Name: Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Lernen Sie eine hochdurchsatzfähige Durchflusszytometrie-Methode zur Detektion neuronaler Anti-D2R- oder NMDA-R-Antikörper in Patientenproben. Diese zellbasierte Assay-Technik ermöglicht eine schnelle, quantitative Analyse großer Kohorten.

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Diese Arbeit wurde von der Australian National Health and Medical Research Council, Star Scientific Foundation (Australien), Tourette-Syndrom Association (USA) unterstützt wird, Trish Die Multiple Sklerose Forschungsgemeinschaft und Multiple-Sklerose-Forschung Australien, Petre Foundation (Australien), die Rebecca L. Cooper Medical Research Foundation (Australien). Wir danken allen Patienten und Familienmitglieder, die Proben für unsere Studie zur Verfügung gestellt.

<html> 1. Subklonierung Strategie zur pIRES2-EGFP Vektor Encoding D2R oder NMDAR Construct <ol><li> Erhalten vollständigen cDNA-Klon des menschlichen D2R oder NMDAR-Untereinheit 1 (NR1). </li><li> Wähle einen Expressionsvektor, wie pIRES2-EGFP, die für die Expression des Transmembranproteine ​​mit Enhanced Green Fluorescent Protein (GFP)-Reporter unter der Kontrolle einer internen Ribosomen-Eintrittsstelle (IRES), so dass die beiden Antigene und GFP in koexprimiert werden Zellen getrennt. </li><li> Subklonieren menschlichen cDNA innerhalb pIRES2-EGFP-Vektor. <ol><li> Um subklonieren cDNA, entsprechende Restriktionsenzymen (zB NheI und XhoI Menschen D2R cDNA). </li><li> Ligats Schnitt cDNA-Insert in eingeschränkten pIRES2-EGFP-Vektor. </li><li> Sequenz ligiert pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor zu überprüfen, ob der Vektor der richtigen Reihenfolge enthält. </li><li> Entschlacken und verstärken pIRES2-EGFP D2R oder NMDAR Vektor für die spätere Verwendung in der Transfektion. </li></ol></li></ol>itel &quot;&gt; 2. HEK293 Zelltransfektion für Expression neuronaler Antigen <ol><li> Kultur HEK293-Zellen in Gewebekulturflaschen mit frischem Dulbecco-modifiziertem Eagle-Medium (1 ×) (DMEM) komplett mit 4,5 g / l D-Glucose, L-Glutamin und 110 mg / l Natriumpyruvat, das mit 10% fötalem Rinderserum (FBS) ergänzt, 2 mM Glutamax und 50 ug / ml Gentamicin. </li><li> Nehmen HEK293-Zellen unter Verwendung von Trypsin und Transfer zu einem konischen Rohr. <ol><li> Waschen Zellen durch Zentrifugieren bei 250 g für 6 min und Zellpellet in frischem Komplett DMEM. </li></ol></li><li> Zählen Sie die Zellen und Saatgut 6-Well-Platten bei etwa 8 x 10 5 Zellen / Vertiefung und die Kultur über Nacht in 2 ml DMEM bei 37 ° C und 5% CO 2 im Brutschrank. </li><li> Nachdem sie etwa 70% Konfluenz erreicht haben, zu transfizieren die HEK293-Zellen mit pIRES2-EGFP NR1 (HEK293 NMDAR +-Zellen), pIRES2-EGFP D2R (HEK293 D2R +-Zellen) und pIRES2-EGFP (HEK293 CTL-Zellen; Vektorregelung) wie folgt.Halten Sie einige nicht-transfizierten HEK293-Zellen für die Entschädigung später. <ol><li> Bereiten Sie das erforderliche Volumen der Transfektion Mischung, die 2,5 ug DNA wurden 200 ul 0,9% Natriumchlorid und 4 g / ml Polyethylenimin / gut (jeweils 2 ml frisches Voll DMEM). </li><li> Unmittelbar verwirbeln die Mischung für 10 sec und bei Raumtemperatur (RT) für 10 min, bevor Volumen der Transfektion Mischung in die entsprechenden Vertiefungen. </li><li> Die Platte, wickeln Sie die Seiten mit Parafilm und Zentrifugieren bei 280 g für 5 min zur Transfektion von Zellen unterstützen. </li><li> Entfernen der Parafilm und dann im Inkubator setzen die Kultur bei 37 ° C. </li><li> 18 Stunden später ersetzen Kulturmedien mit frischen kompletten DMEM und pflegen in einer anderen Kultur für 72 Stunden. </li><li> Optional: 72 Stunden nach der Transfektion transfiziert Zellen durch Kultur in komplettem DMEM mit 250 ug / ml Geneticin ergänzt ausgewählt werden, um einen polyklonalen stabilen Transfektanten zu erhalten. </li></ol></li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 3. Durchflusszytometrie zellbasierten Assay zum Nachweis von Antikörpern gegen neuronale Antigene Oberflächen <ol><li> Lösen HEK293 NMDAR + HEK293 + D2R und HEK293 CTL-Zellen durch Inkubation mit 500 &amp;mgr; l / Vertiefung Versene für ca. 5 min bei 37 ° C. <ol><li> Resuspendieren in 2ml/well PBS (Ca-2 + / Mg 2 +) mit 2% FBS (PBS / FBS) und die Lösung in einen 15 ml oder 50 ml konischen Röhrchen ergänzt. </li><li> Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 250 x g für 6 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 15-50 ml PBS / FBS. Wiederholen Wasch 2x. </li><li> Zählen Sie die Zellen und dann