Name: Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-01T15:45:00.000+00:00
Duration: 19 min 32 s
Description: Impara il test di condizionamento della paura contestuale e cued nei topi utilizzando un sistema di analisi video automatizzato. Questo protocollo standardizzato migliora l'affidabilità delle valutazioni comportamentali nella ricerca neuroscientifica.

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Alcuni dei dati qui riportati sono stati ottenuti nel laboratorio del Dr. Jacqueline N. Crawley nella US National Institute of Mental Health e vorremmo ringraziarla per averci permesso di mostrare i dati della carta. Ringraziamo anche Kazuo Nakanishi per il suo aiuto nello sviluppo del programma ImageFZ per l&#39;analisi comportamentale. Questa ricerca è stata sostenuta da Grant-in-Aid per la Ricerca Scientifica (B) (21.300.121), Grant-in-Aid per la ricerca scientifica in settori innovativi (Comprehensive Brain Science Network), dal Ministero della Pubblica Istruzione, Scienza, Sport e Cultura del Giappone , concedere da Neuroinformatica Japan Center (NIJC), e le sovvenzioni da CREST del Giappone Scienza e della Tecnologia Agency (JST).

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</ol>

Confermiamo che non ci siano conflitti noti di interesse associati a questa pubblicazione e non vi è stato alcun significativo supporto finanziario per questo lavoro che potrebbero aver influenzato l&#39;esito.

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è uno dei paradigmi più utilizzati per valutare l&#39;apprendimento e la memoria. Questo test è una forma di condizionamento pavloviano in cui viene effettuata un&#39;associazione tra un contesto e / o uno stimolo condizionato (cue uditivo) e uno stimolo avversivo (footshock elettrico). Dopo anche un solo accoppiamento del contesto / cue uditivo e footshock, i topi mostrano il congelamento di lunga durata di fronte sia con il contesto o la stecca. In questo test, il comportamento di congelamento è utilizzato come un indice di memoria paura. Studi farmacologici e lesioni hanno rivelato che la formazione della memoria, consolidamento e recupero sono regolati da diverse regioni del cervello, come l&#39;amigdala, ippocampo e corteccia prefrontale 3,33-35. Inoltre, studi di genetica molecolare hanno dimostrato il ruolo dei geni e delle molecole coinvolte nell&#39;apprendimento e nella memoria in queste regioni del cervello utilizzando topi geneticamente ingegnerizzati 36 specifici. Pertanto, questo test è simple ed utili per esplorare la base neurobiologica sottostante apprendimento paura e la memoria. In questo articolo film, abbiamo introdotto il nostro protocollo di fornire sperimentatori con informazioni dettagliate per comprendere e facilmente eseguire il test. Comportamento di congelamento è stata quantificata attraverso l&#39;osservazione diretta da parte sperimentatori umani. Un sperimentatore ben addestrato si prevede di produrre risultati stabili affidabili in tutta osservazioni. Tuttavia, questo metodo comporta potenziali problemi, quali differenze nel metodo osservativo, pregiudizi osservatori, e di semplici errori di quantificazione, il che rende difficile confrontare direttamente i risultati di sperimentatori indipendenti e diversi laboratori. Un sistema automatizzato di misura computer basato photobeam-è stato anche utilizzato 26,30-32. Tuttavia, questo sistema presenta anche potenziali problemi nel misurare i comportamenti di congelamento. A causa della disposizione sensoriale, questo sistema potrebbe essere in grado di rilevare piccoli movimenti della testa che typically essere catalogato come &#39;attivo&#39; attraverso l&#39;osservazione umana. Inoltre, tremore durante il congelamento può essere considerato come nonfreezing perché quando un animale si blocca, interruzioni intermittenti del photobeam si osservano in conseguenza di tremore. Come metodo alternativo, automatizzati di immagini e video-analisi dei sistemi sono stati sviluppati 17-20,37,38. Anagnostaras et al. 37 descritte alcuni sistemi con programmi software di analisi delle immagini che hanno una buona validità e ottengono il congelamento ben 17,20,37-38. Tuttavia, la maggior parte di questi sistemi e programmi di analisi devono essere ottenuti da fornitori commerciali e sono in genere costosi. Abbiamo sviluppato il software ImageFZ per l&#39;analisi del comportamento di congelamento, e questo programma è distribuito come un programma di software libero. ImageFZ rileva il mouse come un corpo di pixel (una particella) e discrimina sottile movimento del mouse come &#39;congelamento&#39; o &#39;incongelabile&#39; a seconda della quantità diarea di regioni non sovrapposte tra particelle di ciascuna coppia di immagini consecutive. Come mostrato nei risultati rappresentativi, misurazioni utilizzando il programma ImageFZ siano coerenti ovvero più preciso di quelli ottenuti con altri metodi. Così, il programma ImageFZ misura automaticamente il comportamento osservatori umani giudicano congelamento utilizzando criteri definiti. Inoltre, il programma ImageFZ calcola la distanza percorsa (cm) prima, durante e dopo l&#39;esposizione footshock, facilitando una valutazione della sensibilità shock e analisi del comportamento congelamento. Esistono differenze metodologiche tra laboratori. Queste differenze possono causare difficoltà nel confrontare i dati tra i laboratori e di replicare i risultati in laboratori diversi. Per ottenere dati più stabili e comparabili, è necessario standardizzare il protocollo di prova più possibile. Il sistema di analisi con ImageFZ porta alla automazione delle procedure di prova, che può contribuire allala standardizzazione dei protocolli utilizzati in tutta laboratori. Diverse risposte comportamentali devono essere considerati quando si analizza il comportamento di congelamento. In primo luogo, quando gli animali di fronte a una situazione spaventosa, possono fuggire, invece di congelamento 39. Fuga è una delle risposte di paura, e la sua presenza porterà a sottovalutare la memoria della paura. In secondo luogo, il congelamento può dipendere da un livello di attività generale, e il livello di attività in topi trattati e di controllo deve essere esaminato. Ad esempio, sebbene i topi privi del recettore dell&#39;acetilcolina muscarinici M1 hanno mostrato livelli ridotti di congelamento rispetto ai topi wild-type, diversi test comportamentali hanno indicato che i risultati possono essere attribuiti a loro fenotipo iperattività invece del loro deterioramento della memoria 18. ImageFZ calcola la distanza (cm) percorsa dai soggetti. Sono a disposizione per esaminare se esistono differenze nei livelli di attività generali tra i soggetti ai quali i dati. Se vi è una differenza in gruppola distanza percorsa, un possibile approccio al problema è quella di considerare la distanza percorsa durante la prima 2 min di formazione come l&#39;attività basale e utilizzare un rapporto di soppressione (rapporto di soppressione = (attività durante le prove) / (attività durante basale + attività durante testing)) come un indice secondario di paura 17,40. Infine, una differenza di sensibilità al dolore, inducendo i cambiamenti nella reattività a una scossa elettrica, se presente, può causare variazioni nel comportamento congelamento. ImageFZ calcola anche la distanza percorsa (cm) in dettaglio da 2 sec prima un&#39;esposizione di 2 sec footshock per 2 secondi dopo l&#39;esposizione (per 6 sec), che può essere utilizzato come indice di sensibilità footshock. Sistemi di video-analisi dei sono stati sviluppati per misurare il comportamento congelamento dei albino, nero, agouti, e diluire i topi marroni. ImageFZ utilizza un vassoio pavimento nero e griglie nere di esaminare topi bianchi (vedere Figura 1B). Le griglie nere sono fatte di speci<html> alleato metalli trattati con vernice nera patinata e avere una conducibilità elettrica simile a quella delle reti metalliche noncoated, che sono tipicamente utilizzati per topi neri. ImageFZ analizza anche il comportamento di congelamento in ratti e altri roditori attraverso aggiustamenti dei parametri del programma. Nella versione corrente di ImageFZ, il comportamento del soggetto è registrato con una videocamera dalla parete superiore analizzare congelamento. ImageFZ potrebbe essere utilizzato anche in un set-up in cui le immagini vengono catturate dal lato della camera. Inoltre, il ImageFZ controlla un massimo di 4 apparati. Questa caratteristica consente al ricercatore di esaminare contemporaneamente 4 topi, risparmiando tempo e riducendo le potenziali influenze differenze nel tempo di esecuzione di ciascun soggetto e l&#39;ordine di prova sul comportamento. Così, ImageFZ semplifica la procedura di test e analisi del comportamento di congelamento, e questo programma facilita test con meno lavoro e senza alcuna formazione per gli esperimenti comportamentali. e_content &quot;&gt; In laboratorio Miyakawa, abbiamo valutato più di 110 ceppi di topi geneticamente ingegnerizzati e topi di controllo di tipo selvatico nel timore prova condizionata contestuale e cued utilizzando il sistema di video analisi per chiarire gli effetti di un dato gene di apprendimento e memoria 41-42 Abbiamo ottenuto un grande insieme di dati grezzi per più di 5.000 topi I dati grezzi che è stato utilizzato per gli articoli di ricerca pubblicati 4-16 sono incluse nella &#39;Mouse fenotipo Database&#39; come un database pubblico (URL:.. http: / / www.mouse-phenotype.org/). Il presente articolo film fornisce informazioni dettagliate per quanto riguarda i dettagli della nostra procedura sperimentale e promuove la comprensione della situazione testing.

