Name: Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-18T20:45:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Öğrenin yetişkin kemirgen beyninin farklı bölgelerinden nöral kök hücre kültürleri oluşturmayı. Bu yöntem, doku hasatlama ve tanımlı kültür koşulları ile çok potansiyelli hücrelerin kendini yenileme kapasitesini doğrular.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Helmholtz Derneği Girişimi ve Ağ Fonu, Else Kroener-Fresenius Vakfı&#39;ndan hibe ve Deutsche Forschungsgemeinschaft bir hibe yoluyla Görüntüleme ve Kür Çevre Metabolik Hastalıklar, (- Bu çalışma Helmholtz İttifak ICEMED tarafından (kısmen) finanse edildi SFB 655: dokulara hücreler).

Iş Helsinski Deklarasyonu ve ARVO Hayvan Bildirimi yapışır. Dresden Üniversitesi Hayvan tesisin talimatlarına göre Hayvan doku toplanması için kullanıldı ve ilgili yöntem takip edildi. Hayvanlar ele ve ev sahipliği laboratuvar hayvanlarının kullanımı ve bakımı için Alman Federal kurallarına göre ve çalışma Landesdirektion Dresden tarafından onaylandı edildi. Uygun ötenazi yöntemi konusunda kurumunuzun veteriner politikası (IACUC veya diğer yönetim kurulu) danışın. Özel stok ve reaktiflerin çalışma konsantrasyonları bu protokolü eşlik Reaktif Tablolar bulunabilir. 1.. Kültür Bulaşık Hazırlık <ol><li> 75 ug yeterli bir hacmi ile Coat tabaklar / ml poli-L-ornitin (örneğin 2 ml / oyuk, 6 oyuklu plaka) bir karışımı, 2 gün önce, planlanan diseksiyon bugüne kadar hücre kültürü kuluçka makinesi içinde. </li><li&gt; Aspire poli-L-ornitin ertesi gün ve 5 dakika boyunca PBS içinde 3 ml 2 x de, her yıkayın. </li><li> Nihai yıkama çıkarın, daha sonra plaka fibronektinin (1:250 seyreltilmiş PBS&#39;de 4 ug / ml) ekleyin ve gece boyunca inkübatör bulaşıkları yerleştirin. </li><li> Diseksiyon gününde fibronektin aspire ve yemekleri PBS ile 2x yıkayın. Hala ayrışmış doku kültürü için hazır olana kadar nihai PBS inkübatör yıkayın içeren plakaları dönmek. O zaman, doku kaplama için PBS önce çıkarın. </li><li> Kadar 3 hafta için kuluçka poli-L-ornithinein ile kaplanmış plakalar deposu. Fibronektin ile kaplı plakalar kadar 1 hafta boyunca depolanabilir. Acil ise Fibronektin kaplama az 2 saat içinde yapılabilir. Fibronektin denatürasyona açıktır; çözüm ajitasyon ya da yemekleri kurumasını izin vermeyin. </li></ol> 2. Diseksiyon / Kaplama <ol><li> Bu protokol, 3 yetişkin farelerin (yaş 3-6 ay) kullanımı için geçerlidir. </li><li> Chill önce sıçan ötenazi için buz üzerinde blok kesit beyin. </li><li> Buz üzerine eklendi bFGF ile N2 ortam 5 ml ihtiva eden bir 15 ml Falcon tüpü yerleştirin. </li><li> Kurumunuzun veteriner politikasına göre fareler Euthanize. </li><li> Başın orta hat aşağı bir kesi yaparak kafatası beyin çıkarın. Dikkatli ekstre edilecek beyin için izin kemik soyulmaya forseps kullanın. </li><li> Soğuk PBS içeren bir 10 cm Petri kabı içine beyin yerleştirin. Bu herhangi bir kalıntı saç ve kan kaldıracaktır. (Şekil 1A) </li><li> Soğutulmuş kesit bloğu içine beyin yerleştirin. (Şekil 1B) </li><li> Şekil 1C resimde olduğu gibi blok içine bir yeni temiz bir jilet yerleştirin. </li><li> Şekil 1D &#39;de gösterildiği gibi birinci, ikinci temiz bir traş makinesi bıçak 3 mm kaudal yerleştirin. </li><li> Dikkatle onlarla ilgi bölümünü alarak, blok bıçakları