Name: In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-02-17T21:30:00.000+00:00
Duration: 13 min 40 s
Description: Scopri come studiare la pompa di efflusso MexAB di Pseudomonas aeruginosa mediante ricostituzione in liposomi. Questo metodo consente di generare un gradiente protonico regolabile per analizzare l'attività delle proteine di membrana.

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Questo studio è stato sostenuto dalla Agence Nationale de la Recherche (progetto ANR-2010-BLAN-1535) e da una sovvenzione da Région Ile-de-France (DIM-Malinf 110058).

1. Proteine ​​produzione e purificazione <ol><li> MEXA, MexB da Pseudomonas aeruginosa <ol><li> Trasforma i plasmidi che ospitano i geni MEXA e MexB in E. coli ceppo di produzione (ad esempio C43 DE3). Piatto su LB Agar supplementato con l&#39;antibiotico appropriato. Scegli una singola colonia per inoculare un precoltura O / N. La mattina dopo, inoculare il precoltura in 1 L di LB e di crescere a 37 ° C sotto agitazione (240 rpm). </li><li> Una volta che le cellule hanno raggiunto la fase esponenziale (OD 600 = 0,6-0,8) inducono con 1 mM IPTG. Eseguire di induzione per 2-3 ore a 30 ° C sotto agitazione. </li><li> Centrifugare le cellule (9.000 xg per 20 min) e risospendere in 30 ml Tris-HCl 20 mM, pH 8, NaCl 150 mm. </li><li> Distruggere le cellule utilizzando una pressa francese (10.000 psi, 4 pass). Eliminare le celle continue e corpi di inclusione per centrifugazione a 9.000 xg per 20 min. </li><li> Membrane pellet 1 ora a 100.000 xg e resuspend ciascun pellet in 30 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM. </li><li> Determinare la concentrazione totale di proteine ​​di membrana utilizzando il saggio colorimetrico BCA e solubilizzare le membrane O / N con 2% maltoside dodecil (DDM) in un volume finale determinata in modo tale detergente: proteina è 1:1,5 (w / w). </li><li> Ultracentrifuga a 100.000 xg per 1 ora di disfarsi del materiale non solubilizzato e aggregati. </li><li> Incubare il supernatante per 2 ore a 4 ° C con una resina al nichel (Mexa purificazione) o una resina di cobalto (MexB purificazione) equilibrata con Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mm, DDM 0,2%. </li><li> Versare la resina in una colonna vuota. Raccogliere il flusso attraverso. </li><li> Lavare la resina con 50 ml di Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 20% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, DDM 0,2%, poi con 25 ml di Bis-Tris 10 mM pH 6, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 10 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Eluire il protein con 20 ml Bis-Tris 10 mM pH 7,4, glicerolo 5% (w / v), imidazolo 300 mM, NaCl 500 mM, 0,2% DDM. </li><li> Concentrare la proteina di un dispositivo di ultrafiltrazione fino a 3 ml e il carico su una colonna dissalazione equilibrata con un buffer libero-imidazolo. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge le proteine ​​solubilizzate (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Poi ancora alla concentrazione della proteina di 0,3 ml. </li></ol></li><li> Batteriorodopsina da Halobacter Salinarium <ol><li> Crescere le cellule Salinarium Halobacter sotto illuminazione a 37 ° C per 10 giorni in un mezzo di crescita liquido contenente NaCl 4 M, MgSO4 150 mM, citrato 10 mM, KCl 30 mM, estratto di lievito 5 g / L, e peptone 5 g / L. </li><li> Distruggere le cellule da dialisi contro acqua deionizzata. </li><li> Purificare la membrana viola su un 30-40% (w / v) gradiente di saccarosio (100.000 xg per 17 hr). </li><li> Solubilizzare la sospensione membrana con 2% octylglucoside per 24 ore a 37 ° C (volume per la solubilizzazione per risospendere membrana a 2:1 (w / w) di detergenti: rapporto di proteina). Stimare la concentrazione di BR solubilizzato con ε (570 nm) = 54.000 M -1 cm -1. Poco prima di ricostituzione (vedi sotto), Ultracentrifuge BR solubilizzato (100.000 xg per 20 min) per sbarazzarsi di lipidi e proteine ​​unsolubilized. Nota: Le membrane native sono naturalmente arricchite in BR quindi non è necessario ulteriore purificazione. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di proteoliposomi <ol><li> Formazione di liposomi: Mettere 400 ml di DOPC disciolti in cloroformio (25 mg / ml) in un bicchiere di vetro e aggiungere 1,5 mg di colesterolo memorizzato come polvere. Asciugarle appena prima manipolazione sotto un vapore di azoto o sotto vuoto per almeno 1 ora in un bicchiere di vetro. Il DOPC: rapporto molare colesterolo è 3.3:1. <ol><li> Dopo che si sono asciugati, idratare i lipidi di 1 ml di HEPES 25 mM pH 7,K 2 SO 4 100 mM, MgCl 2 2 mM, 2 mM pyranine. La sospensione dovrebbe apparire torbida in questa fase. </li><li> Riscaldare la soluzione per 10 minuti a 37 ° C. Ultrasuoni per 10 min a 40 W con 30 sec impulsi, 30 cicli di pausa sec a RT. La sospensione dovrebbe apparire chiaro in questa fase. </li><li> Per ottenere una popolazione monodisperse di liposomi, eseguire due cicli di estrusione e per ogni ciclo, passare la sospensione di liposomi attraverso il filtro almeno 11x. Per il primo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 200 nm e per il secondo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori di membrana di 100 nm. Misure di scattering di luce dinamici possono essere eseguite in questa fase per verificare l&#39;omogeneità della sospensione. </li></ol></li><li> Proteine ​​incorporazione Principio: membrana proteine ​​possono essere ricostituiti in liposomi per effetto solubilizzante dei detergenti. Liposomi detergente-solubilizzati vengono incubati con la proteina di membrana detergente-solubilizzato e formazione del proteoliposomes è innescato da una rapida eliminazione del detergente con perle di polistirene 9. <ol><li> Aggiungere 28 mg di Triton X-100 (0,56% finale) e incubare O / N a 4 ° C (la temperatura di solubilizzazione può essere adattato alla proteina studiata). </li><li> Aggiungere il detersivo proteina-solubilizzato (BR, MexB e Mexa) ai liposomi solubilizzate e incubare 15 min a 4 ° C. Aggiungere le proteine ​​per la sospensione di liposomi solubilizzato i seguenti rapporti (w / w): lipidi / MexB = 20, MexB / MEXA = 2.5, e lipidi / BR = 30. </li><li> Aggiungere perle di polistirene ad un 30:1 branelli: rapporto detergente (w / w, considerando il peso totale di detersivo, compreso detersivo aggiunto con le proteine ​​purificate) e incubare 5 ore, al buio (a causa della BR) a temperatura ambiente sotto leggera mescolando. Prima di questa procedura, attivare i biobeads con metanolo ed etanolo incubazione e ampiamente lavare con acqua. </li><li> Purificare la proteina proteoliposomi e substrati gratuitamente utilizzando un PD-10colonna dissalazione equilibrata con HEPES pH 25 mM 7, K 2 SO 4 e 100 mM MgCl 2 2 mM. </li><li> Conservare le proteoliposomi a 18 ° C al buio per un massimo di 2-3 settimane. </li></ol></li><li> Valutazione dell&#39;efficacia ricostituzione su gradiente di saccarosio. Per controllare che sia il MexB e BR sono stati ricostituiti in liposomi, purificare la sospensione proteoliposome su un gradiente di saccarosio discontinuo. <ol><li> Depositarsi delicatamente i proteoliposomi su un gradiente cinque strati di saccarosio (60%, 20%, 10%, 5% e 2,5%, w / v). </li><li> Ultracentrifuga per 17 ore a 100.000 xg (con l&#39;accelerazione minima e decelerazione). </li><li> Raccogliere accuratamente le varie frazioni gradiente (in particolare le interfacce tra ogni strato di saccarosio) e analizzarli su SDS-PAGE (10%) con Coomassie colorazione o Western blotting. Proteine ​​aggregate si trovano nella parte inferiore del tubo, mentre, proteine ​​detergenti-solubilizzato nonincorporated si trovano nella parte superioreil tubo. Proteoliposomi e liposomi sono disponibili all&#39;indirizzo interfacce saccarosio corrispondenti alla loro densità intrinseca. Liposomi vuoti sono recuperate più in alto nel gradiente rispetto alle proteoliposomi. </li></ol></li></ol> 3. Fluorescenza di misura <ol><li> Effettuare misure di fluorescenza a 25,0 ° C usando un spettrofluorimetro consentendo misure a doppia lunghezza d&#39;onda (lampada Xe, 150 W). Periodi di illuminazione alternativi (per attivare BR con lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 550 nm / 550 nm) e misure di fluorescenza con lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione di 455 nm / 509 nm per 2 secondi per misurare la fluorescenza pyranine. Impostare eccitazione e di emissione larghezze di banda di 5 nm. Effettuare le misure in presenza di 50 nM valinomicina per impedire la formazione di un potenziale di membrana ΔΨ inverso. Nota: Infatti, poiché il BR pompe protoni, ci sono più cariche positive all&#39;interno del liposoma che all&#39;esterno. Questa caricagradiente può essere eliminata utilizzando valinomicina, che è un K + ionoforo selettiva. Una volta aggiunto alla valinomicina liposomi sospensione, come una molecola idrofobica, inserirà nella membrana del liposoma, passivamente trasportare K +, e quindi dissipare il potenziale ΔΨ membrana. </li></ol>