in PBS / FBS Resuspendieren in 1 x 10 6 Zellen / ml. </li></ol></li><li> Entwerfen Sie die 96-Loch-Vorlage für die Durchflusszytometrie Erwerb, bedenkt, dass HEK293 D2R + oder HEK293 NMDAR + Zellen sowie HEK293 CTL-Zellen müssen mit jeder Patientenprobe oder primären Antikörper inkubiert werden. </li><li> Samenzellen in einem V-Boden, Platte mit 96 Vertiefungen mit 50.000 Zellen / well nach der Durchflusszytometrie Erfassungsschablone. </li><li> Pellet die Zellen durch Zentrifugieren der 96-Well-Platte bei 450 xg für 5 min und entfernen Sie vorsichtig den Überstand mit Hilfe eines elektronischen oder manuellen Mehrkanalpipette, Kippen der Platte auf einem Winkel und kümmert sich nicht um das Zellpellet abzusaugen. </li><li> Inkubieren HEK293 D2R + HEK293 + NMDAR und HEK293-Zellen, CTL für 1 h bei RT im Dunkeln mit: <ol><li> Serielle Verdünnungen des primären Antikörpers, um Antigen-Oberflächenexpression zu beurteilen. </li><li> Patientenproben, um Antikörper zu erkennen. </li></ol></li><li> Verwenden Sie geeignete Durchflusszytometrie Kompensationskontrollen, zB. ungefärbten transfizierten HEK293-Zellen, HEK293-Zellen GFP + (AF647 -) und nicht-transfizierte HEK293-Zellen AF647 + (GFP). </li><li> Waschen der Zellen durch Zentrifugation bei 450 × g für 5 Minuten und Resuspendieren des Zellpellets in 170 &amp;mgr; l PBS / FBS. Wiederholen Waschschritt noch zweimal. </li><li> Zellen Inkubation für 1 hr bei RT im Dunkeln mit 1:100-Verdünnung von AF647-konjugierten sekundären Antikörper (Anti-Human-IgG für Patientenserum und Anti-Maus-IgG-anti-NR1-oder Anti-D2R primäre Antikörper). </li><li> Dreimal Waschen Sie die Zellen, wie in Schritt 3.7, und resuspendieren in 35 ul PBS / FBS für die Durchflusszytometrie Zell Akquisition. </li><li> Die Hochdurchsatz-Sampler (HTS) auf dem Durchflusszytometer (BDLSRII) ein. </li><li> Erwerben 10.000 Events / Well nach der Durchflusszytometrie Erwerb Vorlage. </li><li> Export und Analyse von Daten für die Analyse unter Verwendung einer Durchflusszytometrie-Software-Paket, wie FlowJo v7.5: <ol><li> Zunächst Tor die Live-HEK293-Zellen auf Basis von vorne (Größe) und Seite (Granularität), der zerstreut. </li><li> Weitere Live-Gate HEK293-Zellen auf der Grundlage hoher GFP-Positivität, nur die transfizierten Zellen zu analysieren. </li><li> Die mittlere Fluoreszenzintensität (MFI) der AF647 Kanal innerhalb der Live GFP-positiven Zellen. </li><li> Exportieren von Daten in Excel oder Prism für die Analyse: <ol><li> Grundstück concentrations des primären Antikörpers (anti-NMDAR oder Anti D2R-Antikörper) gegen den MFI erhalten aus den Zellen mit diesen Antikörpern inkubiert. </li><li> Für jeden Patienten und Kontrollprobe, bestimmen die ΔMFI durch Subtrahieren der MFI des CTL HEK293 Zellen aus der MFI des HEK293 D2R + + NMDAR oder HEK293 Zellen. </li><li> Berechnen Sie die Schwelle von Antikörper-Positivität von über dem Mittelwert ΔMFI des Steuer Kohorte um drei Standardabweichungen. </li><li> Grundstück einzelnen Proben nach ihren Serum Typ gruppiert in einem Diagramm darstellen und die Schwelle als eine Zeile. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Lancaster, E., Martinez-Hernandez, E., Dalmau, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+antibodies+to+synaptic+and+neuronal+cell+surface+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and antibodies to synaptic and neuronal cell surface proteins.</a> Neurol. 77, 179-189 (2011).</li>
<li>Vincent, A., Bien, C. G., Irani, S. R., Waters, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Autoantibodies+associated+with+diseases+of+the+CNS%3A+new+developments+and+future+challenges%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Autoantibodies associated with diseases of the CNS: new developments and future challenges.</a> Lancet Neurol. 10, 759-772 (2011).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anti-NMDA-receptor+encephalitis%3A+case+series+and+analysis+of+the+effects+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Anti-NMDA-receptor encephalitis: case series and analysis of the effects of antibodies.</a> Lancet Neurol. 7, 1091-1098 (2008).</li>
<li>Dalmau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Paraneoplastic+anti-N-methyl-D-aspartate+receptor+encephalitis+associated+with+ovarian+teratoma%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Paraneoplastic anti-N-methyl-D-aspartate receptor encephalitis associated with ovarian teratoma.</a> Ann Neurol. 61, 25-36 (2007).</li>