kaldırın. </li><li> Sec FloatPBS içinde daldırarak bıçağı kapalı masına neden. (Şekil 1 E) </li><li> Ilgi alanından hasat doku # 5 forseps kullanarak (bu örnekte biz ön komissura, (anterior) ACA, Şekil 1F kullanılan) ve bFGF içeren 1 ml N2 ortamı içeren 15 ml konik tüp içine toplamak. </li><li> Steril koşullar altında protokol kalan devam eden, bir laminar akış başlığı hücre kültürü içine borusunu. </li><li> Mekanik bir P1000 pipet bağlı 1 ml&#39;lik bir pipet kullanarak doku ayırmak. Yukarı ve aşağı pipet birkaç kez (yaklaşık 20x saniyede 1 pipet döngüsünün bir oranda) konik tüp (Şekil 1G 1-3) tabanına karşı pipet açılışını basarken. Çözelti homojen hale geldiğinde öğütme durdurun. </li><li> Çözüm daha büyük herhangi nondissociated doku altına yerleşmek için izin vermek için 2 dakika bekletin. (Şekil 1G 4) </li><li> Homojen toplayıneous süpernatan ve N2 ortamı içinde 8.5 ml ve 20 ng / ml bFGF, 500 ng / ml Dll4, 500 ng / ml Ang2 ve 200 nMJAK inhibitörü içeren bir konik tüp içine yerleştirin. </li><li> 3 seyreltilmiş hücre çözeltisinin ml / çukur kullanılarak 6-kuyulu plakanın kuyularına 3 Plate. </li><li> 37 ° C,% 5 CO2,% 5 O2 nemlendirilmiş bir hücre kuluçka makinesi içine levha yerleştirin. </li></ol> 3. Günlük Bakım <ol><li> Kaplama 24 saat sonra inhibitör bFGF&#39;yi, Ang2, Dll4, ve JAK içeren N2 Ortamı ile kültür yemekleri orta yerine. </li><li> BFGF, Dll4, Ang2 ve bir sonraki gün JAK inhibitörünün bir bolus ekleyin. </li><li> Ortam değişim ve 10-14 gün toplam etken eklemeler bu alternatif işleme devam edin. </li></ol> 4. Farklılaşma indüksiyon <ol><li> Ortamı içeren inhibitörü bFGF&#39;yi, Dll4, Ang2 ve JAK&#39;ı çekilme ve herhangi bir ek faktörleri içermiyor N2 ortamı değiştirin. </li><li> Her ikinci gün orta değiştirin. </li><li> 10 gün sonra hücreler saptamak ve immünositokimya gerçekleştirin. </li></ol> 5. Immünositokimyasal Algılama <ol><li> Ortam aspire ve 20 dakika boyunca% 4 paraformaldehid, 2 ml hücre kültürü plakaları düzeltin. </li><li> 5 dakika her biri için, 3 ml PBS ile yıkayın 2x. </li><li> PBS aspire, sonra geçirgen ve 20 dakika boyunca% 5 normal eşek serumu (NDS) ve% 0.1 Triton X-100 içeren PBS içinde 2 ml ekleyerek hücreleri bloke eder. </li><li> % 5 NDS içeren PBS birincil antikor karışımı hazırlayın. Tuj1 (sınıf III β-tubulin), GFAP ve CNPase antikorlar farklılaşma işaretlerinin üçlü boyanması için birlikte kullanılabilir ise anti-Nestin antikoru, SC&#39;ler belirlenmesi için de kullanılabilir. </li><li> Engelleme çözeltisi aspire ve de her bir birincil antikor karışımı 1.5 ml. 90 dakika boyunca oda sıcaklığında inkübe edin. </li><li> Birincil antikorlar çıkarın ve 3 ml PBS ile 2 kez yıkama, ve her biri 5 dakika boyunca 5% NDS ihtiva eden PBS içinde 3 ml 1x. </li><li> Prepare PBS içinde% 5 ikincil antikorlar NDS ihtiva etmektedir. </li><li> Nihai yıkama aspire ve de her bir sekonder antikor çözeltisi 1,5 ml ekleyin. Oda sıcaklığında 40 dakika boyunca karanlıkta inkübe edin. </li><li> İkincil antikor çözeltisini çıkarın ve taze hazırlanmış bir DAPI leke 2 ml (PBS içerisinde 500 ng / ml) ilave edilmektedir. 3 dakika boyunca inkübe edin. </li><li> DAPI çözeltisi aspire daha sonra 5 dakika her biri için, 3 ml PBS ile 3 kez yıkayın. Hücreler artık bir floresan mikroskobu ile görselleştirilebilir. </li></ol>