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è il paradigma comportamentale utilizzato per valutare la paura associativo apprendimento e la memoria nei roditori 1-3. Questo test è stato ampiamente utilizzato per comprendere i meccanismi neurobiologici dell&#39;apprendimento paura e la memoria in transgenici e topi knockout 1,4-16. Comportamento congelamento, che è definita come immobilità completa con l&#39;eccezione di respirazione, è una risposta comune alle situazioni di paura. In questo paradigma comportamentale, dopo che gli animali sono esposti a un abbinamento di un cue uditiva con footshock elettrico, rispondono allo stimolo paura produzione mediante la visualizzazione di un comportamento di congelamento, che viene misurata come indice di apprendimento associativo paura e la memoria. Questo test richiede attrezzature meno elaborato, meno sforzo fisico dallo sperimentatore, e molto meno tempo di formazione per i topi di altri compiti di apprendimento e memoria, ma in genere richiede circa 5-10 min / giorno per il mouse per 2 giorni. Anche se la procedura di test è SImple e richiede poco tempo per eseguire, l&#39;investigatore deve osservare attentamente e misurare il comportamento del mouse, quindi, diversi sistemi di misura automatici sono stati sviluppati per condurre l&#39;analisi comportamentale 17-20. Il nostro sistema di video-analisi, che abbiamo sviluppato con il programma software ImageFZ, ci permette di analizzare agevolmente il comportamento di congelamento e produrre risultati altamente affidabili. Questo articolo fornisce informazioni dettagliate sulla nostra procedura di prova e descrive come utilizzare il programma software ImageFZ.