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<li>Lancaster, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+the+GABA%28B%29+receptor+in+limbic+encephalitis+with+seizures%3A+Case+series+and+characterisation+of+the+antigen%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to the GABA(B) receptor in limbic encephalitis with seizures: Case series and characterisation of the antigen.</a> Lancet Neurol. 9, 67-76 (2010).</li>
<li>Lai, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AMPA+receptor+antibodies+in+limbic+encephalitis+alter+synaptic+receptor+location%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">AMPA receptor antibodies in limbic encephalitis alter synaptic receptor location.</a> Ann Neurol. 65, 424-434 (2009).</li>
<li>Irani, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+Kv1+potassium+channel-complex+proteins+leucine-rich%2C+glioma+inactivated+1+protein+and+contactin-associated+protein-2+in+limbic+encephalitis%2C+Morvan%E2%80%99s+syndrome+and+acquired+neuromyotonia%5BTitle%5D)+AND+%22Brain%22%5BJournal%5D)">Antibodies to Kv1 potassium channel-complex proteins leucine-rich, glioma inactivated 1 protein and contactin-associated protein-2 in limbic encephalitis, Morvan’s syndrome and acquired neuromyotonia.</a> Brain. 133, 2734-2748 (2010).</li>
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<li>Titulaer, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Treatment+and+prognostic+factors+for+long-term+outcome+in+patients+with+anti-NMDA+receptor+encephalitis%3A+an+observational+cohort+study%5BTitle%5D)+AND+%22Lancet+Neurol%22%5BJournal%5D)">Treatment and prognostic factors for long-term outcome in patients with anti-NMDA receptor encephalitis: an observational cohort study.</a> Lancet Neurol. 12, 157-165 (2013).</li>
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<li>Waters, P. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serologic+diagnosis+of+NMO%3A+a+multicenter+comparison+of+aquaporin-4-IgG+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Serologic diagnosis of NMO: a multicenter comparison of aquaporin-4-IgG assays.</a> Neurol. 78, 665-671 (2012).</li>
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<li>Probstel, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+MOG+are+transient+in+childhood+acute+disseminated+encephalomyelitis%5BTitle%5D)+AND+%22Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to MOG are transient in childhood acute disseminated encephalomyelitis.</a> Neurol. 77, 580-588 (2011).</li>
<li>Cho, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((N-terminal+Region+of+Dopamine+D2+Receptor%2C+a+Rhodopsin+Family+GPCR%2C+Regulates+Proper+Integration+into+Plasma+Membrane+and+Endocytic+Routes%5BTitle%5D)+AND+%22British+journal+of+pharmacology%22%5BJournal%5D)">N-terminal Region of Dopamine D2 Receptor, a Rhodopsin Family GPCR, Regulates Proper Integration into Plasma Membrane and Endocytic Routes.</a> British journal of pharmacology. , (2011).</li>
<li>Zhou, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+pathogenic+antibody+response+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+multiple+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Identification of a pathogenic antibody response to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in multiple sclerosis.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103, 19057-19062 (2006).</li>
<li>Brilot, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibodies+to+native+myelin+oligodendrocyte+glycoprotein+in+children+with+inflammatory+demyelinating+central+nervous+system+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Antibodies to native myelin oligodendrocyte glycoprotein in children with inflammatory demyelinating central nervous system disease.</a> Ann Neurol. 66, 833-842 (2009).</li>
<li>Boronat, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encephalitis+and+Antibodies+to+Dipeptidyl-Peptidase-Like+Protein-6%2C+a+Subunit+of+Kv4.2%5BTitle%5D)+AND+%22Potassium+Channels.+Ann+Neurol%22%5BJournal%5D)">Encephalitis and Antibodies to Dipeptidyl-Peptidase-Like Protein-6, a Subunit of Kv4.2.</a> Potassium Channels. Ann Neurol. 73, 120-128 (2013).</li>
<li>Hinson, S. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aquaporin-4-binding+autoantibodies+in+patients+with+neuromyelitis+optica+impair+glutamate+transport+by+down-regulating+EAAT2%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">Aquaporin-4-binding autoantibodies in patients with neuromyelitis optica impair glutamate transport by down-regulating EAAT2.</a> J. Exp. Med. 205, 2473-2481 (2008).</li>
</ol>