<ol><li>Cajal, R. Y. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCajal%2C+RY+%22Comparative+Study+of+Sensory+Areas+of+the+Human+Cortex%22">Comparative Study of Sensory Areas of the Human Cortex</a>. , Harvard University. (1899).</li>
<li>Altman, J., Das, G. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoradiographic+and+histological+evidence+of+postnatal+hippocampal+neurogenesis+in+rats%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Comp.+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoradiographic and histological evidence of postnatal hippocampal neurogenesis in rats.</a> J. Comp. Neurol. 124, 319-335 (1965).</li>
<li>Kaplan, M. S., Hinds, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+adult+rat%3A+electron+microscopic+analysis+of+light+radioautographs%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the adult rat: electron microscopic analysis of light radioautographs.</a> Science. 197, 1092-1094 (1977).</li>
<li>Nottebohm, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuronal+replacement+in+adulthood%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+N.Y.+Acad.+Sci%22%5BJournal%5D)">Neuronal replacement in adulthood.</a> Ann. N.Y. Acad. Sci. 457, 143-161 (1985).</li>
<li>Gould, E., Reeves, A. J., Graziano, M. S., Gross, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+the+neocortex+of+adult+primates%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in the neocortex of adult primates.</a> Science. 286, 548-552 (1999).</li>
<li>Kornack, D. R., Rakic, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuation+of+neurogenesis+in+the+hippocampus+of+the+adult+macaque+monkey%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Continuation of neurogenesis in the hippocampus of the adult macaque monkey.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 5768-5773 (1999).</li>
<li>Alvarez-Buylla, A., Kohwi, M., Nguyen, T. M., Merkle, F. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+heterogeneity+of+adult+neural+stem+cells+and+the+emerging+complexity+of+their+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">The heterogeneity of adult neural stem cells and the emerging complexity of their niche.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 357-365 (2008).</li>
<li>Reynolds, B. A., Weiss, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+neurons+and+astrocytes+from+isolated+cells+of+the+adult+mammalian+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Generation of neurons and astrocytes from isolated cells of the adult mammalian central nervous system.</a> Science. 255, 1707-1710 (1992).</li>
<li>Luskin, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Restricted+proliferation+and+migration+of+postnatally+generated+neurons+derived+from+the+forebrain+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Restricted proliferation and migration of postnatally generated neurons derived from the forebrain subventricular zone.</a> Neuron. 11, 173-189 (1993).</li>
<li>Lendahl, U., Zimmerman, L. B., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CNS+stem+cells+express+a+new+class+of+intermediate+filament+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CNS stem cells express a new class of intermediate filament protein.</a> Cell. 60, 585-595 (1990).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+neural+precursors+in+the+adult+brain+rescues+injured+dopamine+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Targeting neural precursors in the adult brain rescues injured dopamine neurons.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 106, 13570-13575 (2009).</li>
<li>Jin, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neurogenesis+in+dentate+subgranular+zone+and+rostral+subventricular+zone+after+focal+cerebral+ischemia+in+the+rat%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Neurogenesis in dentate subgranular zone and rostral subventricular zone after focal cerebral ischemia in the rat.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 4710-4715 (2001).</li>
<li>Zhang, R. L., Zhang, Z. G., Chopp, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ischemic+stroke+and+neurogenesis+in+the+subventricular+zone%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropharmacology%22%5BJournal%5D)">Ischemic stroke and neurogenesis in the subventricular zone.</a> Neuropharmacology. 55, 345-352 (2008).</li>
<li>Caplan, A. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Why+are+MSCs+therapeutic%3F+New+data%3A+new+insight%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pathol%22%5BJournal%5D)">Why are MSCs therapeutic? New data: new insight.</a> J. Pathol. 217, 318-324 (2009).</li>
<li>Goldman, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+and+progenitor+cell-based+therapy+of+the+human+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Stem and progenitor cell-based therapy of the human central nervous system.</a> Nat. Biotechnol. 23, 862-871 (2005).</li>
<li>Sun, N., Longaker, M. T., Wu, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+iPS+cell-based+therapy%3A+considerations+before+clinical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Human iPS cell-based therapy: considerations before clinical applications.</a> Cell Cycle. 9, 880-885 (2010).</li>