<table><tbody><tr><td>Programma ImageFZ</td><td>Sviluppato da Tsuyoshi Miyakawa</td><td></td><td>Questo programma è disponibile presso O'Hara & Co., Tokyo, Giappone e può essere scaricato gratuitamente all'indirizzo http://www.mouse-phenotype.org/. Questo software funziona su Windows XP/Vista/7 a 32 bit.</td></tr><tr><td>Camera di condizionamento</td><td>O' Hara & Co., Giappone</td><td>CL-3002L</td><td>Per il mouse.</td></tr><tr><td>Camera di prova O</td><td>' Hara & Co., Giappone</td><td>CLT-3002L</td><td>Per mouse.</td></tr><tr><td>Interfaccia</td><td>O' Hara & Co., Giappone</td><td>CL-1040</td><td>L'interfaccia include un generatore di rumore bianco/tono, che può essere controllato dal programma ImageFZ.</td></tr><tr><td>Generatore di urti strapazzato</td><td>O' Hara & Co., Giappone</td><td>SGA-2040</td><td>Il generatore di urti può essere controllato dal programma ImageFZ.</td></tr><tr><td>Tester per griglia d'urto (amperometro)</td><td>O' Hara & Co., Giappone</td><td>Dispositivo di acquisizione video USB SG-T</td><td></td></tr><tr><td></td><td>XLR8</td><td>USB2IVOSX</td><td></td></tr><tr><td>Splitter di immagini quadruplo</td><td>Wireless Tsukamoto Co., Ltd., Giappone</td><td>400AS</td><td></td></tr><tr><td>Camera insonorizzata</td><td>O ' Hara & Co., Giappone</td><td>CL-4210</td><td></td></tr><tr><td>Freeze Monitor</td><td>San Diego Instruments, Inc., CA, USA</td><td></td><td>16 x 16 photbeam array&nbsp; ( spaziatura 2,5 cm)</td></tr></tbody></table>

contestuali e cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video analizzare in topi

Contextual and Cued Fear Conditioning Test Using a Video Analyzing System in Mice

Il timore di prova di condizionamento contestuale e cued è uno dei test comportamentali che valuta la capacità dei topi di apprendere e ricordare un&#39;associazione tra stimoli ambientali e le esperienze avverse. In questo test, i topi sono posti in una camera di condizionamento e sono dati ritagli di uno stimolo condizionato (un cue uditivo) e uno stimolo incondizionato aversivo (una scossa elettrica). Dopo un tempo di ritardo, i topi sono esposti alla stessa camera di condizionamento e una camera di forma diversa con presentazione del cue uditivo. Congelamento comportamento durante la prova viene misurata come indice di memoria paura. Per analizzare automaticamente il comportamento, abbiamo sviluppato un sistema di analisi video utilizzando il programma software applicativo ImageFZ, che è disponibile come download gratuito presso http://www.mouse-phenotype.org/. Qui, per mostrare i dettagli del nostro protocollo, dimostriamo la nostra procedura per la contestuale e cued paura di test condizionata nei topi C57BL/6J utilizzando il syst ImageFZem. Inoltre, abbiamo validato il protocollo e il sistema video analisi prestazioni confrontando tempo congelamento misurata dal sistema ImageFZ o un sistema di misurazione computer basato photobeam-con quello ottenuto da un osservatore umano. Come mostrato nei risultati rappresentativi, i dati ottenuti da ImageFZ erano simili a quelle analizzate da un osservatore umano, indicando che l&#39;analisi comportamentale utilizzando il sistema ImageFZ è altamente affidabile. Il presente articolo film fornisce informazioni dettagliate in merito alle procedure di prova e promuoverà la comprensione della situazione sperimentale.