Interessenkonflikt: Ein Patent wurde von FB und RCD (University of Sydney) behauptet D2R als Ziel für die Autoantikörper eingereicht.

Dieser Aufsatz beschreibt eine neuartige Anwendung der Durchflusszytometrie Live-Assay auf Zellbasis, um Antikörper, die gegen spezifische Zelloberflächen neuronale Proteine ​​unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erfassen. Mit dieser Technik berichten wir, dass eine Untergruppe von Patienten mit Autoimmun ZNS-Erkrankungen betroffen sind, Serum-Antikörper an die Oberfläche oder in Oberflächen NMDAR D2R. Wesentliche Schritte für eine optimale Antikörpernachweis unter Verwendung di...

In den letzten Jahren haben die Autoimmun Formen des zentralen Nervensystems (ZNS) identifiziert worden. Es hat sich gezeigt, dass diese Krankheiten assoziiert sind und durch die Anwesenheit von Autoantikörpern definiert. Diese Antikörper binden an neuronale Rezeptoren oder synaptische Proteine ​​in 1,2 Neurotransmission beteiligt ist. Unterschiedliche Antigene erkannt wurden, wie N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor (NMDAR) 3-5, γ-Aminobuttersäure-Rezeptor (GABA)-Rezeptor 6, α-Amino-3-hydroxy-5-methyl-4- isoxazolepropionic (AMPA)-Rezeptor 7, spannungsabhängigen Kaliumkanals (VGKC) assoziierte Proteine: Leucin-reichen Gliom-aktivierte Protein-1 (LGL-1) und Contactin-assoziiertes Protein 2 (capsr2) 8,9-, Glutamat-Rezeptor 5,10 und Dopamin-2-Rezeptor (D2R) 11. In der Vergangenheit waren diese Autoimmun ZNS-Störungen (vor allem genannt Enzephalitis) oft nicht diagnostiziert und unbehandelt. Diese neuartigen Antikörper Biomarker, z. B.NMDAR Antikörper oder Antikörper D2R, haben wesentlich verbesserte Diagnose und Bewusstsein und haben die Behandlungsmöglichkeiten für Patienten eröffnet. In der Tat ist eine frühzeitige Behandlung mit Immuntherapien mit verbesserten Ergebnis 11,12 verbunden. Traditionelle Verfahren, um Antikörper, wie Enzym-Immunoassay (ELISA) und Western-Blot erkennen sind zum Nachweis von Antikörpern in Seren eingesetzt. Sie sind jedoch nicht ohne weiteres zu ermöglichen Erkennung von extrazellulären Oberfläche oder Epitope und vielmehr kann die Immunreaktivität gegen ein intrazelluläres Epitop zeigen. Weiterhin Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne von wichtigen Proteinen bei der Neurotransmission beteiligt sind, binden wahrscheinlich pathogenen 2,3,7,13,14 sein. Daher ist die Entwicklung von genauen und empfindlichen Assays zu relevanten Zelloberfläche oder der extrazellulären Antikörperzielen bei Patienten entdecken, von größter Bedeutung. Der Goldstandard-Methode im Bereich basiert auf der Verwendung von lebenden Zellen basieren, in so genannten &quot;Zelle-based-Tests &quot;. Dieses Verfahren umfasst die Expression eines Antigens auf der Oberfläche von Säugerzellen (meistens menschliche embryonale Nieren-293 (HEK293-Zellen)) in seiner nativen Form durch Transfektion von Vektoren, die die vollständige cDNA-Sequenz des Antigens von Interesse. Live nonpermeabilized Zellen werden dann mit verdünntem Patientenserum inkubiert, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Immunglobulin (Ig)-sekundären Antikörper. Die Intensität oder Fluoreszenzgrad wird dann festgestellt und in der Ebene der Autoantikörper-Bindung verbunden sind. Dieses Verfahren ist spezifisch, da nur ein Antigen in Zellen überexprimiert. Die am weitesten verbreitete &quot;read-out&quot; hat nach Immunzytochemie 4,5,8-10 gewesen konfokalen Mikroskopie-Analyse. Jedoch Durchflusszytometrie zellbasierten Assays wurden erfolgreich verwendet, um Antikörper in Patienten mit demyelinisierenden Erkrankungen 15-17 erfassen. Insbesondere Waters et al. 15 Vergleich der Antikörpernachweis unter Verwendung einer Pfanneel des Antikörper-Nachweistechniken, einschließlich Tests auf Zellbasis, gefolgt von Mikroskopie oder Durchflusszytometrie analysiert, und hat gezeigt, Durchflusszytometrie Assay auf Zellbasis, um die empfindlichen, genauen und zuverlässigen Methode. Daher ist die Durchflusszytometrie zellbasierten Assay vorteilhaft, wie es ist quantitativ, nicht Prüfer abhängig, und jede Verwendung von radioaktivem Material nicht um. Es ist auch praktisch, da es ermöglicht vielen Patienten, in einer kurzen Zeit untersucht werden. In jüngerer Zeit haben wir ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie-Assay auf Zellbasis, um NMDAR Antikörper und D2R-Antikörper in Patienten mit Autoimmunerkrankungen CNS 11 zu erfassen optimiert. Unsere Gruppe vor kurzem erkannt NMDAR Antikörper in Patientenproben mit Durchflusszytometrie zellbasierte Assays. Diese NMDAR Antikörper-positiven Seren wurden zuvor mittels konfokaler Mikroskopie analysiert und ebenfalls als positive 11 zu sein. Dieses Protokoll beschreibt einen Durchflusszytometrie Zellen basierender Test für den Nachweis von conformation empfindlichen ZNS-Antikörper in Patientenserum Verwendung eines automatisierten Hochdurchsatz-Sampler.