<li>Amariglio, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Donor-derived+brain+tumor+following+neural+stem+cell+transplantation+in+an+ataxia+telangiectasia+patient%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Med%22%5BJournal%5D)">Donor-derived brain tumor following neural stem cell transplantation in an ataxia telangiectasia patient.</a> PLoS Med. 6, e1000029(2009).</li>
<li>Lindvall, O., Bjorklund, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+therapeutics+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotherapeutics%22%5BJournal%5D)">Cell therapeutics in Parkinson's disease.</a> Neurotherapeutics. 8, 539-548 (2011).</li>
<li>Kittappa, R., Bornstein, S. R., Androutsellis-Theotokis, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Role+of+eNSCs+in+Neurodegenerative+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Mo.l+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">The Role of eNSCs in Neurodegenerative Disease.</a> Mo.l Neurobiol. , (2012).</li>
<li>Cattaneo, E., McKay, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identifying+and+manipulating+neuronal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Identifying and manipulating neuronal stem cells.</a> Trends Neurosci. 14, 338-340 (1991).</li>
<li>Jensen, J. B., Parmar, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strengths+and+limitations+of+the+neurosphere+culture+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Neurobiol%22%5BJournal%5D)">Strengths and limitations of the neurosphere culture system.</a> Mol. Neurobiol. 34, 153-161 (2006).</li>
<li>Duarte, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dosage-sensitive+requirement+for+mouse+Dll4+in+artery+development%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Dosage-sensitive requirement for mouse Dll4 in artery development.</a> Genes Dev. 18, 2474-2478 (2004).</li>
<li>Maisonpierre, P. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiopoietin-2%2C+a+natural+antagonist+for+Tie2+that+disrupts+in+vivo+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Angiopoietin-2, a natural antagonist for Tie2 that disrupts in vivo angiogenesis.</a> Science. 277, 55-60 (1997).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signalling+regulates+stem+cell+numbers+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Notch signalling regulates stem cell numbers in vitro and in vivo.</a> Nature. 442, 823-826 (2006).</li>
<li>Alderson, R. F., Alterman, A. L., Barde, Y. A., Lindsay, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Brain-derived+neurotrophic+factor+increases+survival+and+differentiated+functions+of+rat+septal+cholinergic+neurons+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Brain-derived neurotrophic factor increases survival and differentiated functions of rat septal cholinergic neurons in culture.</a> Neuron. 5, 297-306 (1990).</li>
<li>Johe, K. K., Hazel, T. G., Muller, T., Dugich-Djordjevic, M. M., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single+factors+direct+the+differentiation+of+stem+cells+from+the+fetal+and+adult+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Single factors direct the differentiation of stem cells from the fetal and adult central nervous system.</a> Genes Dev. 10, 3129-3140 (1996).</li>
<li>Ourednik, J., Ourednik, V., Lynch, W. P., Schachner, M., Snyder, E. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+stem+cells+display+an+inherent+mechanism+for+rescuing+dysfunctional+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Neural stem cells display an inherent mechanism for rescuing dysfunctional neurons.</a> Nat. Biotechnol. 20, 1103-1110 (2002).</li>
<li>Ryu, J. K., Cho, T., Wang, Y. T., McLarnon, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neural+progenitor+cells+attenuate+inflammatory+reactivity+and+neuronal+loss+in+an+animal+model+of+inflamed+AD+brain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Neuroinflammation%22%5BJournal%5D)">Neural progenitor cells attenuate inflammatory reactivity and neuronal loss in an animal model of inflamed AD brain.</a> J. Neuroinflammation. 6, 39(2009).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenic+factors+stimulate+growth+of+adult+neural+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Angiogenic factors stimulate growth of adult neural stem cells.</a> PLoS One. 5, e9414(2010).</li>
<li>Park, D. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hes3+regulates+cell+number+in+cultures+from+glioblastoma+multiforme+with+stem+cell+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Hes3 regulates cell number in cultures from glioblastoma multiforme with stem cell characteristics.</a> Sci. Rep. 3, 1095-1010 (2013).</li>
<li>Poser, S. W., et al. Ch. 5. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPoser%2C+SW+%22Cancer+Stem+Cells+-+The+Cutting%22">Cancer Stem Cells - The Cutting</a>. Shostak, S. , InTech. Europe, Rijeka, Croatia. 89-110 (2011).</li>
<li>Androutsellis-Theotokis, A., Rueger, M. A., Mkhikian, H., Korb, E., McKay, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signaling+pathways+controlling+neural+stem+cells+slow+progressive+brain+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb.+Symp.+Quant.+Biol%22%5BJournal%5D)">Signaling pathways controlling neural stem cells slow progressive brain disease.</a> Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 73, 403-410 (2008).</li>
</ol>

