quindi, lavare il fegato con un terreno di coltura per epatociti passandolo attraverso un colino cellulare da 100 micron.Per ottenere una sospensione cellulare, raccogliere la sospensione cellulare in provette da 50 millilitri e regolare il volume a 15 millilitri con terreno di lavaggio per epatociti. Quindi centrifugare la sospensione cellulare a 50 G per quattro minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il surnatante e sospendere il pellet della cella.In 10 millilitri di terreno di lavaggio degli epatociti, il pellet cellulare deve essere sospeso con cura poiché gli epatociti sono cellule molto fragili. Ripetere la procedura di centrifugazione per un totale di tre volte e sospendere il pellet finale in 10 millilitri di terreno di lavaggio degli epatociti. Quindi stimare il numero di cellule utilizzando un emocitometro e un microscopio ottico per studiare l'espressione genica di epatociti isolati.Iniziare centrifugando due volte da 10 a 600 celle a 300 volte G e scartare lo snat. Quindi estrarre l'RNA dalle cellule con un kit di colonne di rotazione seguendo le istruzioni del fornitore. Successivamente, utilizzare un microgrammo dell'RNA estratto dai gruppi di trattamento e di controllo per eseguire due fasi Q-R-T-P-C-R al fine di cercare cambiamenti nei livelli di riprogrammazione della pluripotenza e dei marcatori epatociti.Per analizzare l'aumentata pluripotenza delle cellule a livello proteico, prendere gli epatociti isolati e regolare la densità delle cellule a una volta 10 per la settima cellula per millilitro. Per la citometria a flusso, preparare aliquote da 100 microlitri della sospensione cellulare e poi fissarle in 100 microlitri di BD cyto. Fissare il tampone di fissazione per 20 minuti a temperatura ambiente dopo la fissazione, pellettare le cellule e risus, sospenderle in 100 microlitri di un tampone di lavaggio per permeazione X BD, incubare per 10 minuti, aggiungere a temperatura ambiente.Successivamente, incubare le cellule con anticorpi primari per i fattori di trascrizione espressi in cellule pluripotenti per 30 minuti. Ciò include sia l'anti-mouse T four per CP SCI 5.5 che l'anti-US Nagpe. Assicurati di includere anche i controlli negativi e isotipici.Quindi analizzare le cellule colorate nel citometro a flusso con i canali CP sci 5.5 e PE quattro giorni dopo l'iniezione della sezione criogenica del DNA plasmidico, il fegato come descritto nel protocollo di testo allegato. Quindi incubare le sezioni fissate con metanolo in un tampone di blocco a temperatura ambiente per un'ora, seguite da due fasi di lavaggio per cinque minuti ciascuna con tampone di lavaggio. Quindi, aggiungere anti T quattro anti calzini due e anticorpi primari anti nag su vetrini separati, assicurandosi di coprire completamente il tessuto epatico.Coprire i campioni per prevenire l'aberrazione e incubare le sezioni durante la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, lavare le sezioni tre volte per cinque minuti ciascuna con tampone di lavaggio. Quindi incubarli per 1,5 ore a temperatura ambiente con i rispettivi anticorpi secondari dopo l'incubazione.Lavare le sezioni di fegato tre volte per cinque minuti ciascuna con PBS. Montali in dappy anti fade medium e proteggili con vetrini coprioggetti. Quindi visualizzare i vetrini con un microscopio a epifluorescenza.Riscaldare le sezioni criogeniche a temperatura ambiente per 15 minuti e fissarle con aldeide paraforme al 4% per due minuti. Quindi asciugare i vetrini all'aria per 30 minuti. Una volta asciutte, incubare le sezioni con substrato liquido B-C-I-P-N-B-T a 37 gradi Celsius per 30 minuti.Durante questo periodo, la soluzione reagirà con la fosfatasi alcalina nel tessuto per formare un precipitato insolubile