Nel test di condizionamento alla paura, sperimentatori umani usati per quantificare il comportamento di congelamento attraverso l&#39;osservazione diretta ad alta intensità di manodopera 26-29, ma i sistemi di misura di computer di recente photobeam-based (ad esempio il sistema di &#39;Fermo Monitor&#39;) e l&#39;immagine-l&#39;analisi sono stati utilizzati automaticamente misurare il comportamento di congelamento 26,30-32. ImageFZ è un sistema immagine-analisi automatizzata, che produce risultati paragonabili a quelli ottenuti attraverso l&#39;osservazione umana, come descritto di seguito. Qui, abbiamo confrontato i risultati di osservazione umana con quelli dell&#39;analisi ImageFZ sotto parametri diversi: &#39;Tasso (frame / sec)&#39; e &#39;congelamento criterio (pixel).&#39; In questo esperimento, cinque topi C57BL/6J maschi (peso corporeo medio ± SD (g), 31,4 ± 3,55; significano le dimensioni del corpo ± SD (pixel), 351,6 ± 62,2) sono stati utilizzati a 15-27 settimane di età. L&#39;osservazione umana è stata effettuata utilizzando un programma evento di registrazione (un programma software Macintosh OS9); un evento premendo il tasto che continuanod per 2 secondi o più quando un topo visualizzato un attacco di nessun movimento è stato considerato &#39;congelamento&#39;. La percentuale di congelamento è stato calcolato ogni 60 sec in ciascuna prova e utilizzata per analisi di correlazione. La percentuale di congelamento ha il 2 osservatori (affidabilità inter, per il condizionamento, r = 0,879; prova per contesto, r = 0,957; per prova cued, r = 0.866, per tutti i casi, r = 0,888) è stata in media per generare un umano segnare. Sono state esaminate le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati attraverso ImageFZ con ogni frame rate (cioè 1, 2, e 4 fps) e quelli ottenuti tramite osservazioni umane. Come illustrato nella figura 4, le percentuali di congelamento calcolati attraverso ImageFZ (1, 2, e 4 fps) erano altamente correlati con il valore medio ottenuto per le misure dei 2 osservatori. In particolare, l&#39;acquisizione di immagini ad un frame rate più elevato non produce sempre la migliore correlazione. L&#39;analisi delle immagini a 1 fps generato risultati simili a quelli ottenuti da osservatori umani in eprova ach. Sono state esaminate le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati attraverso osservazioni umane e utilizzando ImageFZ in ciascuna condizione delle «criterio di congelamento (pixel)» (vale a dire 20, 30, e 40 pixel). Le percentuali di congelamento calcolate utilizzando ImageFZ al &#39;criterio di congelamento (pixel) »del 20, 30 e 40 pixel sono stati, in tutti i casi, altamente correlati con quelli ottenuti tramite osservazioni umane (Figura 5). Come illustrato nella figura 5D, quando il criterio di congelamento è impostato su un valore basso, il movimento sottile di un mouse, considerarsi &#39;congelamento&#39; di osservatori umani, sarebbe considerato &#39;non-congelamento&#39; utilizzando ImageFZ. Viceversa, se il criterio è impostato su un valore alto, il movimento di un mouse, segnato come &#39;non-congelamento&#39; di osservatori umani, sarebbero considerati &#39;congelamento&#39; utilizzando ImageFZ (figure 5C, 5F, e 5I). Così, per ottenere i risultati più affidabili, ogni parametro del programma ImageFZ deve essere calibrato noizione dei dati ottenuti tramite osservazioni umani in ogni ambiente di test. Inoltre, abbiamo confrontato i risultati generati da un osservatore umano, utilizzando un sistema basato photobeam misurazione computer (sistema Fermo Monitor), con quelli ottenuti usando ImageFZ (vedere Figura 6). L&#39;osservatore umano è stato accecato al gruppo di trattamento ed i risultati di ImageFZ punteggio. Per le impostazioni dei parametri del sistema di Fermo Monitor, abbiamo utilizzato tre misure della percentuale di congelamento da un sistema convalidato in precedenza 30. Brevemente, il numero di intervalli di 10 secondi in cui gli animali richiede più di 1 o 2 secondi per attraversare il primo nuovo fascio dell&#39;intervallo (10sec e 1sec 2sec 10sec, rispettivamente) e la latenza tra l&#39;inizio di ogni intervallo di 5 sec e la terza nuova interruzione del fascio all&#39;interno di questo intervallo (Latency3) sono stati misurati. Le percentuali degli intervalli in cui il mouse è stato il congelamento o la percentuale della quantità totale di tempo r, facoltativo per rompere il terzo photobeam sono stati calcolati. Le percentuali di congelamento misurati in ciascun sistema sono illustrati nella Figura 6. I gruppi sono stati confrontati utilizzando due vie misure ripetute ANOVA seguita da t-test (vedere Tabella 1). Le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ (Figura 6B) erano più simili a quelli ottenuto attraverso l&#39;osservazione umana (Figura 6A) rispetto ai dati ottenuti utilizzando un sistema basato photobeam-(Figure 6C-E). Le percentuali di congelamento misurati utilizzando il programma ImageFZ in ciascuna prova sono stati altamente correlati con quelli ottenuto attraverso l&#39;osservazione umana (condizionata, r = 0,947; prova contesto, r = 0.970; cued prova, r = 0,934), mentre le correlazioni tra le percentuali di congelamento misurata utilizzando il sistema di misurazione computer basato photobeam-(1 sec 10sec, 2 sec 10sec, o Latency3) e l&#39;osservatore umano sono stati inferiori (condizionata, r = 0,503, 0,593 e 0,761; contesto test, r = 0,772, 0,819 e 0,912) rispetto alle correlazioni tra le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ e l&#39;osservazione umana (Figure 7A e 7B). Inoltre, la Figura 7 mostra che le differenze tra le percentuali di congelamento ottenuti attraverso l&#39;osservazione umana e utilizzando ImageFZ in ciascun topo sono le più piccole differenze. Questi risultati indicano che le percentuali di congelamento misurati utilizzando ImageFZ erano simili a quelli ottenuti attraverso l&#39;osservazione umana e che ImageFZ è estremamente preciso quando si misura la quantità di congelamento. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig1.jpg" /> Figura 1. Apparecchi per la contestuale e attivati ​​i test di paura condizionata. (A) L&#39;acrilico camera quadrata per il condizionamento e il contesto di prova, ( <strong&gt; B) reti metalliche su un pavimento di plastica bianco per nero, agouti, o diluire i topi marroni (in alto) e griglie di metallo nero elettrificabili su un pavimento di plastica nera per topi bianchi (basso); immagini ingrandite delle griglie sono riportati nel giusto pannello, (C), un generatore di rumore / tono bianco e un generatore di shock, (D) una stanza insonorizzata, e (E) una camera triangolare acrilica con un pavimento piatto per la prova cued. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig2.jpg" /> Figura 2. Rappresentazione schematica del protocollo. (A) Presentazione del contestuale e accodato paura di test condizionata, (B) condizionata, (C) cprova ONTESTO, e (D) cued test. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig3.jpg" /> Figura 3. Analisi di immagine dal programma software ImageFZ. Per ogni coppia di immagini successive, la quantità di area (pixel) attraverso cui il mouse mosso è calcolato ImageFZ. Quando questa zona è al di sotto di una certa soglia (ad esempio 30 pixel), il comportamento è giudicato essere &#39;congelamento&#39;. Quando la quantità di superficie pari o superiore alla soglia, il comportamento è considerato &#39;non-zero&#39;. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Il confronto tra le percentuali di congelamento calcolate da immagini a differenti frame rate utilizzando ImageFZ con quelli misurati attraverso l&#39;osservazione umana. Gli condizionata prove paura sono stati condotti utilizzando topi C57BL/6J maschi (n = 5). Durante le prove, due osservatori ha segnato il comportamento di congelamento. Contemporaneamente, le immagini in diretta sono state catturate a 4 fps utilizzando il programma ImageFZ. I file acquisiti a 4 fps sono stati ridimensionati dopo l&#39;estrazione i fotogrammi corrispondere alle immagini catturate a 1 fps o 2 fps. I valori dei parametri di &#39;Rate (frame / sec)&#39; sono stati fissati per 1, 2 o 4 fps, e le percentuali di congelamento in ogni 60 sec bin sono stati calcolati da file di immagine utilizzando ImageFZ analisi offline. Ogni punto rappresenta una percentuale congelamento di ogni 60 sec-bin. Coefficienti di correlazione di Pearson tra i dati ottenuti dall&#39;osservazione umane e analisi ImageFZ sono stati calcolati.<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. Le percentuali di congelamento calcolate dalle immagini a differenti valori criterio congelamento utilizzando ImageFZ e quelli misurati attraverso osservazioni umani sono stati confrontati. Condizionamento prove paura sono stati condotti utilizzando topi C57BL/6J maschi (n = 5). Durante le prove, due osservatori hanno registrato il comportamento di congelamento, e le immagini in diretta sono state catturate utilizzando il programma ImageFZ. Le percentuali di congelamento di ogni 60 sec bin sono stati calcolati dalle immagini (1 frame / sec) attraverso ImageFZ analisi offline, impostando i valori dei parametri di &quot;criterio di congelamento (pixel) &#39;a 20, 30 o 40 pixel. Ogni punto rappresenta una percentuale congelamento di ogni 60 sec-bin. Correlazione co di Pearsoncoefficienti tra i dati ottenuti dall&#39;osservazione dell&#39;uomo e l&#39;analisi ImageFZ sono stati calcolati in ciascuna prova. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig5highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig6.jpg" /> Figura 6. Le percentuali di congelamento sono stati misurati utilizzando sistemi automatizzati e di osservazione umana in gruppi incondizionati e condizionati di topi maschi C57BL/6J (n = 5, ogni gruppo). (A) l&#39;osservazione umana, (B) ImageFZ, (C) Congelare sistema Monitor 1 (1 sec 10sec), (D) Congelare sistema Monitor 2 (2 sec 10sec) e (E) Congelare sistema Monitor 3 (Latency3). Confronti del Gruppo sono stati effettuati utilizzando due vie misure ripetute ANOVA seguita da t-test (unconditioned vs condizionata gruppo di gruppo, *, p &lt;0.05; †, p &lt;0.01). I dati ottenuti utilizzando ImageFZ erano simili a quelli ottenuto attraverso l&#39;osservazione umana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig6highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <img alt="Figura 7" fo:content-width="4.3in" src="/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" width="420" /> Figura 7. Sono mostrati Correlazione e distribuzione di frequenza delle differenze tra le percentuali di congelamento, misurate utilizzando sistemi automatizzati e l&#39;osservazione umana. (AB) diagrammi a dispersione e coefficienti di correlazione di Pearson tra le percentuali di congelamento ottenuti attraverso sistemi automatizzati e l&#39;osservazione umana. Le percentuali di congelamento, calcolati utilizzando ImageFZ, erano altamente correlati con quelli ottenuti attraverso l&#39;osservazione umana. (CF) occorrenze di meno di un dif 10%ferenza tra le percentuali di congelamento ottenuti da sistemi automatizzati vs osservazione umana fosse più alto quando i dati analizzati utilizzando ImageFZ sono stati confrontati con quelli analizzati attraverso l&#39;osservazione umana. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50871/50871fig7highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere l&#39;immagine ingrandita.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td></td><td> ANOVA </td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td> Condizione </td><td> Tempo </td><td> Condizione x Tempo </td></tr><tr><td> Giorno 1 (condizionata) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Umano </td><td> F (1,8) = 28.53, p = 0,0007 </td><td> F (7,56) = 20,79, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 16.58, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 13.97, p = 0,0057 </td><td> F (7,56) = 21,40, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 11,69, p &lt;0,0001 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 5.16, p = 0,0528 </td><td> F (7,56) = 2.39, p = 0,0329 </td><td> F (7,56) = 0,72, p = 0,6572 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (2sec10sec) </td><td> F (1,8) = 4.07, p = 0,0782 </td><td> F (7,56) = 3.44, p = 0,0039 </td><td> F (7,56) = 1.52, p = 0,1803 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 4.44, p = 0,0682 </td><td> F (7,56) = 9.94, p &lt;0,0001 </td><td> F (7,56) = 4.33, p = 0,0007 </td></tr><tr><td> Day 2 (contesto) </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> Umano </td><td> F (1,8) = 42.94, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 1.91, p = 0,1336 </td><td> F (4,32) = 1.48, p = 0,2302 </td></tr><tr><td> ImageFZ </td><td> F (1,8) = 49.61, p = 0,0001 </td><td> F (4,32) = 2.06, p = 0,1087 </td><td> F (4,32) = 0.83, p = 0,5174 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (1sec10sec) </td><td> F (1,8) = 20.28, p = 0,002 </td><td> F (4,32) = 1.63, p = 0,1918 </td><td> F (4,32) = 0.55, p = 0,6997 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (2sec10sec) </td><td>F (1,8) = 40.20, p = 0,0002 </td><td> F (4,32) = 2.66, p = 0,0504 </td><td> F (4,32) = 1.20, p = 0,3306 </td></tr><tr><td> Fermo Monitor (Latency3) </td><td> F (1,8) = 35.30, p = 0,0003 </td><td> F (4,32) = 2.49, p = 0,0626 </td><td> F (4,32) = 1.09, p = 0,3793 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Confronti delle statistiche.