Biz ifşa hiçbir şey yok.

Başarılı izolasyon, genişleme, ve yetişkin beyin nöral kök hücrelerin farklılaşması için kritik adımların birçok standart doku kültürü teknikleri ile ortak paylaşılır. Akılda tutulması amacı, yetişkin beyin izole NSC&#39;lerde mümkün olduğunca in vivo özellikleri (Şekil 2J) kadar çok sayıda muhafaza gerektiğidir. Genellikle gerekli dikkat ve uygun hızı arasında bir denge vurdu gerekiyor. Kafatası beyin izolasyonu ile bakımı ilgi bölgenin tanımlanması önemli ölçüde kolaylaştıracaktır. Hayvan, öl...

Bir yüzyıl önce Ramón Y. Cajal tarafından yapılan beyin hücre mimarisini temel gözlemler tarafından belirlenen nörobiyoloji santral dogma, ergenlik MSS 1. bulunan sinir ağlarının karmaşıklığı verilen sonra nöron olası olduğunu düzenledi. 1960&#39;larda Altman iş, ve sonra Kaplan, 3 H-timidin aslında nöronlar yetişkin beynin farklı bölgelerinde üretilen belirten olgun nöronlarda bulunan olabileceğini gösteren rağmen, dogma 2, 3 tutmaya devam etti. Kanıt songbird beyinlerinde 4 mevcut nöronların sayısında mevsimsel değişiklikleri açıklayan Nottebohm araştırma ile bağlamaya devam etti. 1999 yılına kadar değildi zaman sıçan ilişkisel öğrenme görevlerin performansı yanı sıra Kornack ve Rakic ​​gösteriler yo gözlemleri ile hipokampus artar nöronların nesil Gould ve ark. Yayınlanmış çalışmasıting, daha az sert, fazla plastik beyin kavramı, 5 kabul edilmiş yetişkin makak, 6 nörogenezi devam etmiştir. Bu de novo oluşturulan nöronlar için hücresel kaynak için arama 7 nişler olarak adlandırılan beyin bölgelerinde bulunan kök hücreler (SCS) ayrı bir nüfusun keşfedilmesine yol açmıştır. Subventricular bölgesi ve hipokampus alt granül bölgesi, iki ana bölge nörojenik 8,9 olarak kabul edilir. Bu yerlerde izole hücreler klasik embriyonik veya fetal kaynaklı AVM&#39;ler karakteristiği, kendini yenileme ve farklılaşma potansiyeli göstermektedir. Nöral kök hücreler (NSC&#39;lerde) durumunda, bu nöronlar, astrositler ve oligodendrositler farklı olabilir. Ayrıca, bu SC&#39;ler, ara filament protein Nestin 10 fetal NSC belirteçleri için pozitif leke. Daha yeni çalışmalar AVM&#39;ler bu t sınırlı olmayabilir vurgulamaktadıralanları wo ve aslında sıkıca damar 11 ile bağlantılı bir hücre popülasyonu olarak büyük ölçüde hareketsiz beyin boyunca lokalizedir. AVM&#39;ler yaralanmaya yanıt olarak seferber olan gözlemler nörodejeneratif bozukluğu ve felç 12, 13 kurtarma yardım rejeneratif amaçlı bu hücreleri kullanmak mümkün olma olasılığını göstermektedir. Bu osteoblastlar, kıkırdaklan ve yağ hücreleri 14 olma potansiyeline sahip perivasküler hücreler olarak bulunan mezenkimal kök hücreler (MKH) bağ dokularının iyileşmesi oynadığı rol, farklı değildir. Bununla birlikte, NSC&#39;lerde rutin aspirasyon ve yoğunluk dereceli santrifüj teknikleri ile kemik iliğinden MSC ile aynı şekilde hasat edilemez ve ardından otolog hücre bazlı terapiler olarak kullanılmaktadır. Bunun bir sonucu olarak, bu tür EMB türetilen fetal NSC&#39;lerde veya nöronal öncülerinin kullanımı gibi diğer hücre kaynakları,ryonic kök hücreler yoğun bir başarı 15 dereceleri değişen hayvan hastalık ve yaralanma modellerinde araştırılmıştır. Somatik hücre kaynakları kullanarak uyarılmış pluripotent kök hücre teknolojileri kısıtlı olduğu ve embriyonik hücre ve fetal dokular 16 kullanımı ile ilgili endişeler etik üstesinden, geniş bir uygulama yelpazesi için terapötik açıdan yararlı, hücre bazlı terapiler üretilmesi için bir diğer potansiyel bir yol sunar. Ancak, bu bulguların klinik çeviri 17,18 yanı sıra, düzenleyici izni için dolambaçlı bir yol yaklaşımlar SC-temelli terapötik ile çeşitli nörolojik durumların tedavisi mücadelelerde gösterdiği gibi, zor bir görev olduğunu kanıtlamıştır. Alternatif bir yaklaşım olarak, belirli bir farmakolojik tedavilerin giriş NSC sayıda modüle eden ve Parkinson hastalığı ve felç 19 modellerinde kurtarma kolaylaştırabilir. Strateji, etkili bu hücreleri manipüle etmek için nasıl bir anlayış olabilir ne olursa olsunerişilebilir bir in vitro sistemi gerektirir. NSC&#39;lerde kültürleri, aynı zamanda olarak da bilinen neurospheres toplam kültürleri, ya bir tek tabaka ya da 8,20 olarak gerçekleştirilebilir. Her iki teknik, yaygın multipotent öncülerinin genişletilmesi için kültür koşulları sağlamak tanımlanan, bir mitojen kaynağı olarak Epidermal Büyüme Faktörü (EGF) veya bazik fibroblast büyüme faktörü (bFGF) yani kullanım kurulması için izin kullanılmıştır. Neurosphere kültürleri, bir izole edilmiş hücre tipi klonal yayılma yeteneği eğitim için daha uygun olsa da, sistem 21 genişlemesi sırasında hücrelerin karışık bir popülasyonunun üretilmesi için gösterilmiştir. Buna ek olarak, neurospheres kapalı yapısı, hücrelerin manipülasyonu farmakolojik pratik hale getirir, ve bu faktörler olabilir etkisi nedeniyle yorumlanması neurosphere kendi içinde kurulmuş olan mikro için eleştirilmiştir edilebilir. Tek tabakalı kültürleri, diğer taraftan, olabilir,SC büyümesini ve farklılaşmasını düzenleyen ve özellikle bu hücre popülasyonu hedef yeni bileşikler keşfetmek için bir fırsat açılır sinyal iletim mekanizmaları keşfetmek için güçlü bir araç sağlayarak, küçük molekül kütüphanelerin yüksek kapasiteli ekranlarında istihdam. Sonuç olarak, yeniden üretilebilir beyinde ilgi farklı bölgelerinden yetişkin NSC&#39;lerde kültürleri üretmek için yeteneği, merkezi sinir sistemi (MSS) gelişme çalışmalarından gelen yeni yaklaşımlar içinde rejeneratif ilaç kadar, araştırma uygulamaları geniş bir yelpazede kullanılabilir . Burada sunulan protokol incelemek ve erişkin kemirgen beyin izole MSS AVM&#39;ler arasında farklılaşma potansiyelini değerlendirmek için nasıl gösterir.