visibile al microscopio. Dopo 30 minuti, lavare i vetrini con acqua distillata e montarli con un mezzo di montaggio acquoso. Quindi acquisisci immagini utilizzando la microscopia ottica nei giorni 4, 8, 12 e 120.Dopo la trasfezione, raccogliere 300 microlitri di sangue direttamente dal ventricolo cardiaco. Mantieni il sangue sul ghiaccio mentre i diversi campioni vengono raccolti per evitare che si coaguli troppo presto. Una volta raccolti tutti i campioni, incubarli per 30 minuti a 37 gradi Celsius o fino a quando il sangue non si coagula.Quindi centrifugare i campioni a 2000 G per cinque minuti e pipettare con cura il siero in una nuova provetta einor. Quindi analizzare i livelli sierici di albumina e gli enzimi epatici, A-L-T-A-S-T-A-L-P e GLDH utilizzando uno spettrofotometro. Oltre allo screening del sangue per valutare la tossicità epatica, preparare anche sezioni di tessuto incluse in paraffina come descritto nel protocollo di testo allegato.Quindi colorare il tessuto con colorazione H e D o PIS e analizzare le immagini acquisite. Microscopia ottica a seguito di iniezione idrodinamica dei plasmidi nella vena caudale, un aumento significativo dell'espressione genica dei fattori di riprogrammazione trasfettati. T tre, quattro calzini, due e cmic a livello di mRNA sono stati osservati il secondo giorno dopo l'iniezione.L'espressione di questi fattori diminuisce nel tempo dopo l'iniezione. I marcatori di pluripotenza endogena, nano g ECAT one e REX one, sono anche significativamente sovraregolati rispetto a quelli degli epatociti di animali iniettati con soluzione salina il secondo e il quarto giorno dopo l'iniezione e sono tornati ai livelli basali dall'ottavo giorno in poi. Allo stesso tempo, la de-differenziazione della popolazione epatocitaria è stata confermata dalla sottoregolazione dei geni specifici degli epatociti, A-L-B-A-A-T e TRF che erano statisticamente significativi il quarto giorno e hanno raggiunto i livelli basali dall'ottavo giorno in poi.Inoltre, l'espressione di T tre, quattro e nag a livello proteico è stata studiata mediante citometria a flusso, come mostrato qui. Solo OC tre quattro è espresso il primo giorno. Dopo l'iniezione di HTV, mentre per l'espressione del marcatore di pluripotenza endogeno nano G, è stato necessario attendere il quarto giorno.L'insorgenza della riprogrammazione cellulare in vivo è stata ulteriormente confermata dall'analisi immunoistochimica dei tessuti epatici. Cellule positive per tutti i marcatori e l'attività enzimatica si trovano in modo riproducibile nei tessuti epatici di animali iniettati con KSM, ma non nei controlli iniettati con soluzione salina. La colorazione H ed e e PAS mostrano segni transitori ma non gravi di danno tissutale che si è dissipato dopo il secondo giorno.Per il periodo dello studio non è stata osservata alcuna formazione di teratomi o alcun segno di displasia o alterazioni morfologiche. Inoltre, non ci sono state anomalie funzionali epatiche nel corso dello studio per nessuno degli animali, come confermato dai livelli di albumina e degli enzimi epatici mostrati qui. Questo studio fornisce la prova principale della riprogrammazione cellulare in vivo verso la pluripotenza.Questo è accaduto rapidamente, transitivamente ed efficientemente dopo la somministrazione dei fattori Yamanaka. Abbiamo ipotizzato che la riprogrammazione in vivo possa essere ottenuta in altri tessuti diversi dal fegato a condizione che il gene sia adeguato. I vettori epatici sono progettati per trasfettare il tessuto bersaglio.Inoltre, con protocolli e tecnologie migliorate, potrebbe essere possibile estrarre le cellule del programma in vivo da utilizzare per ulteriori studi.

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