Questo articolo presenta un protocollo di prova paura condizionata contestuale e cued utilizzando un sistema di video analisi per valutare paura apprendimento e memoria nei topi.

Contestuali e Cued paura condizionata test utilizzando un sistema di video Analizzare in topi

The contextual and cued fear conditioning test is one of the behavioral tests that assesses the ability of mice to learn and remember an association ...

Il test di condizionamento contestuale e acuto alla paura è un test comportamentale ampiamente utilizzato per valutare la capacità di apprendimento di Lawrence. Ricorda le associazioni tra un'esperienza aggressiva e i segnali ambientali. Tuttavia, in questo test ci sono alcune differenze metodologiche tra il luogo di lavoro, che possono comportare la difficoltà di confrontare i dati e di duplicare i risultati.Per ottenere dati più stabili e validi, è importante standardizzare il più possibile il protocollo di test. In questo dimostriamo il protocollo del test sul campo. Il test di funzionamento della paura è un test semplice, sensibile e affidabile per valutare la memoria.Questo test viene spesso utilizzato per comprendere il meccanismo neuro e molecolare e l'apprendimento e la memoria, e anche per valutare la funzione cognitiva di potenziali modelli murini di disturbi psichiatrici come il disturbo post stress e la schizofrenia. Nel test di fronte al comportamento, che viene misurato come indice di apprendimento e memoria viene valutato dall'analisi degli osservatori umani, sono stati utilizzati alcuni sistemi automatizzati per analizzare automaticamente il comportamento di utilizzo. Sviluppiamo un sistema di analisi delle immagini utilizzando un programma software basato su immagini FG e immagini A.Stiamo distribuendo tale programma software e può essere scaricato gratuitamente a questo indirizzo. In questo presentiamo il nostro protocollo di test e il sistema di analisi automatizzato. In primo luogo, mostriamo come proteggere l'operatore dell'app come immagine del programma software.In secondo luogo, dimostriamo i protocolli dettagliati del test, tra cui il test del contesto di condizionamento e il test Q per il dispositivo che utilizza il sistema. Infine, presentiamo i risultati attuali che indicano che il sistema FD con immagine N può produrre risultati altamente affidabili. Ora cominciamo.Inizia velocemente il test di condizionamento della paura. Un topo viene posto in una camera con pavimento di pendenza. L'OID viene presentato come revisore.Coda dell'auditor per 30 secondi. Successivamente, viene fornita una scossa elettrica. Questo abbinamento di una coda dell'auditor e della scossa del piede viene dato tre volte per migliorare l'associazione tra la coda dell'auditor e la scossa del codice elettrico.Durante il test, il comportamento di congelamento viene misurato come indice di apprendimento associato e memoria ingiusta. In secondo luogo, dopo 24 ore, il topo viene inserito nella stessa camera di condizionamento e viene valutato per il comportamento di fuga. Per misurare contestualmente la paura, il topo viene quindi trasferito in G di forma diversa senza alcuna coda uditiva e, successivamente, viene presentata la coda uditiva.In questo test, il comportamento di congelamento viene utilizzato come indice di memoria di paura acuta. Durante il test, il comportamento del mouse viene registrato attraverso una telecamera collegata a un computer. Il comportamento è giudicato come congelamento o non congelamento.Con il programma software di immagine, il programma può calcolare la percentuale di tempo di congelamento e la distanza del traffico. Qui ad esempio, l'analisi dell'immagine viene dimostrata durante il test. Le immagini dal vivo vengono acquisite a una lunghezza al secondo.L'immagine del crea un'immagine binaria da ogni immagine dal vivo per ogni coppia. Con fiamme successive, la quantità di area attraverso la quale il mouse si è mosso viene calcolata dall'immagine del programma. Quando l'area è al di sotto di una certa soglia, il comportamento viene giudicato come congelamento, che viene generalmente definito come una completa assenza di qualsiasi movimento se non per la respirazione e difficile da battere.Il comportamento di blocco che dura meno della soglia di tempo definita non viene considerato blocco. Il valore di soglia deve essere impostato in anticipo in modo da ottenere la migliore corrispondenza tra i tempi di congelamento misurati dall'immagine Z e le osservazioni umane. Quando la quantità di area è uguale alla soglia o a X tre Z, il comportamento è considerato non congelante.Qui dimostriamo il nostro protocollo di test nei topi utilizzando questo sistema di analisi video. In questo protocollo, l'operatore è costruttivo su una griglia quadrata a camera con griglie metalliche e scoperta con un'immagine di piombo trasparente. FD è in grado di distinguere il soggetto scuro da uno sfondo bianco in ogni immagine video acquisita.Ma questo processo ci consente di analizzare il comportamento di congelamento del soggetto che la camera deve essere posizionata su un pavimento bianco per analizzare il comportamento dei topi neri, buoni o neri diretti. Il comportamento di congelamento dei topi in alluminio può anche essere analizzato dall'immagine D utilizzando griglie metalliche nere Secondo una regola nera, le luci a diodi emettitori di luce sono attaccate alla vela sopra l'apparato. La regola della griglia è illuminata su 100 tetti dalle luci a LED.Un altoparlante collegato al generatore di rumore bianco è montato sulla vela sopra il coperchio. Un rumore bianco di 55 viene presentato come una coda uditiva. Le griglie sono collegate a un generatore di scosse elettriche per erogare scosse elettriche.Il test del vento d'urto è fissato a 0,3 milioni di coppie prima dell'inizio del test. L'intensità di corrente sulla griglia deve essere controllata da un metallo perché il test d'urto può essere diminuito da un accumulo di fe e urina nei topi, la camera di prova è posta in un telaio insonorizzato per ridurre al minimo il rumore esterno. Durante la prova, l'appellato si trova in un suono diverso da quello in cui vengono eseguite le prove di cono e di contesto.