<ol><li>Granseth, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+protein+structural+biology+-+How+far+can+the+bugs+take+us%3F+%28Review%29%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+Membrane+Biology%22%5BJournal%5D)">Membrane protein structural biology - How far can the bugs take us? (Review).</a> Molecular Membrane Biology. 24 (5-6), 329 (2007).</li>
<li>Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multidrug+resistance+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Multidrug resistance in bacteria.</a> Annu Rev Biochem. 78, 119 (2009).</li>
<li>Pos, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drug+transport+mechanism+of+the+AcrB+efflux+pump%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Drug transport mechanism of the AcrB efflux pump.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 782 (2009).</li>
<li>Murakami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structures+of+a+multidrug+transporter+reveal+a+functionally+rotating+mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structures of a multidrug transporter reveal a functionally rotating mechanism.</a> Nature. 443 (7108), 173 (2006).</li>
<li>Seeger, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Asymmetry+of+AcrB+Trimer+Suggests+a+Peristaltic+Pump+Mechanism%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Structural Asymmetry of AcrB Trimer Suggests a Peristaltic Pump Mechanism.</a> Science. 313 (5791), 1295 (2006).</li>
<li>Sennhauser, G., Bukowska, M. A., Briand, C., Grutter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+multidrug+exporter+MexB+from+Pseudomonas+aeruginosa%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the multidrug exporter MexB from Pseudomonas aeruginosa.</a> J Mol Biol. 389 (1), 134(2009).</li>
<li>Su, C. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+the+CusBA+heavy-metal+efflux+complex+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of the CusBA heavy-metal efflux complex of Escherichia coli.</a> Nature. 470 (7335), (2011).</li>
<li>Nikaido, H., Takatsuka, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+RND+multidrug+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of RND multidrug efflux pumps.</a> Biochim Biophys Acta. 1794 (5), 769 (2009).</li>
<li>Rigaud, J. L., Levy, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstitution+of+membrane+proteins+into+liposomes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+enzymology%22%5BJournal%5D)">Reconstitution of membrane proteins into liposomes.</a> Methods in enzymology. 372, 65 (2003).</li>
<li>Aires, J. R., Nikaido, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aminoglycosides+are+captured+from+both+periplasm+and+cytoplasm+by+the+AcrD+multidrug+efflux+transporter+of+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Aminoglycosides are captured from both periplasm and cytoplasm by the AcrD multidrug efflux transporter of Escherichia coli.</a> J Bacteriol. 187 (6), 1923 (2005).</li>
<li>Picard, M., Verchere, A., Broutin, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+the+active+transport+of+efflux+pumps+after+their+reconstitution+into+proteoliposomes%3A+caveats+and+keys%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Monitoring the active transport of efflux pumps after their reconstitution into proteoliposomes: caveats and keys.</a> Anal Biochem. 420 (2), 194 (2012).</li>
<li>Verchere, A., Dezi, M., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basic+Methods+in+Protein+Purification+and+Analysis%2C+edited+by+iConcept+Press%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Basic Methods in Protein Purification and Analysis, edited by iConcept Press.</a> , (2012).</li>
<li>Verchere, A., Broutin, I., Picard, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Photo-induced+proton+gradients+for+the+in+vitro+investigation+of+bacterial+efflux+pumps%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Photo-induced proton gradients for the in vitro investigation of bacterial efflux pumps.</a> Sci Rep. 2, 306 (2012).</li>
</ol>

Non c&#39;è nulla da rivelare.

