A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di creare un sistema di coltura che riassuma da vicino il microambiente cellulare e intracellulare del midollo osseo umano. In primo luogo, la superficie di un pozzetto di coltura tissutale viene rivestita con la matrice industriale. Quindi le cellule mononucleate del midollo osseo o altre cellule di interesse vengono mescolate con la matrice del midollo osseo.

Successivamente, la matrice industriale viene rimossa e la miscela di matrice cellulare viene aggiunta al pozzetto. Una volta che la matrice si è gelatinosa, viene ricoperta con il terreno di crescita. In definitiva, le cellule possono essere visualizzate direttamente nella matrice o possono essere isolate per le analisi a valle rispetto ai metodi esistenti per la coltura delle cellule.

Ad esempio, i metodi standard di coltura tissutale o i modelli di co-coltura in cui le cellule vengono coltivate su plastica. Il vantaggio principale dell'utilizzo di un metodo di coltura 3D è che le cellule vengono coltivate all'interno del microambiente fisiologico e quindi consente di studiare le cellule all'interno delle condizioni native del tessuto. Preparare una piastra a 48 pozzetti in cui verranno piastrate le cellule.

Aggiungendo prima 65 microlitri di soluzione di rivestimento industriale in ciascuno, distribuire bene la soluzione in modo uniforme per coprire l'intera superficie del pozzo. Questo metodo è scalabile anche su altre superfici. Lasciare incubare le piastre a temperatura ambiente per almeno 30 minuti.

Nel frattempo, preparare la sospensione cellulare di 50.000 cellule per microlitro di PBS. Preparare abbastanza da aggiungere 10 microlitri a ciascun pozzetto, quindi in una provetta einor, mescolare la sospensione cellulare con 100 microlitri di matrice ossea ricostruita per. Mescolate bene delicatamente ed evitate di introdurre bolle.

Tenere il composto sul ghiaccio in modo che la matrice non si gelifichi quando il piatto è finito. Incubazione, rimuovere tutto il liquido e dotare la soluzione di rivestimento tramite aspirazione. Quindi aggiungere a ciascuna 100 microlitri di sospensione cellulare ben miscelata con matrice.

Inclinare rapidamente la piastra utilizzando una pipetta per coprire uniformemente l'intera superficie del pozzetto. Continuate a mescolare la sospensione tra i riempimenti dei pozzetti, poiché le celle si accumuleranno una volta caricate completamente. Incubare la piastra per 30-60 minuti senza agitare fino a quando la matrice non si solidifica.

Quindi, preriscaldare il terreno di coltura del midollo osseo in un bagno d'acqua impostato a 37 gradi Celsius. Dopo 30 minuti di incubazione, verificare che la matrice si sia solidificata correttamente. Una buona matrice forma uno strato morbido simile a un gel che non si muove quando la piastra viene inclinata.

Quando la matrice è pronta, sovrapporla delicatamente con un millilitro di terreno goccia a goccia utilizzando una pipetta sierologica. Quindi rimettere la coltura di matrice ossea ricostruita assemblata nell'incubatore per un massimo di 30 giorni senza cambiamenti del terreno. Se è necessario sostituire il fluido, sostituire solo metà del fluido in una sola volta.

Rimuovere delicatamente il terreno senza disturbare lo strato della matrice. Inclinare la piastra e scolare delicatamente il terreno utilizzando una pipetta. Non aspirare il fluido sulla matrice in un secondo momento.

Quando si colorano le cellule. Utilizzare questa tecnica per le modifiche alla soluzione. Per rimuovere i terreni dai pozzetti di una coltura 3D, è molto importante che vengano rimossi dal lato del pozzetto.

In caso contrario, la matrice verrà disturbata e le cellule potrebbero andare perse attenendosi alla stessa tecnica. Lavare le cellule due volte con un XPBS sterile. Quindi aggiungere mezzo millilitro di soluzione di recupero delle celle ghiacciate a ciascuno.

Rimuovere bene l'intero strato della matrice insieme alle cellule pipettando energicamente su e giù. Per ciascuno, trasferire bene la raccolta in una provetta da microcentrifuga e posizionarla sul ghiaccio. Quindi aggiungere un ulteriore mezzo millilitro di soluzione di recupero allo stesso pozzo e raccogliere tutto il materiale rimanente.

Agita tutte le collezioni e incubale per un'ora sul ghiaccio. Durante l'ora, agitare i tubi ogni 15 minuti per facilitare il rilascio delle cellule dalla matrice. Dopo un'ora, controllare la miscela per verificare la presenza di grumi visibili di matrice.

Non dovrebbe essere presente, ma se ce ne sono, trasferisci la miscela in una provetta più grande e aggiungi altri due o cinque millilitri di soluzione per il recupero cellulare. Quindi incubare le cellule per altri 30-60 minuti. Vorticare periodicamente e controllare nuovamente l'assenza di grumi di matrice.

Quando la matrice non è più raggruppata. Centrifugare la miscela a 1000 giri/min per cinque-10 minuti a quattro gradi Celsius. Quindi rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in un millilitro di XPBS freddo.

Ripetere la centrifugazione. Sostituire il surnatante con PBS fresco e ripetere il lavaggio. Una terza volta.

Dopo il terzo lavaggio PBS, recuperare le cellule nella soluzione appropriata per la procedura successiva. Le cellule del midollo osseo sono state coltivate in una matrice ossea ricostruita per 30 giorni e sono state sottoposte a imaging periodico al microscopio ottico con un ingrandimento di 200 volte. Gli elementi stromali sono stati rilevati per la prima volta il quinto giorno, ma erano chiaramente evidenti entro il giorno 14.

Nel corso del periodo di coltura, le cellule sono migrate attraverso la matrice e si sono aggregate in cluster distinti. Le masse di cellule maligne si sono espanse nel tempo per valutare la composizione dei componenti stromali che crescono in RBM. È stata valutata la morfologia delle cellule alla transizione tra RBM e il rivestimento industriale.

Le cellule sono state colorate per la fibronectina, l'actina e i nuclei. Le cellule di visualizzazione con morfologia stromale hanno dimostrato di essere osteoblasti con alti livelli di attività della fosfatasi alcalina. Erano in grado di mineralizzare il calcio come determinato dalla zarina, le cellule coloranti con una presenza visibile di goccioline lipidiche sono state identificate come adipociti sulla base di una colorazione positiva con olio.

I globuli rossi con nuclei multipli occasionali sono stati riconosciuti come osteoclasti pres ed erano positivi per la fosfatasi acida resistente ai tartrati. Dopo l'isolamento delle cellule da una coltura 3D, è possibile fare una varietà di cose. Ad esempio, è possibile studiare i fenotipi cellulari di varie cellule cresciute nel microambiente.

È possibile studiare l'espressione genica e proteica e persino determinare che tipo di molecole vengono secrete da queste cellule in condizioni 3D.