Arricchimento ed eliminazione delle cellule staminali embrionali umane mediante rilevamento di antigeni di superficie cellulare utilizzando gli anticorpi monoclonali TG30 e GCTM-2

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di selezionare sottogruppi di cellule staminali embrionali umane in base al legame dell'antigene sulla superficie cellulare dei due anticorpi monoclonali TG 30 e GC TM. Ciò si ottiene dissociando prima le colture di cellule staminali embrionali umane o HESC in sospensioni di singole cellule. Nella seconda fase, gli HESC vengono colorati con gli anticorpi monoclonali, TG 30 e GCTM two.

Infine, le cellule vengono separate mediante smistamento cellulare attivato dalla fluorescenza e riportate in coltura. In definitiva, la capacità di formazione di colonie delle cellule selezionate può essere valutata mediante citometria a flusso e microscopia a contrasto di fase. L'immagine principale di questa tecnica, rispetto ai metodi esistenti come l'osservazione visiva, è che fornisce una misura oggettiva della pluripotenza su base cellula per cellula per un gran numero di cellule, e questo facilita la separazione delle cellule staminali embrionali dalle cellule differenziate.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della pluripotenza, come ad esempio come i cambiamenti nelle condizioni di coltura influenzano quantitativamente diverse cellule staminali embrionali umane e linee di cellule staminali pluripotenti indotte umane. A dimostrare la procedura oggi saranno i ricercatori del mio laboratorio, George Zoe Hun Chi e Bay Wang, a fare una sospensione di una singola cellula Hess, iniziare aspirando il terreno di coltura Hess da due fiasche T 75 contenenti una linea cellulare Hess in coltura. Lavare ogni pallone con 10 millilitri di DPBS e quindi incubare ogni coltura con tre millilitri di soluzione di dissociazione espressa tripla E a 37 gradi Celsius e 5% di CO2.

Dopo cinque minuti, urtare il lato del pallone per rimuovere le cellule e quindi confermare il distacco al microscopio. Quindi, aggiungere 10 millilitri di terreno di coltura a freddo a ciascun pallone utilizzando una pipetta sterile da 10 millilitri. Tritrare delicatamente le cellule dissociate più volte contro la parete del pallone per ottenere una sospensione prevalentemente a cellula singola.

Ora raggruppare le sospensioni di una singola cellula hes attraverso un filtro cellulare da 70 micron in una provetta sterile in polipropilene da 50 millilitri per colorare gli antigeni della superficie delle cellule Hess. In primo luogo, Eloqua ha raccolto circa 100.000 cellule in 150 microlitri di terreno in ciascuna delle sei provette per microcentrifuga di controllo da 1,5 millilitri. Successivamente, incubare le provette di controllo e il campione di selezione rimanente con gli anticorpi primari di interesse in volumi di reazione finali rispettivamente di 200 microlitri e circa nove millilitri in terreni di coltura, compresi i controlli isotipici.

Posizionare i tubi orizzontalmente sul ghiaccio e mescolarli delicatamente per 30 minuti su una piattaforma a dondolo. Dopo aver centrifugato le cellule, scartare il surnatante e quindi lavare il campione di selezione in 20 millilitri di terreno di coltura freddo e i campioni di controllo in 200 microlitri dello stesso. Ora incubare il campione di selezione in un volume finale di 2,5 millilitri con gli anticorpi secondari appropriati in terreni di coltura a freddo e i controlli in un volume finale di 200 microlitri dello stesso aggiungere l'anticorpo PE anti-US CD 90.2 appena preparato alla provetta di controllo appropriata in questo momento.

Ancora una volta, mescolare delicatamente i tubi orizzontalmente sul ghiaccio per 30 minuti su una piattaforma a dondolo. Dopo aver centrifugato le cellule, risospendere nuovamente il campione di selezione in 20 millilitri di terreno di coltura freddo e i controlli in 200 microlitri e lavare le cellule due volte nel terreno. Risospendere il campione di selezione in due o tre millilitri di terreno di coltura a freddo integrato con ioduro di propidio e ciascuno dei controlli, ad eccezione delle cellule non colorate, in 300 microlitri dello stesso.

Quindi filtrare ogni singola sospensione cellulare attraverso un filtro a celle con coperchio da 35 micron accoppiato a provette da cinque millilitri in polistirene a fondo tondo e centrifugare le provette per forzare l'eventuale sospensione cellulare residua sui coperchi del filtro nelle provette. Quindi picchiettare i lati dei tubi per risospendere ogni singola sospensione cellulare e posizionare le cellule sul ghiaccio. Impostare il citometro a flusso per la selezione delle cellule attivate a fluorescenza TG 30 GCTM two, in modo che le sospensioni di cellule di Hess dissociate siano bloccate come cellule singole per eliminare potenziali grumi e doppietti.

Quindi, rimuovere i potenziali detriti con i cancelli di dispersione anteriori e laterali in modo che vengano ordinate solo le celle intatte. Quindi escludere le cellule non vitali in base alla loro espressione di ioduro di propidio. Eliminare i fibroblasti embrionali di topo o le cellule alimentatrici di metanfetamina mediante selezione negativa basata sulla loro espressione di MC 90.2 pe di topo.