Descriviamo una procedura di ricostituzione progettato per saggiare trasporto delle proteine ​​di membrana. Una volta stabilita, la procedura di ricostituzione proteina causa di misure che sono molto riproducibili. Tuttavia, le condizioni esatte per ricostituire la proteina variano da una proteina all&#39;altra. Molta cura deve essere presa per ottimizzare i seguenti parametri: i) qualità della purificazione (purezza e l&#39;assenza di materiale aggregato); ii) l&#39;efficienza della fase di detersivo solubilizzante (quando possibile, partire detersivo CMC dovrebbe essere preferito perché sono più facili da ottenere liberati); iii) desorbimento del detersivo (è ad esempio possibile combinare l&#39;uso di perle di polistirene con una fase di dialisi ma puo influenzare la velocità di desorbimento, un parametro critico per la successiva attività della proteina, vedi rif [ 9]); iv) ricostituzione lipidica (la natura chimica del lipide, il lipide rapporto proteina, la presenza di ulteriori amphiphiles sono parametri critici che devono essere varia e ottimizzati). In aggiunta la temperatura e il tempo di incubazione influenzare tutti questi problemi. Il controllo di qualità è quindi primordiale in ogni fase della procedura di ricostituzione. Da questo punto di vista, dispersione della luce è una tecnica molto conveniente perché è rapida, non distruttiva, e richiede solo 20 ml di campione ad una concentrazione nel range micromolare. Una volta formati i proteoliposomi, gradiente di saccarosio è anche di grande aiuto perché apre la strada alla verifica sistematica della ricostituzione: qualitativa (è la proteina effettivamente incorporato nella membrana del liposoma) e quantitativa (quante proteine ​​in un liposoma). Questi ultimi sarebbero trattate misurando precisamente la proteina e concentrazioni lipidiche. Il nostro test non si basa sulla titolazione del substrato stesso e questo evita considerazioni disagio per quanto riguarda possibili diffusione passiva artefatta di<html> la molecola causa di partizionamento idrofobico nelle membrane. Il test sfrutta le proprietà di pyranine come sonda affidabile e quantitativa per modifiche monitoraggio del pH. I nostri risultati sono in accordo con i risultati ottenuti con un altro procedimento in cui la formazione gradiente protonico è stato eseguito utilizzando valinomicina 10, ma consente una più robusta e riproducibile gradiente 11. Inoltre, il gradiente protonico può essere regolato con precisione, semplicemente variando la concentrazione del tampone (per maggiori dettagli si veda Verchere et al. 12). Nella procedura una misurazione di controllo viene eseguita prima in assenza del substrato (questo dà accesso all&#39;attività passiva della proteina). L&#39;attuale attività del trasportatore proteina di membrana viene misurata dopo il substrato è stato aggiunto nella stessa cuvetta. Questo è veramente un bene perché l&#39;esperimento può essere considerato un autentico, risultato, non ambiguo substrato indotta. ent &quot;&gt; Il protocollo potrebbe essere adattato per il throughput medio-alta (ad esempio 96-pozzetti misurazioni) automatizzazione perché illuminando il campione innesca la reazione. Automazione e parallelizzazione consisterebbe nel preparare una grande serie di proteoliposome, e nel dispensare aliquote in 96 -pozzetti piastra. Substrati (e anche possibili inibitori) sarebbero poi aggiunti e dopo incubazione al buio per 45 minuti il ​​piatto sarebbe stato sottoposto a cicli di misurazione della fluorescenza illuminazione / pyranine su un lettore di micropiastre. Per ulteriori informazioni sul protocollo, i lettori sono invitati a leggere Verchere et al. 12,13

Proteine ​​integrali di membrana rappresentano fino al 30% dei geni codificati in genomi eucariotici. Essi condividono un ruolo fondamentale come mantenimento del cancello (recettori), trasporto di nutrienti, ioni o composti nocivi (trasportatori) o il mantenimento della permeabilità attraverso doppi strati di membrana (canali) tra tutte le cellule viventi 1. Efflux pompe hanno un ruolo centrale nella resistenza contro la terapia antibiotica 2. Nei batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa, che è protetto da una membrana esterna, trasportatori di efflusso sono organizzati come sistemi tripartito dove MexB, la pompa di efflusso si trova nella membrana interna, funziona in combinazione con Mexa, una proteina periplasmatico, e OprM e delle canale membrana esterna. La proteina citoplasmatica membrana interna agisce come una pompa energia-dipendente con un&#39;ampia specificità di substrato. La proteina di membrana esterna funge porina mentre il terzo si trova nello spazio periplasmatico ed è pensato per stabilizzare l&#39;intero complesso <sup&gt; 3. In seguito, ci si concentra sulla progettazione di un saggio funzionale per l&#39;assemblaggio MEXA MexB. Informazioni strutturali ha accumulato negli ultimi cinque anni grazie alla determinazione di raggi X della proteina AcrB omologa da Escherichia coli 4-7. Anche se è chiaramente importante accoppiare queste informazioni con i dati dinamici e cinetici, la progettazione di un saggio funzionale per questo trasportatore è una vera sfida 8. Infatti, le proteine ​​di membrana devono essere mantenuti in un ambiente membranosa e un vano chiuso devono essere mantenuti per un trasporto vettoriale di substrato da raggiungere. Ricostituzione di proteine ​​di membrana in proteoliposomi è stato ampiamente presentato e recensito (vedi Rigaud e Levy 9). Tali protocolli consentono il monitoraggio della membrana proteine ​​attività, ad esempio seguendo i substrati attraverso la membrana del liposoma. In questo caso le limitazioni derivano dal unvailability di substrati titolabili (fluorescente, radioattivi, ecc.) e dal fatto che molto spesso questi substrati sono idrofobi e hanno la tendenza ad attraversare le membrane indipendentemente dalla presenza del trasportatore. In alternativa, si può seguire le variazioni spettroscopiche di un colorante notifica sensibile ai cambiamenti chimici che si verificano a seguito di trasporto. Come detto sopra, i protoni energizzare il trasporto via MexB. Quindi, un&#39;opzione rilevante è quello di monitorare le variazioni spettroscopiche di una segnalazione colorante sensibile al pH di seguire le variazioni di pH dovute al trasporto substrato protone-driven. La scelta di un colorante fluorescente evita qualsiasi effetto artefatti dovuti alla natura idrofoba del substrato. Un&#39;ulteriore difficoltà è la generazione di un gradiente protonico. Diversi protocolli sono disponibili in letteratura. Tra questi, l&#39;uso della tecnica valinomicina è molto diffusa ma abbiamo dimostrato che è noioso per eseguire 10-11. Inoltre ènon riproducibile e non è reversibile. Abbiamo ricorso all&#39;uso di batteriorodopsina (BR), una pompa protonica fotoattivabile da Halobacter Salinarium, un halophilic marino Gram-negativi obbligato archaeon aerobico. Questa proteina è coreconstituted nei liposomi con MexB e, sotto illuminazione, BR pompe protoni all&#39;interno dei liposomi e quindi crea il ΔpH (acido all&#39;interno) necessario per la proteina di trasporto del substrato 12-13.