<table><tbody><tr><td>pIRES2-EGFP-Vektor</td><td>Clontech</td><td>6029-1</td><td></td></tr><tr><td>Humaner HA-Dopamin-2-Rezeptor (D2R) cDNA</td><td>Missouri S& T cDNA Resource Centre</td><td>DRD020TN00</td><td></td></tr><tr><td>Menschliche Untereinheit 1 von NMDAR (NR1) cDNA</td><td></td><td></td><td>Geschenk von Prof. A. Vincent&nbsp; (Oxford, Vereinigtes Königreich)</td></tr><tr><td>Monoklonaler gereinigter Anti-Human-NR1-Antikörper für Mäuse (Klon: 54.1)</td><td>BD Pharmingen</td><td>556308</td><td></td></tr><tr><td>Maus-gereinigter monoklonaler Anti-DRD2-IgG (Klon: 1B11)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WH0001813M1-50UG</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Esel Anti-Maus-IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A31571</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor 647 Ziegen-Anti-Human-IgG (H + L)</td><td>Invitrogen</td><td>A21445</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Modifiziertes Eagle Medium (1x) 4,5 g/L D-Glucose, L-Glutamin und 110 mg/L Natriumpyruvat</td><td>Invitrogen</td><td>11995-065</td><td></td></tr><tr><td>Fötales Rinderserum</td><td>Invitrogen</td><td>10099-141</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Invitrogen</td><td>15710-072</td><td></td></tr><tr><td>GlutaMAX</td><td>Invitrogen</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin-Streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Geneticin</td><td>Invitrogen</td><td>10131-035</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco's Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (1x) (-Ca2+/-Mg2+)</td><td>Invitrogen</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express (1x) mit Phenolrot</td><td>Invitrogen</td><td>12605-028</td><td></td></tr><tr><td>0,9% Natriumchlorid</td><td>Baxter</td><td>AHF7975</td><td></td></tr><tr><td>Polyethylenimin</td><td>Polysciences Inc</td><td>9002-98-6</td><td></td></tr><tr><td>Versene</td><td>Invitrogen</td><td>15040-066</td><td></td></tr><tr><td>XhoI</td><td>Roche</td><td>10899194001</td><td></td></tr><tr><td>NheI</td><td>Roche</td><td>10885843001</td><td></td></tr><tr><td>PureLink PCR Aufreinigungskit</td><td>Invitrogen</td><td>K3100-01</td><td></td></tr><tr><td>JetQuick Gel Extraction Spin Kit</td><td>Genomed</td><td>420050</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA</td><td>Ligase Roche</td><td></td><td></td>10481220001</tr><tr><td>Plasmid&nbsp; Plus&nbsp; Maxi Kit</td><td>Qiagen</td><td>12963</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Name des Geräts/der Software</td><td></td><td>Firmenkatalognummer</td><td>Modell/Version</td></tr><tr><td>Durchflusszytometer mit Hochdurchsatz-Probenehmersystem</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>BDLSRII mit HTS</td></tr><tr><td>Inverses</td><td>Mikroskop Olympus</td><td></td><td>CKX41 (mit Quecksilberlampe und U-RFLT50-Netzteil)</td></tr><tr><td>Elektronische Mehrkanalpipette (15-300 &mu; l)</td><td>Eppendorf</td><td>613-2240P</td><td>12-Kanal Xplorer Plus</td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td>2010</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad Software, Inc.</td><td></td><td>v4</td></tr><tr><td>FlowJo</td><td>Treestar</td><td></td><td>v7.5</td></tr><tr><td>50 ml konische Röhrchen aus Polypropylen</td><td>BD Biosciences</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>6-Well-Platte</td><td>BD Biosciences</td><td>353046</td><td></td></tr><tr><td>Gewebekulturflasche (T75)</td><td>BD Biosciences</td><td>353136</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Pechiney Plastic Packaging</td><td>PM-992</td><td></td></tr><tr><td>96-well mit V-Boden Platte</td><td>Corning</td><td>651180</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4"></td></tr></tbody></table>

hochdurchsatz-durchflusszytometrie zellbasierten assay auf antikörper gegen n-methyl-d-aspartat-rezeptor oder dopamin-2-rezeptor im menschlichen serum detect

High-throughput Flow Cytometry Cell-based Assay to Detect Antibodies to N-Methyl-D-aspartate Receptor or Dopamine-2 Receptor in Human Serum

