Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Questa procedura mira a simulare in vitro la barriera ematoencefalica mediante la coltura congiunta di astrociti e cellule endoteliali su lati opposti di una membrana porosa. Innanzitutto, ricoprire la superficie luminale della membrana porosa con una matrice extracellulare. Proteine come il collagene vengono posizionate nell'inserzione capovolta con un tubo di silicone esterno e un tappo di silicone interno per creare un pozzetto rimovibile al di sopra della superficie abluminale della membrana.

Ora seminare le cellule astrocitiche sull'inserzione capovolta in modo che aderiscano alla superficie abluminale. Successivamente rimuovere i tubi e posizionare l'inserzione nella sua orientazione normale all'interno di una pozzetta riempita di mezzo. Quindi seminare le cellule endoteliali nel compartimento luminale dell'inserzione e coltivarle in co-coltura con gli astrociti opposti.

In definitiva, il passaggio di traccianti fluorescenti o la registrazione della resistenza elettrica transendoteliale vengono utilizzati per misurare le variazioni di permeabilità della BEE in vitro in risposta a diversi agenti stimolanti. A dimostrare questa procedura sarà il dottor Barry Nigo, un ricercatore postdottorato nel mio laboratorio, che nel corso del suo dottorato ha sviluppato questo protocollo di semina modificato, da noi utilizzato per simulare la barriera ematoencefalica. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questa procedura dopo aver testato metodi di semina più grossolani, incontrando notevoli difficoltà dovute alla fuoriuscita del mezzo attraverso la pausa, nonché a volumi ridotti di mezzo.

Ciò ha determinato periodi di adesione degli astrociti brevi e insufficienti, che stiamo cercando di risolvere nel nostro protocollo. Posizionare gli inserti per coltura cellulare nelle pozzette di una piastra a 24 pozzetti. Quindi aggiungere 50 microlitri di collagene di ratto a 132 microgrammi per millilitro, al fine di rivestire la superficie luminale degli inserti, incubare tutta la notte in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius per rimuovere eventuali residui acidi, lavare entrambi i lati, abluminale e luminale, degli inserti con acqua doppio distillata.

Quindi capovolgere gli inserti e adattare delicatamente un breve pezzo di tubo in silicone elastico attorno al bordo della membrana porosa, creando sostanzialmente un nuovo pozzetto sopra la superficie abluminale, per sigillare il lato inferiore.

Preparare un tappo realizzato con un tubo di silicone sigillato a un'estremità con la punta tagliata di una provetta PCR da 0,2 millilitri. Utilizzando ora una pinzetta sterile, inserire il tappo di silicone nella cavità luminale e avanzarlo fino a raggiungere una distanza di circa uno-due millimetri dalla membrana. Successivamente, seminare 40.000 astrociti in 200 microlitri del loro mezzo di mantenimento direttamente nel pozzetto di silicone sopra la superficie della membrana abluminale.

Per monitorare lo stato di adesione degli astrociti, utilizzare una piastra standard a 96 pozzetti poiché presenta la stessa area superficiale dell'inserto da 6,5 millimetri e permette una più facile visualizzazione delle cellule mediante microscopia a contrasto di fase. Seminare un volume identico della sospensione cellulare di astrociti nella piastra a 96 pozzetti. Questa verrà monitorata nel tempo per determinare quando gli astrociti nella piastra a 96 pozzetti e, per estensione, nella membrana dell'inserto, si saranno sufficientemente aderiti da mantenere la sterilità.

Trasportare gli inserti assemblati posizionandoli tra due piastre a sei pozzetti per minimizzare l'esposizione all'aria non filtrata. Posizionare le cellule nell'incubatrice per consentire agli astrociti di aderire. Inserire anche la piastra di controllo a 96 pozzetti nell'incubatrice in questo momento.

Dopo circa quattro ore, controllare la piastra a 96 pozzetti di controllo per verificare se gli astrociti si sono adesi. In caso affermativo, riposizionare l'inserto nell'incubatore per colture cellulari. Rimuovere delicatamente il tubo di silicone esterno e i tappi.

Quindi reinserire i dispositivi nell'orientamento verticale normale in pozzetti contenenti 800 microlitri per pozzetto di mezzo di mantenimento per cellule endoteliali. Seminare 20.000 cellule endoteliali cerebrali in 200 microlitri sulla superficie luminale rivestita di collagene per una coltura in co-coltura per tre giorni in mezzo BEC senza alcun cambio di mezzo. Prima dell'esperimento.

Lavare i tubi e i tappi in silicone nell'etanolo prima dell'autoclavaggio per un uso successivo. Per stimolare la barriera ematoencefalica in vitro, sostituire prima il mezzo abluminale e luminale rispettivamente con 600 microlitri e 100 microlitri di mezzo BECS privo di siero. Aspirare il lavaggio luminale e sostituirlo con 100 microlitri di mezzo privo di siero contenente agenti stimolanti.

Se si induce la barriera ematoencefalica in vitro dal compartimento astrocitario, aspirare il mezzo abluminale e sostituirlo con 600 microlitri di mezzo privo di siero. Aggiungere agenti stimolanti e proseguire con i normali saggi di permeabilità paracellulari o transcellulari utilizzando traccianti marcati, al fine di stabilire un modello umano di barriera ematoencefalica a contatto. Astrocyti umani immortalizzati e cellule endoteliali cerebrali vengono coltivati su membrane porose da tre micron che permettono il passaggio dei piedi astrocitari in contatto con le cellule endoteliali.

Il metodo ha permesso un periodo ottimale e ininterrotto di semina di astrociti e BECs, che a loro volta si attaccano saldamente alla superficie porosa con una perdita cellulare minima e raggiungono la confluenza entro tre giorni dalla semina. Entrambi i tipi cellulari mantengono i marcatori specifici delle cellule sulle membrane porose, come indicato dai profili di espressione della proteina acida fibrillare gliale GFAP negli SVG e del fattore di von Willebrand VWF nei NECs.

In accordo con la caratteristica più fondamentale di un modello BBB a contatto, il NFE astrocitario può passare attraverso i pori di tre micron nel compartimento luminale. Pertanto, un contatto potenziale può esistere tra SVG e BES posizionati sui pori di questa dimensione. Inoltre, l'immagine al SEM indica che SVG e BBC erano in grado di crescere direttamente sopra i pori della membrana, un fenomeno che contribuisce artificialmente alla funzione di barriera fisica dei modelli BBB a contatto in vitro.

In questo studio, il modello umano di barriera ematoencefalica a contatto viene utilizzato per esplorare l'effetto dell'agente fibrinolitico TPAA sulla BEE. Questi studi in vitro confermano che l'TPA aumenta effettivamente la permeabilità della BEE integra in maniera dipendente dalla concentrazione e dal tempo, entrambi compresi in un intervallo farmacologicamente rilevante. Si osservano evidenti cambiamenti morfologici negli astrociti SVG sulle membrane porose dopo l'esposizione all'TPA, suggerendo che la risposta astrocitaria all'TPA sottenda l'apertura della BEE indotta dall'TPA.

Questo metodo ha svolto un ruolo fondamentale nella nostra ricerca, volta a studiare come la barriera ematoencefalica risponde al farmaco trombolitico TPAA utilizzato nei pazienti colpiti da ictus per sciogliere i coaguli sanguigni. Si tratta della prima dimostrazione di questo metodo in letteratura, e speriamo che altri ricercatori possano adottarlo per i propri scopi.