Utilizzo di co-coltura per rilevare chimicamente mediata interspecie Interazioni

L'obiettivo generale del seguente esperimento è identificare le interazioni tra diversi microbi che sono mediate da composti secreti e portano a cambiamenti nell'espressione genica batterica. Ciò si ottiene coltivando un ceppo batterico contenente un reporter trascrizionale fluorescente con microbi ambientali come colonie su piastre di Petri agar. I cerchi arancioni rappresentano le colonie dei microbi ambientali.

Mentre i cerchi blu sono colonie del reporter, la crescita su terreni solidi consente ai metaboliti prodotti da queste colonie di diffondersi attraverso l'agar e attivare l'espressione genica nelle colonie reporter vicine. I potenziali risultati indicati qui con le stelle sono quelle colonie che potrebbero secernere composti che alterano l'espressione genica nel reporter. Questi organismi sono isolati dalle piastre di co-coltura.

Questi potenziali induttori vengono ritestati in uno screening secondario per confermare che erano gli organismi che secernono molecole che alterano l'espressione genica batterica nel reporter. Sebbene questo metodo fornisca informazioni sulle interazioni di formazione del biofilm dei bacillus sottili con gli organismi del suolo, può essere applicato anche ad altri sistemi come le interazioni microbiche che influenzano l'espressione della virulenza nelle specie di stafilococco o pseudomona. In effetti, può teoricamente essere applicato per identificare le interazioni microbiche che alterano l'espressione genica per qualsiasi reporter in qualsiasi microbo geneticamente trattabile Dopo aver generato costrutti reporter fluorescenti per il tuo organismo di scelta, secondo il protocollo di testo, raccogli il terreno rimuovendo i primi 0,5 centimetri di terreno superficiale esposto prima di utilizzare una spatola per raccogliere terreno e tubi conici, Aggiungere lo 0,85% di soluzione salina sterile in un rapporto di 10 millilitri per un grammo di terreno per creare un impasto liquido e agitarlo per un minuto per rimuovere i batteri dalle particelle di terreno.

Dopo aver lasciato depositare l'impasto del terreno per un minuto, trasferire lo strato acquoso superiore in una provetta nuova, diluire il reporter e i campioni di terreno secondo il protocollo di testo e posizionare 50 microlitri di ciascuno al centro delle piastre di vaglio di co-coltura in condizioni che non attivino il costrutto reporter da solo. Prepara anche un campione di terreno da solo e un reporter da solo come controlli. Aggiungere circa 23 millimetri di perle di vetro sterili su ogni piastra e distribuire le cellule tenendo le piastre sul piano di lavoro e scuotendole avanti e indietro.

Mentre si ruota fino a quando il liquido non viene assorbito, capovolgere le piastre e gettare le perle in un becher di scarto contenente etanolo. Dopo aver incubato le piastre di co-coltura utilizzando la fluorescenza e iniziando dalla parte superiore della piastra, muovere lentamente la piastra avanti e indietro attraverso il campo visivo fino ai punti luminosi. Dopo una passata completa, ruotare la piastra di 90 gradi e ripetere il processo.

Quando viene rilevato un punto fluorescente, attivare lentamente l'illuminazione a campo chiaro e determinare se la fluorescenza è associata a una colonia batterica. Isolare organismi putativi induttori, che saranno le colonie non fluorescenti prossimali alle colonie fluorescenti. Posizionali al centro del campo visivo e accessibili con la tua mano dominante, lasciando accesa la lampada fluorescente.

Attiva lentamente Brightfield per identificare in base alla forma e posizionare la colonia fluorescente e gli organismi che inducono l'ambiente circostante Utilizzando una bacchetta di vetro, prendi una punta di caricamento del gel rotonda sterile da 200 microlitri e tienila come una matita. Appoggia il palmo esterno contro il tavolino per stabilizzarlo sulla superficie di lavoro. Quindi posizionare l'altra mano sul lato interno del pollice per stabilizzare lo strumento di prelievo, mantenendo la punta della pipetta sopra la superficie della piastra.