È composto da una camera che ha proprietà diverse dalla camera di coniatura. Fornendo un contesto normale, è necessario modificare il più possibile i codici sensoriali in modo che il topo percepisca il contesto Nobel come non correlato alla camera di contingenza. In questo protocollo, l'apparecchio è una camera triangolare acri con una regola acri piatta e il piombo trasparente.Un altoparlante è montato sulla vela sopra il piombo per presentare su o tre code. Questa coda è lo stesso segnale che è stato fornito ai topi al momento dell'hawing. Il livello di illuminazione del pavimento è impostato per studiare l'aspetto.Ogni camera è un cubo con una cabina di ricarica montata a vela, una telecamera per monitorare il comportamento del mouse. Prima dell'inizio di ogni test, le pareti e i pavimenti in acrilico vengono puliti con una lingua in modo da immergersi in acqua ad altissima densità e le griglie vengono pulite con etanolo al 70%. Per evitare una distorsione basata sul taglio olfattivo, le griglie vengono pulite con Ethan invece di acqua lorda super hype per ingiuriare che le griglie non deducono la loro conduttività elettrica a causa degli ultimi due o quattro topi, un pacchetto di casa in una stanza di contenimento a temperatura controllata per ridurre i possibili aumenti del trasporto in gabbia sul comportamento e per adattare i topi all'ambiente sperimentale.La gabbia contenente i topi è stata trasferita in una sala d'attesa insonorizzata almeno 30 minuti prima dell'inizio di ogni test. Tutti gli esperimenti devono essere eseguiti durante lo stesso periodo di tempo per ridurre al minimo le variazioni di comportamento che possono essere prodotte dai test in momenti diversi. I topi di ciascun gruppo devono essere testati in un contrappeso per ridurre i potenziali effetti del tempo sperimentale.Nell'ordine di test del soggetto sulle prestazioni comportamentali, l'immagine D può controllare un massimo di quattro apparecchi di test dai topi contemporaneamente mentre il ricercatore per risparmiare tempo e digitale per dedurre i potenziali effetti della procedura sperimentale sul comportamento del topo. Prima dell'inizio della sessione continua, eseguire il software applicativo A FD. Selezionare il menu della spina FD relativo e FD online e impostare i valori dei parametri impostati passo dopo passo come segue.Passaggio uno, l'ID del progetto specifica la cartella in cui si desidera memorizzare la data dei file. Passaggio due, tipo di nome della sessione. Tutte le parole nella casella della sessione sono la data sperimentale e il testo di riferimento da archiviare in cui l'ora di inizio e la durata del rumore bianco e dello shock alimentare sono scritti nella casella di riferimento.Il testo di deferenza su file deve essere preparato nella cartella di deferenza nell'immagine, la cartella in anticipo. Terzo passaggio impostazioni dei parametri. Immettere i valori dei parametri come la durata, il tempo e i criteri di congelamento, come mostrato nel filmato.Passaggio quattro, ID soggetto. Inserisci l'identificazione del soggetto. Passaggio cinque, le impostazioni della fotocamera contrastano la luminosità e il contrasto dell'immagine acquisita.Passaggio sei, impostazioni della soglia. Per prima cosa per misurare la distanza percorsa dalle immagini consecutive, regolare il valore principale di soglia del programma, che è impostato per segmentare le immagini in particelle nere e sfondo bianco. La distanza percorsa viene calcolata tra ogni set con le coordinate XY per il baricentro con la particella nelle immagini consecutive.Secondo a major per il comportamento dalle immagini consecutive, solo assumendo x valore extra del programma che è impostato per segmentare le immagini in particelle nere sotto lo sfondo e quindi calcolare la quantità di area di regioni non sovrapposte tra le particelle di cui viene mostrata la coppia di finestre di assunzione di immagini consecutive la regione non sovrapposta. Modificare il valore espresso sulla quantità di valore della regione deve essere inferiore al valore del grido ING quando il mouse mostra il comportamento. Questi valori devono essere regolati in modo che i dati per affaticamento dell'immagine corrispondano a quelli della squadra umana stessa.Passaggio sette, impostare per catturare il campo ha specificato il campo, quale camera che si desidera catturare dopo aver fatto clic con il pulsante rettangolo nella casella degli strumenti per rettangolare attorno al pavimento di esso. Camera nella finestra dell'immagine dal vivo. Quindi seleziona il romanzo da camera e fai clic sul pulsante di impostazione per infine fare clic sul pulsante Completa.Dopo che le impostazioni dei parametri sono state definite, il test preparatorio dovrebbe essere somministrato utilizzando topi di pratica prima del primo test della data per determinare se il sistema di analisi dell'immagine e quali generatori di shock acustico funzionano con quei problemi