In den letzten Jahren haben sich Antikörper gegen Oberflächenproteine ​​und Konformationsänderungen in der Neurotransmission im ZNS Autoimmunerkrankungen bei Kindern und Erwachsenen nachgewiesen. Diese Antikörper wurden verwendet, um die Diagnose und Behandlung zu führen. Zellbasierte Assays zum Nachweis von Antikörpern in Patientenserum verbessert. Sie werden auf der Oberflächenexpression von Gehirn-Antigene auf eukaryotische Zellen, die dann mit verdünntem Patientenserum, gefolgt von Fluorochrom-konjugierten sekundären Antikörper inkubiert basiert. Nach dem Waschen wird sekundären Antikörperbindung dann durch Durchflusszytometrie analysiert. Unsere Gruppe hat ein Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie Live zellbasierten Assay entwickelt, um Antikörper gegen bestimmte zuverlässig erkennen Neurotransmitter-Rezeptoren. Diese Durchflusszytometrie Verfahren ist unkompliziert, quantitative, effizient, und die Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer System ermöglicht vielen Patienten auf einfache Weise in kurzer Zeit untersucht werden. Außerdem ist diese Zellbasis alssagen kann leicht angepasst, um Antikörper gegen verschiedene antigene Ziele zu erfassen, die beide aus dem zentralen Nervensystem und der Peripherie werden. Entdecken zusätzliche neue Antikörper Biomarker ermöglicht die schnelle und genaue Diagnose und Behandlung zu verbessern von immunvermittelten Erkrankungen.

Leben HEK293 D2R + CTL und HEK293-Zellen wurden mit dem Durchflußzytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Probennehmer erworben. Bei der Analyse wurden die Zellen auf Basis von Vorwärtsstreuung (Größe) und Seitenstreuung (Granularität) Parameter (1A und 1D) verknüpft. HEK293-Zellen das Reportermolekül, GFP, im Zytoplasma und nicht transfizierten Zellen wurden von der Analyse (Fig. 1B und 1E) ausgeschlossen. Innerhalb der GFP +-Gate...

In den letzten Jahren wurden mit lebenden Zellen basierende Tests erfolgreich verwendet worden, um Antikörper gegen Oberflächenantigene erkennen und Konformationsänderungen. Hier beschreiben wir ein Verfahren, das Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie ermöglicht die Analyse von großen Kohorten von Patienten. Detektion von neuen Antikörper Diagnose und Behandlung von Autoimmunerkrankungen zu verbessern.

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

Over the recent years, antibodies against surface and conformational proteins involved in neurotransmission have been detected in autoimmune CNS diseases ...