Spostalo nel campo visivo e centralo sopra la colonia che desideri raccogliere. Il suggerimento sarà fuori fuoco. Usando il bordo esterno della mano, ruotare lentamente la punta della pipetta verso il basso verso la colonia da prelevare.

Toccarlo molto leggermente cercando di ridurre al minimo il numero di altre colonie con cui la punta entra in contatto senza ruotare lo strumento di raccolta. Strisciare la punta su una sezione di un piatto nuovo. Dopo aver raccolto le colonie, incubare le piastre secondo le linee guida del test.

Quando le colonie sono visibili, utilizzare uno stereoscopio per determinare se uno o più tipi di organismi stanno crescendo sulla piastra, riavvitare ogni tipo di morfo su una piastra fresca e incubare fino alla crescita. Per verificare se i presunti induttori sono veri induttori, preparare i prati del reporter e i ceppi parentali non fluorescenti. Dopo che le piastre si sono asciugate, usa stuzzicadenti sterili per prelevare le cellule dalle colonie di test.

Applicare su un piatto bianco e poi sui due piatti da prato. In alternativa, sospendi gli organismi putativi induttori in un millilitro di mezzo liquido in un veterinario di plastica sterile e misura l'OD 600 delle sospensioni dopo aver normalizzato l'OD di ciascuna sospensione per arrivare a un OD 600 di 0,5 punti, un microlitro di ciascuna sospensione su ciascuna delle tre piastre. Infine, dopo aver permesso agli organismi di crescere, utilizzare la fluorescenza al microscopio da dissezione per identificare gli organismi putativi che inducono che attivano il ceppo reporter fluorescente, ma non il ceppo di controllo parentale.

Lo schermo qui è stato utilizzato per identificare gli organismi del suolo che secernono composti che alterano l'espressione genica di un componente strutturale della matrice del biofilm in b sottili utilizzando un reporter trascrizionale fluorescente. Idealmente, ogni piastra di co-coltura dovrebbe contenere un rapporto uno a uno tra il reporter e le colonie del suolo che sono singole colonie ravvicinate. Qui illustriamo come avere un alto rapporto di colonie reporter mostrate come cerchi blu rispetto alle colonie del suolo mostrate come cerchi marroni aumenta la fiducia nell'individuare l'organismo che induce effettivamente dalle piastre di co-coltura.

Gli organismi del suolo che inducono secernono composti che attivano il reporter. Più colonie reporter saranno indotte sulla piastra con il rapporto reporter/suolo più alto che facilita l'identificazione dei veri induttori mostrati in rosso da altri putativi induttori indicati dalle stelle. Il contenuto di nutrienti controlla l'entità della formazione delle colonie di crescita, mentre la diluizione dell'inoculo determina se le colonie risultanti sono adeguatamente disperse.

Come si vede in questa co-coltura, l'immagine B produce una matrice di biofilm fluorescente in risposta a numerosi microbi del suolo. Per i terreni che abbiamo esaminato, abbiamo avuto un alto tasso di successo per il reporter a matrice Ptap A YFP. Questo è in contrasto con i nostri risultati non pubblicati da schermi analoghi.

Utilizzando la sporulazione e la competenza dei reporter sono stati identificati pochi o nessun risultato. Pertanto, i tassi di HI per i diversi tipi di cellule sono molto variabili e possono essere difficili da prevedere in anticipo. Qui sono mostrati due esempi di piastre di screening di co-coltura prima e dopo che le potenziali colonie induttrici sono state selezionate per l'isolamento.

Qui sono mostrati i risultati negativi e positivi sia del metodo del cerotto che del metodo spot, con circa il 50% delle colonie esaminate nel nostro screening secondario che sono veri positivi. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi per rispondere a ulteriori domande, ad esempio il sequenziamento del DNA SR 16 s per determinare l'identità filogenetica dell'organismo induttore o l'utilizzo della spettrometria di massa HPLC in NMR per determinare l'identità chimica del composto attivo.