<table><tbody><tr><td>DOPC (1,2-Dioleil-sn-glicero-3-fosfocolina)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375C</td><td></td></tr><tr><td>Colesterolo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C8667</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B2261</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93427</td><td></td></tr><tr><td>Valinomicina</td><td>Invitrogen</td><td>V-1644</td><td></td></tr><tr><td>Piranina (8- acido idrossipirene-1,3,6-trisolfonico)</td><td>Invitrogen</td><td>H-348</td><td></td></tr><tr><td>DDM (n-dodecil-beta;-D-maltopiranoside)</td><td>Affymetrix</td><td>D310LA</td><td></td></tr><tr><td>Kit estrusore (estrusore, siringhe a tenuta di gas Hamilton)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>610000</td><td></td></tr><tr><td>Biobeads SM-2 Adsorbenti</td><td>Bio-Rad</td><td>152-3920</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac Cromatografia colonna vuota</td><td>Biorad</td><td>732-1010</td><td></td></tr><tr><td>Colonne di desalinizzazione</td><td>Bio-Rad</td><td>54805</td><td></td></tr><tr><td>Strumento di diffusione dinamica della luce</td><td>Wyatt Technology</td><td>DynaPro NanoStar</td><td></td></tr><tr><td>Fluorimeter JASCO FP-6200</td><td>JASCO</td><td>6816-J002A</td><td></td></tr></tbody></table>

in vitro indagine della mexab efflux pompa da pseudomonas aeruginosa

In vitro Investigation of the MexAB Efflux Pump From Pseudomonas aeruginosa

C&#39;è un bisogno emergente scientifico di strumenti affidabili per il monitoraggio del trasporto delle proteine ​​di membrana. Presentiamo una metodologia che porta alla ricostituzione di pompe di efflusso da batteri Gram-negativi Pseudomonas aeruginosa in un ambiente biomimetico che consente una accurata indagine della loro attività di trasporto. Siano soddisfatte tre condizioni preliminari: compartimentazione in un ambiente lipidico, l&#39;uso di un indice rilevante per i trasporti, e la generazione di un gradiente protonico. Il trasportatore proteina di membrana viene ricostituito in liposomi insieme con batteriorodopsina, una pompa protonica attivato dalla luce che genera un gradiente protonico che sia robusto e reversibile e regolabile. L&#39;attività della proteina è dedotto dalle variazioni di pH che si verificano all&#39;interno del liposoma, utilizzando pyranin, una sonda fluorescente pH-dipendente. Descriviamo una procedura passo-passo dove purificazione di proteine ​​di membrana, la formazione di liposomi, proteine ​​ricostituzione, e un trasportonalisi sono rivolte. Anche se sono stati progettati specificamente per un trasportatore RND, i metodi descritti potrebbero potenzialmente essere adattati per l&#39;uso con qualsiasi altra proteina di membrana trasportatore alimentato da un gradiente protonico.