Das übergeordnete Ziel des folgenden Experiments besteht darin, neuronale Anti-D2R- oder NMDA-R-Antikörper in Patientenproben mithilfe eines hochdurchsatzfähigen, zellbasierten Durchflusszytometrie-Assays nachzuweisen. Dies wird erreicht, indem die vollständige cDNA-Sequenz des menschlichen D2R oder NMDA-R in ein Plasmid kloniert wird. In einem zweiten Schritt wird eine humane Zelllinie transfiziert, was zur Expression neuronaler Antigene an der Zelloberfläche führt.Anschließend werden transfizierte Zellen mit Patientenserum und einem geeigneten sekundären Antikörper inkubiert, bevor die Datenerfassung per Durchflusszytometrie erfolgt. Um die Bindung von Antikörpern an Oberflächenantigene der Zellen nachzuweisen, werden die Ergebnisse auf Basis der Durchflusszytometrie-Analyse erhalten. Unser hochdurchsatzfähiger dreikanaliger zellbasierter Durchflusszytometrie-Assay ist schnell, quantitativ und effizient für große Kohorten von Patientenproben.Dies stellt einen erheblichen Vorteil gegenüber einem zellbasierten Assay mit Immunchemie und konfokaler Analyse dar. In der Regel haben Personen, die neu in dieser Methode sind, Schwierigkeiten mit dem Verlust von Zellen während des Experiments, um die erforderliche Zellanzahl am Durchflusszytometer zu erhalten. Achten Sie darauf, zwischen den Waschschritten keine Zellen abzusaugen.Wählen Sie einen Expressionsvektor, der für die Expression von Transmembranproteinen geeignet ist und die zelluläre Ko-Expression der Antigene und des grünen Fluoreszenzproteins separat ermöglicht. Beispielsweise enthält dieser Vektor einen verbesserten GFP-Reporter unter Kontrolle einer Internal Ribosome Entry Site. Klonen Sie die vollständige humane CD NA mittels geeigneter Restriktionsenzyme in den Vektor ein. Nach Verifizierung der Klone durch Sequenzierung stellen Sie Plasmid-Stammlösungen her, die für die Transfektion von Kulturen geeignet sind. Die HEK 2 93-Zellen in komplettem DMEM mit 10% fetalem Kälberserum.Die Zellen nach einer Wäsche mittels Trypsin gewinnen, die Zellen zentrifugieren und den Zellenpellet in frischem kompletten DMM resuspendieren. Die Zellen zählen und anschließend zwei-Milliliter-Kulturen in Sechs-Loch-Platten bei etwa 70 % Konfluenz ansäen. Die Wells von HEK 293-Zellen für die Transfektion mit den Expressionskonstrukten sowie dem Kontrollvektor zuweisen. Einige nicht transfizierte HEK 293-Zellen für spätere Kompensation aufbewahren.Stellen Sie die Transfektionsansätze her, die 200 Mikroliter 0,9 %iger Natriumchlorid-Lösung, 2,5 Mikrogramm DNA und vier Mikrogramm pro Milliliter Polyethalin enthalten. Sofort 10 Sekunden lang verwirbeln und danach 10 Minuten bei Raumtemperatur inkubieren, bevor der Transfektionsansatz jedem Brunnen mit zwei Milliliter frischem, vollständigem DMM zugegeben wird. Decken Sie die Platte ab, umwickeln Sie die Seiten mit Perfil und zentrifugieren Sie fünf Minuten lang bei 280 ×g, um die Zelltransfektion zu unterstützen.Entfernen Sie anschließend die Parafolie und stellen Sie die Platte 18 Stunden lang unter Kulturbedingungen. Ersetzen Sie das Kulturmedium durch frisches, komplettes DMEM und kultivieren Sie weitere 72 Stunden. Zum Lösen der Zellen geben Sie 500 µL Varice pro Mulde hinzu und inkubieren etwa fünf Minuten bei 37 °C.Suspenderen Sie anschließend die Zellen jedes Wells in zwei Milliliter 2 % FBS in PBS und überführen Sie die Zellen nach drei Waschschritten in ein kegelförmiges Reagenzglas. Resuspendieren Sie die Zellpellets in 2 % FBS-Lösung bei einer Konzentration von einer Million Zellen pro Milliliter. Erstellen Sie nun eine 96-Well-Vorlage für die Durchflusszytometrie, sodass die verschiedenen Zelllinien mit jeder Patientenprobe oder primären Antikörper behandelt werden.Anschießend 50.000 Zellen pro Vertiefung in eine V-förmige 96-Loch-Platte aussäen und die Zellen durch Zentrifugation bei 450 Gs fünf Minuten lang pelletieren. Die Platte schräg halten und das Überstandmedium vorsichtig entfernen, wobei darauf geachtet werden muss, das Zellpellet nicht abzusaugen. Danach eine serielle Verdünnung des primären Antikörpers hinzufügen, um die Oberflächenexpression des Antigens zu bewerten.Und anschließend die Patientenproben zur Nachweis von Antikörpern inkubieren Sie die Zellen eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln nach dreimaligem Waschen mit 170 µL 2 % FBS-Lösung, geben Sie den geeigneten mit AF 647 konjugierten sekundären Antikörper anti-human IgG für die Patienten und anti-US. IgG für die primären Antikörper hinzu. Inkubieren Sie eine Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln nach dreimaligem Waschen.Suspendieren Sie die Zellen in 35 Mikrolitern einer 2 %igen FBS-Lösung zur Zellerfassung mittels Durchflusszytometrie am Durchflusszytometer. Richten Sie zuerst den Hochdurchsatz-Sampler ein. Erfassen Sie 10.000 Ereignisse pro Vertiefung gemäß der Erfassungsvorlage für die Durchflusszytometrie.Exportieren und analysieren Sie die Daten mithilfe einer Durchflusszytometrie-Software, indem Sie die lebenden HEK 293-Zellen basierend auf dem Forward- und Side-Scatter auswählen. Gegen Sie außerdem auf hohe GFP-Positivität, um nur die transfizierten Zellen zu analysieren. Bestimmen Sie die mittlere Fluoreszenzintensität des AF 647-Kanals innerhalb der lebenden GFP-positiven Zellen.Danach die Daten zur Analyse in Excel oder Prism exportieren. Die Konzentrationen des primären Antikörpers gegen den MFI, der aus den entsprechenden Proben für jeden Patienten und jede Kontrollprobe erhalten wurde, auftragen. Den Delta-MFI bestimmen und die Schwelle für die Antikörperpositivität berechnen, indem drei Standardabweichungen zum mittleren Delta-MFI der Kontrollkohorte addiert werden.Tragen Sie anschließend die einzelnen Proben, gruppiert nach der Patientengruppe, in ein Diagramm ein. Stellen Sie hier die Schwelle als Linie dar. Zellen, die entweder den N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder den Dopamin-2-Rezeptor exprimieren, wurden am Durchflusszytometer unter Verwendung eines Hochdurchsatz-Samplers erfasst.Während der Analyse wurden die Zellen basierend auf dem Vorwärtsstreulicht für die Größe und dem Seitwärtsstreulicht für die Granularität selektiert. TRANSFEKTIERTE HK 2 9 3-Zellen exprimierten das GFP-Reportermolekül im Zytoplasma, und NICHT transfektierte Zellen wurden innerhalb des GFP-positiven Tors aussortiert. Der MFI-Wert, der mit der AF 6 47-markierten sekundären Antikörperbindung gegen humanes IgG assoziiert war, wurde gemessen, um die Hintergrundfluoreszenz bei der Analyse humaner Seren zu eliminieren.Der Delta-MFI wurde berechnet, indem der Hintergrund-MFI der Kontrollzellen subtrahiert wurde. Dieser zellbasierte Durchflusszytometrie-Assay beruht auf dem Nachweis des Zelloberflächenantigens mittels Antikörper. Zum Beispiel zeigten die mit dem Expressionsplasmid für N-M-D-A-R transfizierten GK2.93-Zellen eine hohe Expression des Oberflächen- und Methyl-D-Rezeptors.Ebenso exprimierten die D2R-transfizierten Zellen den Dopamin-2-Rezeptor, während die Kontrollzellen keines dieser Antigene exprimierten. Diese klinische Studie untersuchte ein Patientenkohorte mit NMDA-R-Enzephalitis, eine Patientenkohorte mit D2R-Antikörper-assoziiierter Enzephalitis und eine Kontrollkohorte mit anderen nichtentzündlichen neurologischen Erkrankungen. Beachten Sie, dass keiner der positiven Patienten für beide Antikörper positiv war.Die gezielte Ansprache von N-M-D-A-R-M-D zwei R wie erwartet. Die N-M-D-A-R- und D-zwei-R-Antikörper wurden in keiner der analysierten Kontrollen nachgewiesen. Nachdem die Methode beherrscht ist, kann sie innerhalb von fünf Stunden korrekt durchgeführt werden, wobei etwa eine Stunde für die Durchflussmessung von rund 80 Proben benötigt wird, nachdem sie etabliert wurde.Diese Technik ebnete den Forschern auf dem Gebiet der Neuroimmunologie den Weg zur Entdeckung neuartiger Antikörpervorlagen bei immunvermittelten Erkrankungen.

