Analisi quantitativa e caratterizzazione delle lesioni aterosclerotiche nel seno aortico murino

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare e quantificare le lesioni aterosclerotiche nel seno aortico miocardico. Ciò si ottiene sezionando prima un cuore estratto al fine di separare la porzione apicale e localizzare il seno aortico. Successivamente, i blocchi di paraffina vengono preparati con la parte apicale lavorata del cuore.

Quindi il seno aortico viene sezionato e montato su vetrini. Infine, le sezioni di tessuto vengono colorate. In definitiva, è possibile ottenere risultati che mostrano diverse dimensioni e composizioni delle lesioni aterosclerotiche attraverso l'analisi istochimica e immunoistochimica.

A dimostrare la procedura sarà Daniel Venga penal, uno studente laureato del mio laboratorio. Il Comitato Etico per la Ricerca Animale della McMaster University ha pre-approvato tutte le procedure qui descritte dopo aver anestetizzato un topo doppio negativo LDLR ed estratto il sangue eutanasia e ripararlo prima di isolare il cuore secondo il protocollo di testo, utilizzare un bisturi per eseguire un taglio trasversale sul cuore perpendicolare all'aorta ascendente. Metti la parte apicale o superiore del cuore in una cassetta da inclusione e immergila nella formina.

Quindi posizionare la cassetta in un processatore di tessuti e processarla per una notte. Utilizzando il programma descritto nel protocollo di testo per gli stampi istologici, sciogliere la cera di paraffina durante la notte a 62 gradi Celsius. Posizionare ogni tessuto di processo in uno stampo istologico profondo, assicurandosi che l'interfaccia del cuore tocchi la base dello stampo, quindi versare la cera di paraffina fusa per riempire completamente lo stampo.

Utilizzare una cassetta di plastica etichettata per coprire lo stampo. Dopo aver raffreddato gli stampi su ghiaccio o su una superficie fredda, separare il blocco dallo stampo per sezionare l'aorta. Posizionare il blocco nel supporto del campione del microtomo in modo che possa essere sezionato dall'interno verso la parte superiore del cuore.

Regolare il microtomo a 10 micron e sezionare il cuore. Raccogli le sezioni su un vetrino ed esaminale al microscopio ottico per determinare la posizione e l'orientamento. Il seno dovrebbe apparire come tre basi valvolari bipartite con levette attaccate.

Quando una o due valvole del seno aortico diventano evidenti, regolare l'angolo del blocco secondo necessità. Quando le valvole sono raggiunte, regolare il microtomo per tagliarlo da quattro a cinque micron. Montaggio delle prime 10 sezioni ciascuna nella parte superiore dei singoli vetrini, quindi il montaggio di ciascun gruppo successivo di 10 sezioni nella posizione successiva.

Sulle diapositive. Continuare a raccogliere le sezioni fino a quando non si osserva alcuna lesione aterosclerotica. Per colorare le sezioni con ematina ed eoina per visualizzare le lesioni, mettere i vetrini in un essiccatore d'aria per otto minuti.

Quindi deparare le sezioni usando lo xilene per lavarle quattro volte per tre minuti ciascuna. Lavare i vetrini in etanolo al 100% tre volte per tre minuti ciascuno. Poi 70% etanolo e 50% etanolo.

Tre volte per tre minuti ciascuna. Utilizzare acqua distillata per sciacquare i vetrini e poi immergerli. Ematina di MA per 15 minuti.

Lava e scorri. Acqua del rubinetto per cinque minuti. Quindi lavare e distillare l'acqua per cinque minuti dopo l'immersione in olio per uno o cinque minuti.

Lavare e distillare l'acqua tre volte per cinque minuti ciascuna. 50% di etanolo due volte per due minuti ciascuna. Quindi etanolo al 70% tre volte per due minuti ad ogni lavaggio ed etanolo al 100%.

Tre volte per due minuti ciascuna. Quindi lavare e xilene quattro volte per due minuti ciascuna. Utilizzare un mezzo di montaggio a base di xilene per montare le sezioni e acquisire immagini al microscopio ottico.

Utilizzare il software di imaging per identificare e quantificare le lesioni, che possono essere determinate a distanze specifiche dal seno aortico a intervalli di 40-50 micron, a seconda dello spessore delle sezioni, fare riferimento al protocollo di testo per la colorazione immunoistochimica e immunofluorescenza. LDLR di cinque settimane. I topi positivi sono stati alimentati con una dieta standard o una dieta ricca di grassi per 10 settimane prima che i loro cuori fossero fissati, isolati e sezionati come mostrato qui.

Quando i topi vengono alimentati con una dieta standard, lo sviluppo aterosclerotico è molto limitato e potrebbe non essere rilevabile a 15 settimane di otto. Una dieta ricca di grassi accelera significativamente l'aterogenesi in questo modello e induce la formazione di grandi lesioni avanzate contenenti nuclei acellulari cronici e cappucci fibrosi. Le lesioni aterosclerotiche possono essere ulteriormente caratterizzate dalla colorazione per la presenza di specifici tipi di cellule e fattori che definiscono gli stadi di sviluppo della lesione.

L'infiltrazione di monociti nell'intima rappresenta uno dei primi eventi dell'aterogenesi intima. I monociti si differenziano in macrofagi che inghiottono detriti cellulari e lipidi. I macrofagi gonfi di lipidi noti come cellule schiumogene creano una striscia di grasso nella parete dell'arteria vista qui.

Le cellule schiumogene dei macrofagi possono essere rilevate in tutte le fasi dello sviluppo della lesione colorandole con anticorpi contro specifici marcatori macrofagici come F quattro, 80 e MAC tre. Le cellule muscolari lisce vascolari o v SMC sono confinate allo strato mediale di un'arteria sana. Le VSC sono indotte a migrare e proliferare nell'intima durante lo sviluppo di una lesione avanzata.

Come si può vedere in questo pannello, le SMC V possono essere identificate mediante colorazione con un anticorpo contro l'alfa actina dopo il suo sviluppo. Questa tecnica ha permesso ai ricercatori nel campo delle malattie cardiovascolari di esplorare lo sviluppo e la progressione delle lesioni aterosclerotiche nei bastoncelli.