Il test consiste nel monitorare pyranine fluorescenza in funzione del tempo, mentre viene generato un gradiente protonico. A questo scopo, i campioni sono sottoposti, in alternativa all&#39;illuminazione (quindi protoni di pompaggio dalla BR è attivato) e poi a fluorescenza misurazione con l&#39;eccitazione e l&#39;emissione lunghezze d&#39;onda della pyranine (λ ex = 455 nm e λ em = 509 nm). La Figura 1 mostra un controllo rappresentativo ottenute con il test, in assenza di Mexa / MexB, verificare che il gradiente protonico generato dalla BR è reversibile. Dopo un ciclo di acidificazione, proteoliposomi vengono tenuti al buio per 45 minuti in modo che il BR di smettere di pompare protoni (protoni diffondono lentamente e passivamente attraverso doppi strati lipidici dopo il loro gradiente di concentrazione). Dopo questo tempo di recupero, l&#39;attivazione di BR è possibile, semplicemente illuminando di nuovo la stessa sospensione. Figura 2corrisponde ad una misura effettiva trasporto. Un controllo negativo con proteine ​​liposomi gratuite mostra che, come previsto, il pH è costante su di illuminazione (Figure 2A e 2B, cerchi arancioni). Tuttavia, proteoliposomi contenenti BR nelle loro membrane non pompa protonica, quindi il pH all&#39;interno diminuisce liposomi e un gradiente stabile è costruito (Figure 2A e 2B, piazze viola). Triangoli grigi e diamanti rossi (Figura 2A) rappresentano pH all&#39;interno di proteoliposomi contenenti BR e MexB, in presenza o in assenza di Hoechst 33342, rispettivamente. Osserviamo un&#39;attività substrato-indipendente dove il gradiente di protoni è solo parzialmente dissipata dal MexB contro-trasporto. Noi attribuiamo questa osservazione ad una attività basale di MexB. Al fine di testare l&#39;effetto di Mexa sull&#39;attività di MexB, Mexa stato aggiunto alla ricostituzione, prima in assenza di qualsiasi substrato ( <strong&gt; Figura 2B, diamanti blu). Ancora una volta, il gradiente protonico generato dalla BR è solo parzialmente dissipata. La misurazione effettiva trasporto è realizzata sul campione stesso. Precedentemente, il gradiente protonico deve essere inizializzato, il substrato deve essere aggiunto nella sospensione per raggiungere suo sito di legame della proteina. Per questo scopo la sospensione viene incubata al buio in presenza del substrato per 45 min. Al successivo illuminazione, si può vedere che il gradiente protonico generato dalla BR è ora totalmente dissipata dal MexAB (Figura 2B, triangoli verdi), in conseguenza del trasporto substrato dalla pompa. <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig1.jpg" /> . Figura 1 Reversibilità del gradiente protonico costruito da illuminazione BR: Pyranine fluorescence di proteoliposomi BR misurati in funzione del tempo. Da 0-15 min, BR pompe protoni a seguito dell&#39;attivazione luce. Da 15-60 min, proteoliposomi vengono incubati al buio, durante questo tempo, protoni passivamente muovono fuori dei liposomi fino a pH intravesicular e pH extravesicular sono uguali. Dal 60-75 min, BR è ancora funzionante e pompe di protoni su illuminazione. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50894/50894fig2.jpg" /> . Figura 2 Transport saggio: pyranine fluorescenza, convertito nel corrispondente variazioni di pH, in funzione del tempo A) pH all&#39;interno dei liposomi di controllo (cerchi arancione); pH all&#39;interno di proteoliposomi contenenti BR nella membrana (quadrati viola); pH all&#39;interno. di proteoliposomi contenenti BR, e MexB nella membrana senza Hoechst 33342 (rosso diamonds); pH interno del proteoliposomi contenenti BR e MexB nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli grigi) B) pH all&#39;interno dei liposomi di controllo (cerchi arancioni);. pH all&#39;interno del proteoliposomi contenenti BR nella membrana (piazze viola); pH interno di proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana, senza Hoechst 33342 (diamanti blu); pH interno del proteoliposomi contenenti BR, MexB e MEXA nella membrana con Hoechst 33342 (triangoli verdi).

Vi presentiamo un protocollo per lo studio in vitro delle pompe di efflusso da Pseudomonas aeruginosa. Questo protocollo consente la generazione di un robusto, reversibile e regolabile gradiente protonico all&#39;interno della membrana del liposoma e quindi dovrebbe essere adattabile a qualsiasi proteina di membrana eccitato dalla forza protomotive.