spostare la gabbia a pettine contiene i topi di pratica per l'oscurità del test del suono dall'adiacente all'oscurità in attesa e posizionare ogni topo nella camera di condizionamento immediatamente dopo aver posizionato i topi nella camera, fare clic sulla parte inferiore iniziale dell'immagine di Z.I topi possono esplorare completamente la camera per 120 secondi. Successivamente. Un rumore bianco come coda uditiva viene presentato per 30 secondi e durante gli ultimi due secondi del suono, viene dato uno shock alimentare ai topi. Questa procedura viene ripetuta tre volte in seduta per rafforzare l'associazione tra la coda e lo shock alimentare.Le maschere vengono lasciate con la camera per 90 secondi dopo l'ultimo accoppiamento. Stabilire ulteriormente l'associazione tra il contesto della camera e l'esperienza passiva. Dopo 480 secondi, i topi vengono riportati nella gabbia di casa e la gabbia viene riportata sullo scaffale della stanza di attesa.Dopo ogni test, pulire accuratamente le camere e la griglia. Quindi fare clic sul pulsante di analisi successiva e ripetere la sessione nei mouse di prova. Circa 24 ore dopo il preoccupante spostamento della gabbia continua ai topi in una sala d'attesa insonorizzata.La tenuta incombe almeno 30 minuti prima dell'inizio di ogni test. Immagine lunga del e impostare i valori dei parametri del software allo stesso modo del condizionamento. Tuttavia, imposta la durata fino a 300 secondi e seleziona 35 testi da archiviare per il test contestuale.35 Il testo su file è vuoto. Posiziona il mouse nella camera di condizionamento e fai clic sul fondo iniziale. I topi possono esplorare completamente la camera per 300 secondi senza alcuna presentazione di stimoli.Dopo 300 secondi, metti i topi nella loro gabbia domestica e pulisci le camere. Quindi fare clic sul fondo dell'analisi successiva e ripetere la procedura nell'immagine lunga dei mouse di test di D e impostare i valori dei parametri nello stesso modo del testo continuo tuttavia di riferimento per archiviare questo test e impostare il tempo di durata fino a 360 secondi. Questo è un testo di riferimento da archiviare per questo test.Posiziona ogni topo nella camera triangolare e fai clic sul pulsante di avvio dell'immagine Z.I topi devono tutti esplorare la camera nei primi tre minuti. Non vengono presentati né rumore bianco né shock del piede. Questa camera ha diverse proprietà che forniscono un nuovo contesto e sono correlate alla camera continua.In questa camera in genere deve muoversi molto e non mostrare comportamenti. Alla fine dei primi tre minuti, il rumore bianco che viene presentato a Concho viene fornito ai topi per tre minuti. Durante la presentazione dell'auditor, l'auditor mette in coda i topi o mostra un comportamento scritto dopo 360 secondi, riporta i topi nella loro gabbia domestica e riporta la gabbia sullo scaffale della stanza di attesa.Dopo il test, pulire accuratamente le camere. Quindi fare clic sul fondo dell'analisi successiva e ripetere la procedura utilizzando i mouse di prova. Questo video mostra che il passaggio di congelamento analizzato dall'immagine del sistema sembra essere più strettamente correlato al pensiero misurato da un osservatore umano.L'osservazione è stata confermata dai dettagli che hanno mostrato che la percentuale di leasing misurata dal fisico dell'immagine in ciascun test era altamente correlata o punteggio di pensiero dall'osservatore umano. Inoltre, questa cifra dimostra che le differenze tra le percentuali di congelamento misurate dalle osservazioni umane e l'immagine del sistema in essa era la più piccola. Questi risultati hanno indicato che la percentuale di congelamento misurata dall'immagine del sistema era simile a quella ottenuta dall'osservazione umana e che l'accuratezza che misura la quantità di ragione dall'immagine Z è elevata. Ok.Ti è piaciuto? Come vedi dal test, l'analisi comportamentale standard può essere eseguita facilmente. Ci sono alcuni suggerimenti e punti importanti per l'utilizzo dell'immagine del sistema, quindi lascia che chieda a ika a riguardo. Ok.Innanzitutto, come ti sei sentito riguardo alla procedura di test dell'immagine del sistema? Penso che la nostra procedura di test sia molto semplice e l'immagine del sistema sia uno strumento utile per misurare la ragione, il comportamento in modo accurato e rapido. Chiunque può facilmente utilizzare un programma software con una formazione precedente Di conseguenza, questo sistema può essere utilizzato per valutare la propria memoria in molti mesi in breve tempo, il che ci farà risparmiare tempo e in seguito.Capisco. Allora c'è qualcosa a cui dovremmo stare attenti quando conduciamo il test? Sì, perché l'operatore afferma che è importante ottenere l'immagine più nitida da misurare con precisione con il comportamento, e quindi è necessario regolare la lunghezza della fotocamera e le cose di scrittura belo.Anche nello studio del programma, è necessario impostare attentamente i valori sessuali e i criteri di ragione per giudicare se il comportamento può essere ificato o meno come ragione. È importante che il risultato sia stato immediato, il programma come con pensato di loro dall'osservazione umana Come mostrato nel presente risultato. Ok. Come puoi vedere, questo può essere un articolo, fornire informazioni dettagliate sulla procedura di test e sull'uso del programma software.Speriamo che questo possa essere un articolo. Promuovere la comprensione del test e contribuire alla standardizzazione del protocollo.

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