<table><tbody><tr><td>6 oyuklu doku kültürü kapları</td><td>BD Biosciences</td><td>353934</td><td></td></tr><tr><td>Poly-L-ornitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3655</td><td> 5 mg / ml stok çözeltisi çift damıtılmış suda hazırlanır (-20 ° C'de birkaç ay stabil; C). Çalışma konsantrasyonu suda 0.5 mg / ml (4 ° C'de 1 ay boyunca stabil; C). </td></tr><tr><td>Fibronektin</td><td>Ar-Ge D Sistemleri</td><td>1030-Fn</td><td>Stok çözeltisini çalkalamayın</td></tr><tr><td>Filtrasyon Aparatı</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>430769</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F-12</td><td>Mediatech</td><td>10-090-CV</td> Tam <td>N2 ortam hazırlığı için aşağıdaki nota bakın</td></tr><tr><td>Apo-transferrin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-2036</td><td></td></tr><tr><td>İnsülin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I-0516</td><td></td></tr><tr><td>Putresin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-5780</td><td>ddH2O'da 1 M stok çözümü (20 &°C'de kararlı; 6 ay boyunca C)</td></tr> <tr><td>Sodyum Selenit</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S-5261</td><td>500 & mikro; ddH2O'da M stok çözümü (-20 &°C'de kararlı; 6 ay boyunca C)</td></tr> <tr><td>Progesteron</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-8783</td><td>100 & mikro; Etanolde M stok çözeltisi (-20 ° C'de kararlı; 6 ay boyunca C)</td></tr> <tr><td>Penisilin / Streptomisin</td><td>İnvitrojen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Fosfat Tamponlu Salin</td><td>Mediatech</td><td>21-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Temel Fibroblast Büyüme Faktörü (bFGF)</td><td>R& D Systems</td><td>233-FB</td><td>Çalışma konsantrasyonu 20 ng/ml&nbsp;</td></tr><tr><td>Delta4 (Dll4)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>1389-D4</td><td>Çalışma konsantrasyonu&nbsp; 500 ng/ml</td></tr><tr><td>Anjiyopoetin 2 (Ang2)</td><td>Ar-Ge D Systems</td><td>623-AN</td><td>Çalışma konsantrasyonu & nbsp; 500 ng / ml</td></tr><tr><td>JAK İnhibitörü</td><td>Calbiochem</td><td>420099</td><td>Çalışma konsantrasyonu 200 nM & nbsp;</td></tr><tr><td>Sığır Serumu Albümin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-2058</td><td></td></tr><tr><td>15 ve 50 ml Konik tüpler</td><td>Corning Yaşam Bilimleri</td><td>430053, 430829</td><td></td></tr><tr><td>Diğer gerekli öğeler şunlardır: Jiletli ve forseps dahil olmak üzere genel diseksiyon aletleri, Yetişkin sıçan (3-6 aylık; Sprague-Dawley veya Long Evans), CO2 zehirlenme odası, Hücre kültürü ve inkübatör için laminer akış başlığı İnkübatör (nemlendirilmiş, 37 derece; C, %5 CO<alt>2</alt>, %5 O<alt>2</alt>). Not: Tam N2 ortam hazırlığı için, bir şişe DMEM / F-12'ye (500 ml) 0.05 g apotransferin, 0.0125 g insülin (1 ml 10 mM NaOH içinde taze çözünmüş), 50 & ekleyin; L putrescine, 30 & mu; l sodyum selenit, 100 & mu; l progesteron stokları ve 5 ml penisilin / streptomisin çözeltisi. Gerekirse pH'ı 7.2'ye ayarlayın. Filtreyle sterilize edin ve 4 ° C'de saklayın; 3 haftaya kadar C ve ışıktan koruyun.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">İmmünofloresan Reaktifler Tablosu</td></tr><tr><td>Paraformaldehit</td><td>Elektron Mikroskobu Bilimleri</td><td>15719</td><td></td></tr><tr><td>Normal Eşek Serumu (NDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-9663</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T-8787</td><td></td></tr><tr><td>4,6-Diamidino-2-fenilindol (DAPI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D-8417</td><td>5 mg/ml stok metanol</td></tr><tr><td içinde çözelti colspan="4"> Birincil Antikor</td></tr><tr><td>Tablosu Nestin</td><td>Chemicon</td><td>MAB353</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:400 Tür: Fare IgG1 </td></tr><tr><td>Hes3</td><td>Santa Cruz</td><td>sc-25393</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:100 Tür: Tavşan IgG </td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:100 Tür: Fare IgG2a </td></tr><tr><td>CNPase</td><td>Chemicon</td><td>MAB326</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:200 Tür: Fare IgG1 </td></tr><tr><td>&beta;-tubulin III (TUJ1)</td><td>R& D Sistemleri</td><td>MAB1195</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:500 Tür: Fare IgG2a </td></tr><tr><td>Glial Fibriler Asidik Protein (GFAP)</td><td>Dako Kuzey Amerika</td><td>Z0334</td><td> Seyreltme Faktörü 1:500 Tür: Tavşan </td></tr><tr><td colspan="4">İkincil Antikor Tablosu</td></tr><tr><td>Alexa&nbsp; &nbsp; 568</td><td>Invitrogen</td><td>A-21124</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:200 Tür: Keçi anti Fare IgG1 </td></tr><tr><td>Alexa 488</td><td>Invitrogen</td><td>A-21131</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:200 Tür: Keçi anti Fare IgG2a </td></tr><tr><td>Cy5</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>59883</td><td> Seyreltme Faktörü: 1:200 Türler: Keçi anti tavşan </td></tr></tbody></table>

yetişkin kemirgen beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan bölgelerinden nöral kök hücreler büyüyen

Growing Neural Stem Cells from Conventional and Nonconventional Regions of the Adult Rodent Brain