In vitro Indagine della MexAB Efflux pompa da Pseudomonas aeruginosa

There is an emerging scientific need for reliable tools for monitoring membrane protein transport. We present a methodology leading to the reconstitution ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di studiare il FLX pump me AB di Pseudomonas aosa utilizzando un test funzionale basato sulla ricostituzione delle proteine di membrana. Nei liposomi. Ciò si ottiene esprimendo e purificando prima le proteine di membrana, le proteine di membrana B e batteriche mescolate e la rodina batterica nei batteri vengono quindi estratte dalle membrane e purificate pure mediante cromatografia di affinità.Il secondo passo consiste nel preparare i liposomi combinando un film lipidico essiccato con un tampone contenente purina, che porta alla formazione di vescicole multilam. Dopo la sonicazione, i liposomi vengono estrusi per ottenere una popolazione omogenea di liposomi. Successivamente, le proteine della membrana detergente e quindi le perle di polistirene vengono aggiunte alla soluzione liposomiale.Le code idrofobiche del detergente si assorbono sulle perle di polistirene, consentendo alle proteine della membrana di allentare il nastro detergente e inserirsi nella membrana del liposoma. L'ultimo passaggio è la rimozione della purina non incapsulata Facendo scorrere i liposomi della protea su una colonna di desalinizzazione, i liposomi di prot grandi raggiungono il fondo della colonna molto più velocemente della purina non incapsulata, che rimane legata nella parte superiore della colonna. Infine, i liposomi protali vengono raccolti e la loro fluorescenza viene utilizzata per studiare l'attività di Mex AB attraverso la variazione del pH creata dall'illuminazione dell'opsina batterica.Le pompe Rodin Effects sono trasportatori che promuovono la resistenza agli antibiotici grazie al riconoscimento e al trasporto di un'ampia gamma di substrati di tutte le famiglie di antibiotici, c'è un urgente bisogno di nuovi e affidabili test di attività in vitro per gli effetti delle proteine di membrana. Trasportatori. Infatti, tali saggi offrirebbero nuove intuizioni sui meccanismi molecolari di trasporto e aiuterebbero lo screening farmacologico di nuovi potenziali candidati inibitori. Ci concentriamo sul mix a mix, B-O-P-R-M, eFlex Perm di Pseudomona gin.Presentiamo le consulenze tecniche e il metodo necessario per soddisfare tre requisiti per la progettazione di un efficiente test funzionale in vitro per la miscela di una pompa FFL B, compresa la costituzione della proteina in una membrana, l'uso del compartimento chiuso necessario per il trasporto vettoriale del substrato, una fine mostra di canne fumarie e muore che evita l'effetto artefatto dovuto alla natura adro del substrato e la generazione di un gradiente proteico necessario per la miscela AB a funzione. Il punto di forza del nostro test è il modo in cui generiamo un gradiente pro riproducibile e reversibile per creare un pH delta che chiamiamo batteri indigeni o VR con la miscela AB in una membrana liposomiale. BR è una proteina di membrana purificata dalla membrana viola di aob salinium allic Marin gram-negativo, aans aerobi obbligati.Dopo l'illuminazione, questa proteina pompa attivamente le proteine. Pertanto, se il BR è costituito insieme alla proteina nel liposoma, l'eliminazione del liposoma creerà un pH delta dovuto al br, che pompa le proteine all'interno dei liposomi. La preparazione di materiale proteico puro e stabile è di primaria importanza.La procedura di purificazione delle proteine di membrana rende B è stata ben descritta in una pubblicazione J ovy precedentemente filmata, così come nel protocollo di testo che accompagna questo video in cui si può trovare anche una descrizione della purificazione di una miscela proteica di membrana A Per preparare la Rodina batterica da Halabach Salinium coltivare cellule di salinio Halabach sotto illuminazione a 37 gradi Celsius per 10 giorni. In un mezzo di crescita liquido, distruggere le cellule dializzando contro l'acqua deionizzata. Purificare la membrana viola con una sfumatura di saccarosio dal 30 al 40%.Successivamente, solubilizzare la sospensione di membrana con glucocida ottale al 2%. Sono state 24 ore a 37 gradi Celsius. Proteggi il tubo dalla luce avvolgendolo in un foglio di alluminio.Stimare la concentrazione di batteri solubilizzati o dosina utilizzando il coefficiente di estinzione elencato nel protocollo di testo appena prima della ricostituzione. Ultracentrifugare l'opsina batterica solubilizzata per eliminare i lipidi e non solubilizzare le proteine. Per preparare i liposomi in un altoparlante di vetro, pesare 1,5 milligrammi di colesterolo conservato in polvere e aggiungere 400 microlitri di diolo fosfatidilcolina o DOPC disciolta in cloroformio in un becher di vetro, asciugarli sotto vuoto per almeno un'ora in un becher di vetro appena prima della manipolazione.Il rapporto molare DOPC/colesterolo risultante è di 3,3 a uno. Dopo che hanno asciugato idratare i lipidi con un millilitro di tampone hebes, la sospensione dovrebbe apparire turd. A questo punto, riscaldare la soluzione per 10 minuti a 37 gradi Celsius sonicare per 10 minuti a 40 watt con 32° impulso alternato, 32° ciclo di pausa a temperatura ambiente, la sospensione dovrebbe apparire limpida.In questa fase, l'aspetto più critico della procedura è ottenere una sospensione stretta e monodispersa di liposomi. A tal fine, prestiamo la massima attenzione nell'impostazione del dispositivo ad anello aggiuntivo in modo che non si verifichino perdite. Inoltre, puliamo il dispositivo molto meticolosamente dopo ogni utilizzo.Per ottenere una popolazione mono dispersa di liposomi, eseguire due cicli di estrusione per ogni