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Forschung

JoVE Journal

Medicine

Medizin

Dieses Video beschreibt eine Immunoassay-Technik, bei der fluoreszierende magnetische Kügelchen oder Mikrosphären in Verbindung mit verschiedenen Antigenen verwendet werden, um gleichzeitig verschiedene Antikörper-Isotypen in einer Serumprobe nachzuweisen. Der Assay ist hilfreich, um die Serokonversion während einer Infektion oder nach der Impfung zu verstehen.

Multianalyt-Immunobead-Assay: eine flussbasierte Immunoassay-Technik zum gleichzeitigen Nachweis mehrerer Antikörper-Subtypen in humanen Serumproben

Dieses Video demonstriert eine Technik zur Identifizierung von Antikörpern gegen spezifische Antigene in einer Probe unter Verwendung einer neuronalen Kultur des Hippocampus der Ratte. Durch die Exposition kultivierter Neuronen gegenüber Patientenproben, die Autoantikörper enthalten, die auf N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptoren (NMDARs) abzielen, wird das Vorhandensein von Autoantikörpern, die an die neuronale Oberfläche gebunden sind, durch Immunfärbung nachgewiesen.

Ein Assay zum Nachweis von Autoantikörpern in humanem Serum unter Verwendung einer neuronalen Kultur aus dem Hippocampus

Synaptosomal Dopamin Aufnahme und Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie dar experimentelle Analysetools, Dopamin Homöostase bei Mäusen durch die Beurteilung der Funktion der Dopamin-Transporter und Dopamin-Spiegel in striatalen Gewebe zu untersuchen, bzw.. Hier präsentieren wir Protokolle zur Messung Dopamin Gewebe Inhalt und die Funktionalität der Dopamin-Transporter zu beurteilen.

Bewertung der dopaminergen Homöostase bei Mäusen durch Verwendung von High-Performance Liquid Chromatography Analyse und Synaptosomal Dopamin-Aufnahme

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Eine einfache zellbasierte Immunfluoreszenz-Assay, Autoantikörper gegen das N-Methyl-D-Aspartat-(NMDA)-Rezeptoren im Blut zu erkennen

Hier präsentieren wir eine zellbasierte Flow-zytometrie-Methode zur Erkennung neutralisierende Antikörper oder andere Faktoren, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien in einer menschlichen Matrix wie zerebralen spinalen Flüssigkeit (CSF) oder Humanserum stören.

Nachweis von Antikörpern, die die zelluläre Aufnahme von Enzym-Ersatz-Therapien mit einem zellbasierte Assays neutralisieren

Das Ziel dieses Protokolls ist es, das Studium der NMDA-Rezeptoren (NMDAR) in einem größeren Maßstab erleichtern und ermöglichen die Prüfung der modulierende Effekte von kleinen Molekülen und deren therapeutische Anwendungen.

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Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect (Video) | JoVE Journal

Hochdurchsatz-Durchflusszytometrie zellbasierten Assay auf Antikörper gegen N-Methyl-D-Aspartat-Rezeptor oder Dopamin-2-Rezeptor im menschlichen Serum Detect

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