Son çalışma merkezi sinir sistemi (MSS) rejenerasyon ve tümörgenez kök hücre popülasyonları (AVM&#39;ler) yetişkin beyin içinde ikamet içerdiğini göstermektedir. Ancak bu mekanizmalar normal olarak sakin hücrelerinin uygun sinir ağlarının işleyişini yanı sıra nörodejeneratif süreçlerin yaralanma ve azaltılması kurtarma rollerini sağlamak için istihdam çok az anlaşılmıştır. Bu hücreler, vasküler ve bağışıklık sistemi hem de düzenleyici sinyallerini içeren bir idame ettiren bir ortam sağlamak &quot;niş&quot; olarak adlandırılan bölgelerde bulunur. Bilinmeyen faktörler hariç belirlenen kültür koşulları altında MSS AVM&#39;ler arasında izolasyon, bakım ve farklılaşma, böylece in vivo davranışları içgörü sağlayarak, farmakolojik veya genetik yollarla tedaviye onları erişilebilir kılar. Burada yetişkin beynin farklı bölgelerinden gelen MSS AVM&#39;ler kültürlerini oluşturmak için yöntemler hakkında detaylı bilgi sunmak ve onların d değerlendirmek için yaklaşımlarnöronlar, astrositler ve in vitro oligodendrosit içine ifferentiation potansiyeli. Bu teknik, tek tek SC&#39;ler ve döl çalışma görselleştirilebilir tek tabakalı bir kültür olarak homojen bir hücre popülasyonu elde edilir. Bundan başka, farklı hayvan modeli sistemlerinde ve klinik örnekler arasında uygulanabilir hasarlı yetişkin sinir sisteminin rejeneratif tepkileri tahmin etmek için daha önce kullanılan edilir.

Nöral kök hücreleri toplamak için hangi ilgi bölgeyi belirlenmesi kritik ilk adımdır ve bu hücrelerin birleşen bir plaka almak için gereken süreyi tanımlar. Örneğin, SVZ klasik nörojenik bir alandır ve dolayısıyla nöral kök hücre, daha yüksek bir göreceli bir oran vardır. Ancak burada sunulan teknik genellikle yetişkinlik döneminde sağlam bir nörojenik potansiyele sahip olarak tanınan değil diğer bölgelerde kullanılabilir. Bu protokolün amaçları için, ön komissura (ön kısım) kullanılır. Hücre ve döküntü bir kaplama üzer...

Yetişkin beyin hasat nöral kök hücreler sinir sistemi gelişiminin temel araştırma rejeneratif tıpta potansiyel klinik uygulamaları keşfetmek için çeşitli uygulamalar kullanılmaktadır artmaktadır. Bu deneysel sonuçların ses için kritik bu hücreleri büyümek için kullanılan yalıtım ve kültür koşullarında titiz kontrolü yapar.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Recent work demonstrates that central nervous system (CNS) regeneration and tumorigenesis involves populations of stem cells (SCs) resident within the ...

Aşağıdaki deneyin genel amacı, yetişkin kemirgen beyninin farklı bölgelerinden nöral kök hücre kültürleri oluşturmaktır. Bu, nöral kök hücrelerin varlığını ve potansiyelini incelemek için ilgilenilen bir bölgeden doku toplanarak elde edilir. İkinci adım olarak, dokuyu tek katmanlı bir kültür olarak kaplamak için bir hücre süspansiyonuna işleyin.Daha sonra, nöral kök hücreleri seçici olarak çoğaltmak için tanımlanmış kültür koşullarını kullanın ve kendi kendini yenileme potansiyellerini doğrulayın. İn vitro sonuçlar, nöral kök hücrelerin farklılaşma potansiyellerine ve çeşitli faktörlerin kendilerini yenilemelerini ve kaderlerini nasıl etkileyebileceğine bağlı olarak çok güçlü olduğunu gösteren sonuçlar elde edilir. Bu yöntem, endojen nöro kök hücrelerin nerede bulunduğu ve bunların nasıl manipüle edileceği gibi sinirbilim ve rejeneratif tıp alanlarındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir.Bu tekniği ilk olarak sinyal azaltma yollarını keşfettiğimizde düşündük. Bu, hem varsayılan endojen nöros kök hücrelerini tanımlamamıza hem de sayılarını düzenlememize izin verdi. Bu yüzden bu bilgiyi, beynin farklı bölgelerinden bu hücrelerin sağlam kültürlerini oluşturmak için uygu

growing-neural-stem-cells-from-conventional-nonconventional-regions

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Sinirbilim

Bu video protokolü yetişkin fare periventriküler bölge nöral kök hücreler oluşturmak ve genişletmek için neurosphere assay yöntemi gösterir ve bir tekrarlanabilir neurosphere kültürleri elde edebilirsiniz sağlamak için teknik bilgiler sağlar.

Neurosphere Testi Yetişkin Fare Nöral Kök Hücre İzolasyonu ve Genişleme

Bu video, yetişkin sıçanlarda omuriliğin periventriküler dokusundan nöral kök/progenitör hücreleri izole etmek için bir yöntem sunar. Teknik, hücre dışı matrisi bozmak ve hücreleri serbest bırakmak için doku parçalarının proteolitik enzimler içeren bir çözelti içinde inkübe edilmesini içerir. Daha sonra, salınan hücreler, nöral kök / progenitör proliferasyonunu artıran ve üç boyutlu nörosferlere agregasyonu teşvik eden spesifik büyüme faktörleri içeren bir ortamda kaplanır.

