Migliorata metodo per la preparazione di un cell-based, Contact modello umano della barriera sanguigna del cervello

Questa procedura mira a una simulazione in vitro della barriera emato-encefalica mediante cocoltura di astrociti e cellule endoteliali sui lati opposti di una membrana porosa. Per prima cosa rivestire la superficie luminale della membrana porosa con una matrice extracellulare. Le proteine come il collagene si adattano all'inserto invertito con un tubo esterno in silicone e un tappo interno in silicone per creare un pozzetto rimovibile sopra la superficie abluminale della membrana.

Ora semina le cellule degli astrociti sull'inserto invertito in modo che aderiscano alla superficie abluminale. Quindi rimuovere il tubo e posizionare l'inserto nel suo orientamento normale all'interno di un pozzetto riempito di mezzo. Successivamente seminare le cellule endoteliali nel compartimento luminale dell'inserto e co-coltivare con gli astrociti opposti.

In definitiva, il passaggio di traccianti fluorescenti o la registrazione della resistenza elettrica transendoteliale viene utilizzato per misurare le variazioni di permeabilità nella BBB in vitro in risposta a vari agenti stimolanti. A dimostrare questa procedura sarà il signor Barry Nigo, un postdoc del mio laboratorio, che durante il corso del suo dottorato di ricerca, ha sviluppato questo protocollo di semina modificato che abbiamo utilizzato per simulare la barriera ematoencefalica. Abbiamo avuto un'idea di questa procedura dopo aver testato metodi di seduta più grezzi e aver avuto molta frustrazione con la perdita di fluido attraverso la pausa, così come piccoli volumi medi.

Ciò ha comportato periodi di posizionamento degli astrociti brevi e insufficienti, che stiamo cercando di affrontare nella nostra procedura. Posizionare gli inserti di coltura tissutale nei pozzetti di una piastra a 24 pozzetti. Quindi aggiungere 50 microlitri di collagene di ratto da 132 microgrammi per millilitro, uno per rivestire la superficie luminale degli inserti, incubare per una notte in un'incubatrice umidificata a 37 gradi Celsius per rimuovere qualsiasi residuo di acido, lavare sia il lato abluminale che quello luminale degli inserti con acqua distillata doppia.

Quindi capovolgere gli inserti e inserire delicatamente un breve pezzo di tubo elastico in silicone attorno al bordo della membrana porosa. In sostanza, si tratta di creare un nuovo pozzo sopra la superficie abluminale. Per sigillare la parte inferiore.

Preparare un tappo fatto di tubo di silicone sigillato a un'estremità con la punta tagliata di una provetta PCR da 0,2 millilitri. Ora, utilizzando una pinza sterile, inserire il tappo in silicone nella cavità luminale e farlo avanzare fino a raggiungere circa uno o due millimetri dalla membrana. Successivamente, 40.000 astrociti in 200 microlitri del loro mezzo di mantenimento direttamente nel silicone ben al di sopra della superficie della membrana abluminale.

Per monitorare lo stato di aderenza degli astrociti, utilizzare una piastra standard da 96 pozzetti in quanto ha la stessa superficie dell'inserto da 6,5 millimetri e lo consente. Visualizzazione più semplice delle cellule mediante seme di microscopia a contrasto di fase, un volume identico della sospensione di cellule astrocitarie nella piastra otto a 96 pozzetti. Questo sarà monitorato nel tempo per determinare quando gli astrociti nel pozzetto 96 e, per estensione, nella membrana dell'inserto hanno aderito a sufficienza per mantenere la sterilità.

Trasportare gli inserti assemblati tra due piastre a sei pozzetti per ridurre al minimo l'esposizione all'aria non filtrata. Posizionare le cellule nell'incubatrice per consentire agli astrociti di aderire. Posizionare anche la piastra di controllo 96 Well nell'incubatrice in questo momento.

Dopo circa quattro ore, controllare bene il controllo 96 per vedere se gli astrociti hanno aderito. In tal caso, trasferire nuovamente l'inserto nella cappa di coltura tissutale. Rimuovere delicatamente il tubo esterno in silicone e i tappi.

Quindi riportare gli inserti al normale orientamento verticale in pozzetti contenenti 800 microlitri per pozzetto di terreno di mantenimento delle cellule endoteliali. Vedere 20.000 cellule endoteliali cerebrali in 200 microlitri sulla co-coltura della superficie luminale rivestita di collagene per tre giorni in terreno BEC senza alcun cambiamento del terreno. Prima della sperimentazione.

Lavare i tubi e i tappi in silicone con etanolo prima di sterilizzarli in autoclave per un uso successivo. Per stimolare la barriera ematoencefalica in vitro, in primo luogo, sostituire il terreno abluminale e luminale con 600 microlitri e 100 microlitri di terreno bes privo di siero rispettivamente. Aspirare il lavaggio luminale e sostituirlo con 100 microlitri di terreno privo di siero contenente agenti stimolanti.

Se si induce la BBB in vitro dal compartimento astrocitico, aspirare il mezzo abluminale e sostituirlo con 600 microlitri di siero libero. Il terreno contenente agenti stimolanti continua con i saggi standard di permeabilità paracellulare o transcellulare dei traccianti di marcatura al fine di stabilire un modello di barriera emato-encefalica di contatto umano. Gli astrociti umani immortalizzati e le cellule endoteliali cerebrali sono coltivati su membrane porose da tre micron che consentono il passaggio degli astrociti e delle zampe per il contatto con le cellule endoteliali.

Il metodo ha permesso un periodo di semina ottimale e ininterrotto di astrociti e bec, che a loro volta si attaccano fortemente alla superficie porosa con una perdita cellulare minima e crescono in cofluenza entro tre giorni. Dopo la semina. Entrambi i tipi di cellule mantengono i loro marcatori specifici cellulari sulle membrane porose, come indicato dai modelli di espressione della proteina acida fibrillare gliale GFAP nelle SVG e nelle NEC VWF del fattore von Vand.

Coerentemente con la caratteristica più fondamentale di un modello di BBB a contatto, l'NFE astrocitico può passare attraverso i pori di tre micron nel compartimento luminale. Pertanto, può potenzialmente esistere un contatto tra SVG e BES situati su pori di questa dimensione. Inoltre, l'imaging SEM indica che SVG e BBC erano in grado di crescere direttamente sopra i pori della membrana, un fenomeno che contribuisce artificialmente alla funzione di barriera fisica dei modelli di contatto BBB in vitro.

In questo studio, il modello di BBB a contatto umano viene utilizzato per esplorare l'effetto dell'agente fibrinolitico TPAA sulla BBB. Questi studi in vitro confermano che il TPA ha effettivamente aumentato la permeabilità della BBB intatta in modo dipendente dalla concentrazione e dal tempo, entrambi all'interno di un intervallo farmacologicamente rilevante. Drammatici cambiamenti morfologici degli astrociti SVG sono evidenti sulle membrane porose dopo l'esposizione al TPA, suggerendo che la risposta astrocitaria al TPA è alla base dell'apertura della BBB indotta dal TPA.

Questo metodo ha svolto un ruolo chiave nella nostra ricerca, che mirava a studiare come la barriera ematoencefalica risponde al farmaco trombolitico TPAA utilizzato nei pazienti con ictus per sciogliere i coaguli di sangue. Si tratta della prima dimostrazione di questo metodo in letteratura, e speriamo che altri ricercatori possano adottarlo per i propri scopi.