Impostare il TG 30 G CTM a due andature negative in base all'autofluorescenza di fondo per le cellule non colorate e anche ai controlli isotipici. La frazione HESC vitale isolata, priva di alimentatori di metanfetamine, può quindi essere infine frazionata in TG 30 negativo, GCT M, due TG 30 negativo, GCT M basso, due TG 30 medio, GC TM medio due GCTM medio e TG 30 alto, due sottopopolazioni alte. Dopo aver impostato il citometro a flusso, aggiungere un millilitro di terreno condizionato con metanfetamina a ciascuna delle due provette a fondo tondo in polistirene da cinque millilitri e posizionarle sul ghiaccio.

Quindi recuperare 400.000 cellule ciascuna dal TG 30 negativo differenziato GC TM due negativi e dal pluripotente TG 30 alto GCTM due sottofrazioni cellulari alte. Dopo aver centrifugato le provette di raccolta, sospendere nuovamente ogni pellet di cella in un millilitro di terreno condizionato MEF pre-equilibrato. Quindi seminare un pallone pre-equilibrato, con un terzo di densità MEF T 75 con l'HESC di ciascuna frazione in terreno condizionato con metanfetamina, incubare le colture cellulari a 37 gradi Celsius al 5% di CO2, rinfrescando il terreno ogni giorno per circa due settimane.

Le colture di TG 30 pluripotente ad alto GCTM a due cellule alte mostrano colonie simili a staminali umane dopo una settimana e raggiungono circa l'80% di fluenza co a 9-11 giorni. Le colture di TG 30 negative GC TM due cellule negative crescono principalmente come un prato di fibroblasti simili a cellule che raggiungono la cofluenza da 11 a 13 giorni. La rilevazione combinata degli antigeni di superficie cellulare TG 30 e GC TM 2 consente la discriminazione di un numero di sottogruppi cellulari allo stadio pluripotente e a vari stadi di differenziazione precoce di HESC, come indicato dalla loro espressione di marcatori di cellule staminali e fattori di trascrizione specifici del lignaggio in accordo con i rapporti precedenti, il TG 30 GC TM due negativi bassi, Le sottofrazioni medie e alte possono essere discriminate all'interno della linea di cellule staminali embrionali umane maschili utilizzate per questo studio qui, le percentuali delle diverse sottopopolazioni gated tipiche di un'analisi di citometria a flusso TG 30 GCTM a due sono mostrate nell'esperimento mostrato qui.

Un numero definito di GCT M TG 30 negativi due cellule negative sono state coltivate consecutivamente dopo lo smistamento per circa due settimane, e poi si è fatto ricorso alla raccolta solo del GCT M 30 TG negativo M due frazione negativa prima della riplaccatura. Ad ogni passaggio, i risultati indicano che il gct negativo TG 30 iniziale M due sottofrazioni negative arricchisce per GCT M negativo TG 30 30 due cellule differenziate negative dopo un confezionamento consecutivo. Una popolazione minore di TG 30 ad alto GCT M a due cellule alte viene rilevata al passaggio iniziale, ma alla fine scompare con l'ulteriore impacchettamento lasciando solo campioni liberi da cellule staminali pluripotenti.

Qui viene mostrata la morfologia tipica del prato differenziato TG 30 negativo, GCT M, due cellule negative dopo 14 giorni. Si noti che le colonie sporadiche simili a HESC osservate dopo 14 giorni si sono mescolate con il TG 30 negativo GC TM due cellule negative che sono molto probabilmente generate dal contaminante TG 30 alto GCT M due cellule alte. Si noti che questo accade solo raramente e nel passaggio iniziale dei fatti basati su precedenti osservazioni con questo test, ci si aspetta che la raccolta e la coltura di TG 30 ad alto GCTM due cellule ad alto contenuto dovrebbero arricchire per le HSC pluripotenti formanti colonie.

Pertanto, in queste colture rappresentative è stato studiato anche il confezionamento consecutivo di TG 30 ad alto GCTM pluripotente due cellule alte dopo lo smistamento mediante citometria a flusso, le cellule sono state smistate via fax utilizzando TG 30 e G CT M due, sostituendo solo il TG 30 ad alto G CTM due cellule alte ad ogni passaggio. In questo modo, è stato osservato che la maggior parte delle cellule si trovava nelle sottofrazioni associate alla pluripotenza, indicando una popolazione arricchita di cellule pluripotenti che mantiene anche una capacità di differenziare e rigenerare una piccola percentuale di TG 30 negativa G CTM due cellule negative. Inoltre, colture consecutive di TG 30 CTM ad alto G due cellule altamente selezionate mostrano un gran numero di colonie HESC simili dopo il passaggio, indicando anche il mantenimento dello stato di pluripotenza.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di calibrare ogni volta il fax prima dell'uso per garantire la riproducibilità dei risultati Seguendo questa procedura. Altri metodi come i microarray, il sequenziamento dell'intero genoma o i teratomi possono essere eseguiti per rispondere a domande come: queste cellule sono veramente pluripotenti dopo il loro sviluppo? Questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo delle cellule staminali pluripotenti indotte per esplorare la sicurezza e la stabilità di queste cellule rispetto alle cellule staminali embrionali umane.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare e colorare con cura colture miste di cellule staminali embrionali umane al fine di arricchire le cellule periet. Non dimenticare che lavorare con le cellule umane può essere estremamente pericoloso e le precauzioni come indossare guanti e lavorare con la classe due con l'armadio di sicurezza dovrebbero essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.