ciclo. Passare la sospensione liposomica attraverso il filtro almeno 11 volte. Per il primo ciclo, utilizzare una dimensione dei pori della membrana di 200 nanometri e per il secondo ciclo, una dimensione dei pori della membrana di 100 nanometri.A questo punto, è possibile eseguire misure di diffusione dinamica della luce per verificare l'omogeneità della sospensione. Di seguito è riportato un risultato tipico di questo passaggio. Le proteine di membrana possono essere ricostituite in liposomi grazie all'effetto solubilizzante dei detergenti.I liposomi solubilizzati vengono incubati con la proteina di membrana solubilizzata detergente e la formazione della protea. I liposomi sono innescati dalla rapida eliminazione del detergente con perle di polistirene. Per incorporare le proteine, aggiungere 28 milligrammi di tritton X 100 e incubare per una notte a quattro gradi Celsius.Aggiungere la proteina solubilizzata del detergente, compresi i batteri opsina Mex B e Mex A ai liposomi solubilizzati e incubare per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Aggiungere perline di polistirene precedentemente attivate. Aggiungere un rapporto ape/detersivo di 30 a uno e incubare per cinque ore al buio a temperatura ambiente.Agitando delicatamente, purificare la proteina dei liposomi di protia e i substrati liberi utilizzando una colonna di desalinizzazione PD 10 bilanciata con il tampone Hess. Per verificare che sia il Mex B che l'opsina batterica siano stati ricostituiti in liposomi, purificare la sospensione liposomica di protea su un gradiente discontinuo di saccarosio. Depositare delicatamente il proteosoma su un gradiente di saccarosio a cinque strati.Quindi ultracentrifugare per 17 ore a centinaia di migliaia di G dopo l'ultraificazione, le proteine aggregate si trovano sul fondo della provetta mentre le proteine solubilizzate con detergente non incorporate si trovano nella parte superiore della provetta. Protea, liposomi e liposomi si trovano alle interfacce del saccarosio che corrispondono alla loro densità intrinseca. I liposomi vuoti vengono recuperati più in alto nel gradiente rispetto ai liposomi prot.Raccogliere attentamente le varie frazioni di gradiente prima di analizzarle con il sodio dyl solfato. Elettroforesi su gel di poliacrilammide mediante colorazione kumasi o western blotting. Esegui misure di fluorescenza a 25 gradi Celsius utilizzando un fluorimetro spettrale, consentendo misurazioni a doppia lunghezza d'onda.Alternare i periodi di illuminazione per attivare la rodina batterica caratterizzata da lunghezze d'onda di eccitazione ed emissione di 550 nanometri con misure di fluorescenza purinica, che sono caratterizzate da una lunghezza d'onda di eccitazione di 455 nanometri e una lunghezza d'onda di emissione di 509 nanometri per due secondi. Impostare le larghezze di banda di eccitazione ed emissione su cinque nanometri. Eseguire le misure in presenza di 50 liny nanomolari per prevenire la formazione di un potenziale di membrana inverso.Delta sigh qui mostrato è un controllo rappresentativo ottenuto con il saggio in assenza di Mex a, Mex B, verificando che il gradiente protonico generato dall'opsina batterica dei bastoncelli è reversibile. Dopo un ciclo di acidificazione, i liposomi di Oreo vengono tenuti al buio per 45 minuti in modo che l'opsina batterica smetta di pompare protoni. Dopo questo tempo di recupero, l'attivazione dell'opsina batterica è possibile semplicemente illuminando la stessa sospensione.Anche in questo caso, una misurazione del trasporto reale mostra che un controllo negativo con liposomi privi di proteine ha un pH costante all'illuminazione come previsto. Tuttavia, i liposomi di protea contenenti batteri o opsina nelle loro membrane pompano protoni. Pertanto, il pH all'interno dei liposomi diminuisce e si crea un gradiente stabile.I triangoli grigi rappresentano il pH all'interno dei liposomi di protea contenenti batteri o opsina e mex B in presenza di colorante hoax. 3, 3, 3, 4, 2. Mentre i diamanti rossi rappresentano il pH in assenza del colorante, si osserva un'attività indipendente dal substrato A dove un gradiente protonico è solo parzialmente dissipato dal controtrasporto di Mex B, che è attribuito a un'attività basale di Mex B.In al fine di testare l'effetto di mex A sull'attività di Mex b Mex A è stato aggiunto per primo alla ricostituzione.In assenza di qualsiasi substrato, ancora una volta, il gradiente protonico generato dall'opsina batterica viene dissipato solo parzialmente. La misura del trasporto effettivo viene realizzata sullo stesso campione e il protone viene inizializzato a rein, e il substrato viene aggiunto nella sospensione per raggiungere il suo sito di legame nella proteina. Dopo la successiva illuminazione, si può vedere che il gradiente di protoni generato dall'opsina batterica è ora totalmente dissipato da Mex AB come conseguenza del trasporto del substrato da parte della pompa, È importante tenere presente che l'esatta condizione necessaria per adattare questo protocollo ad un'altra proteina potrebbe variare da quanto descritto qui.È necessario prestare attenzione all'ottimizzazione dei seguenti parametri: qualità della purificazione, efficienza del detergente, desorbimento del detersivo della fase solubilizzante, composizione lipidica e rapporto lipidi/proteine. Inoltre, la temperatura e i periodi di incubazione tendono a influenzare tutti questi parametri. Il nostro protocollo apre la strada verso una migliore comprensione dell'attività del mix di pompe flix r e d B. Tuttavia, se è stato venduto specificamente per il trasportatore r e d, questo metodo potrebbe essere adattato a qualsiasi trasportatore di spam FFL attivato da PMF.

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