Erişkin Bir Sıçanın Omurilik Periventriküler Bölgesinden Nöral Kök Progenitör Hücrelerin İzolasyonu

Bu protokol, tek bir hücre süspansiyonu için ayrışma olmadan küresel nöral kök ve projenitör hücre agrega genişlemesini sağlayan bir yeni mekanik bir kesme yöntemi tarif etmektedir. Hücre / hücre teması sürdürmek üzerinde 40 geçişleri için hızlı ve istikrarlı bir büyüme sağlar.

İnsan Nöral Agregalarının bir cGMP uygulanabilir Açılım Yöntemi kök hücrelerin pluripotent kök hücreleri veya Fetal Beyin dokusundan türetilen

Burada subventricular bölgesi ve bireysel yetişkin farelerin kıvrımlarının gelen yapışkan tek katman veya neurospheres ya gibi, sinir öncü hücre kültürlerinin eş zamanlı üretimi için ayrıntılı bir protokol açıklar.

Bir Fare, İki Kültür: İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kültür Bireysel Farelerde iki Nörojenik Bölgeler&#39;den Kök Hücre

Yetişkin memeli omuriliği, kültürde izole edilebilen ve genişletilebilen nöral kök/progenitör hücreler (NSPC'ler) içerir. Bu protokol, erişkin omuriliğinin periventriküler bölgesinden sıçandan ve insan organ nakli donörlerinden üretilen NSPC'lerin toplanmasını, izolasyonunu, kültürünü ve geçişini açıklar.

Periventriküler Yetişkin Rat Bölgesinde ve İnsan Omurilik gelen Nöral Kök / Progenitör Hücreler izolasyonu

Nöral kök hücreleri (NSC'ler) ve soylarını yetişkin fare beyninin subventriküler bölgesinden (SVZ) izole etmek için Floresan Aktif Hücre Sıralama (FACS) tabanlı bir yöntem bildiriyoruz. Floresan Ubikitinasyon Hücre Döngüsü Göstergesi (FUCCI) transgenik farelere uygulandığında, canlı görüntüleme ile hücre döngüsü ilerlemesinin incelenmesine izin verir.

Hücre Yetişkin Fare subventricular Bölgesinden Nöral Kök ve Progenitör Hücreler Sıralama ve Hücre Döngüsü Dynamics Canlı görüntüleme

Erişkin nöral kök hücrelerin (aNSC'ler) genişletilmesi için kültür sistemlerinin kurulması, aNSC'lerin tedavi için incelenmesine ve uygulanmasına olanak sağlar. Subkallozal bölge (SCZ) son zamanlarda yetişkin farelerde yeni bir nöroblast oluşturan bölge olarak kabul edilmiştir. Burada, SCZ-aNSC'lerin izolasyonu, genişletilmesi ve farklılaştırılması için yöntemler açıklanmaktadır.

Fare Subcallosal Zone İzolasyon ve Yetişkin Nöral Kök Hücre Kültürü

köpek beyin yetişkin nörogenezi incelemek için değerli bir modeldir. izole ve primer beyin dokusundan yetişkin köpek hipokampal nöral prekürsör hücrelerin genişletilmesi için protokoller burada sundu.

İzolasyon ve Yetişkin Köpek Hipokampal Sinir Öncüleri genişletilmesi

Burada, E13 fare embriyo ganglionic itibar bir roman mikrocerrahi teknik nöral kök hücrelerin izolasyonu için tanıtmak.

Yalıtım ve kültür embriyonik fare nöral kök hücrelerin

Canlı sıçanların beyinlerinden nöral kök hücrelerin ve oligodendrosit progenitör hücrelerinin izolasyonu için bir yöntem burada deneysel olarak ayrıntılı olarak sunulmaktadır. Refahlarından ödün vermeden bu hücrelerin aynı hayvanlardan birden fazla toplanmasına izin verir.

Canlı Sıçanlardan Nöral Kök Hücrelerin ve Oligodendrosit Progenitör Hücrelerin İzolasyonuna Yönelik "Beyin Sağım" Yöntemi

Burada, erişkin murin subventriküler bölgesinden izole edilen genişletilmiş nöral kök hücrelerde (NSC'ler) gen iletim verimliliğini artırmak için tasarlanmış bir nükleofeksiyon sistemini açıklıyoruz. Bulgular, bu yöntemin NSC'lerde gen bozulmasını önemli ölçüde iyileştirdiğini, geleneksel transfeksiyon protokollerinin etkinliğini aştığını ve hücre sağkalım oranını artırdığını göstermektedir.

Erişkin Murin Subventriküler Bölgesinden Nöral Kök Hücrelerin İzolasyonu, Genişlemesi ve Nükleofeksiyonu

Öğrenin yetişkin kemirgen beyninin farklı bölgelerinden nöral kök hücre kültürleri oluşturmayı. Bu yöntem, doku hasatlama ve tanımlı kültür koşulları ile çok potansiyelli hücrelerin kendini yenileme kapasitesini doğrular.

Yetişkin Kemirgen Beyin konvansiyonel ve konvansiyonel olmayan Bölgelerinden Nöral Kök Hücreler Büyüyen

Daha fazla video keşfet