Name: A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-03-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 51 s
Description: Scopri la coltura tridimensionale di cellule del midollo osseo umano per studiare il microambiente fisiologico. Questo metodo consente la visualizzazione diretta e l'analisi downstream delle cellule.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato finanziato da sovvenzioni dal National Institutes of Health, National Cancer Institute (1R21CA141039), BD Biosciences Research Grant Award, l&#39;American Cancer Society Research istituzionale Grant (IRG # 58-006-53), al Centro Purdue University for Cancer La ricerca e la Canadian Institutes of Health Research e Alberta Cancer Consiglio Initiative di ricerca del programma. MP è stato sostenuto dal National Institutes of Health, National Cancer Institute, la prevenzione del cancro Programma di Tirocinio (R25CA128770; PI: D. Teegarden) amministrato dal Oncologico Sciences Center e il Discovery Learning Research Center presso la Purdue University.

1. Preparazione preliminare <ol><li> Tenere pipette sierologiche sterili e relativi puntali a 4 ° C. Risoluzione dei problemi: gel Matrigel a temperatura ambiente (RT); utilizzando pipette fredde e suggerimenti impediranno Matrigel di gelificazione durante l&#39;installazione cultura. </li><li> Scongelare una bottiglia di Matrigel a 4 ° C per una notte. </li></ol> 2. Preparazione dei reagenti <ol><li> Preparazione della fibronectina soluzione stock: Fare un / ml soluzione madre 1 mg di fibronectina sciogliendo 100 mg fibronectina umana in 100 ml di acqua distillata. Una volta che la fibronectina è dissolta, filtro sterile, un&#39;aliquota, e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. Risoluzione dei problemi: se fibronectina non si scioglie rapidamente incubare la soluzione per pochi minuti in un set da bagno di acqua a 37 ° C. </li><li> Preparazione di 10x PBS: sciogliere 80 g di cloruro di sodio NaCl, 14,4 g di Na 2 HPO 4, 2 g KCl e 2,4 g di KH 2 PO <sub&gt; 4 in 1 L di acqua distillata. Regolare il pH a 7,4, filtro sterile e conservare a 4 ° C per un massimo di 6 mesi. </li><li> Preparazione del tampone di neutralizzazione 20: Fai una soluzione contenente HEPES 100 mM in 2x tampone fosfato salino (PBS) con 1 M HEPES e 10x soluzioni stock PBS. Aggiustare il pH della soluzione a 7,0. Conservare a 4 ° C per 2-3 mesi. </li><li> Preparazione della soluzione di 2 mg / ml di coda di ratto collagene di tipo I: fare una soluzione 2 mg / ml di collagene I nel tampone di neutralizzazione (passo 2.3). Agitare la soluzione a bassa velocità e mescolare delicatamente pipettando su e giù. Poiché questo collagene è molto viscoso, evitare la formazione di bolle d&#39;aria durante il pipettaggio. Si raccomanda di preparare la soluzione di collagene I fresca ogni volta. Mantenere la soluzione in ghiaccio fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Preparazione del rivestimento endosteale (Rend): Mescolare 1 mg / magazzino fibronectina ml con 2 mg / ml di collagene I stock (punti 2.1 e 2.4) per una concentrazione finale di 77 mg / ml e 29 mcg / ml, rispettivamente, in 1x &amp;# 160; PBS sterile. Mescolare e conservare a 4 ° C per un massimo di 1 mese. </li><li> Preparazione della matrice ossea ricostruita (RBM): <ol><li> Preraffreddare 1,5 ml microprovette su ghiaccio. Conservare tutte le soluzioni della matrice sul ghiaccio in ogni momento. </li><li> Miscelare 4 parti Matrigel (concentrazione Matrigel varia da lotto a lotto, ma le variazioni sono risultate essere trascurabile), 2,5 parti di 1 mg / ml di fibronectina e 1 parte di 2 mg / ml di collagene I sul ghiaccio prima pipettaggio Matrigel in il tubo con i puntali delle pipette fredde e quindi aggiungere fibronectina e collagene I. Matrigel inizierà solidificare a temperature superiori a 4 ° C, in modo da lavorare in fretta, mentre il pipettaggio Matrigel. Mescolare la matrice molto delicatamente pipettando su e giù, evitare di introdurre bolle. Tenere le provette in ghiaccio durante la miscelazione del RBM. </li></ol></li><li> Preparazione del mezzo di crescita del midollo osseo (BMGM): Rendere 500 ml di BMGM contenenti 6,2 x 10 -4 M CaCl 2, 10 -6 M sodio succinato, 10 -6 M idrocortisone, il 20% del plasma umano (normale o maligno raccolti da donatori sani o pazienti), e l&#39;1% di penicillina / streptomicina in RPMI-1640. CaCl 2, sodio succinato, e gli integratori idrocortisone possono essere conservati a -80 ° C per&gt; 6 mesi come 1.000 soluzioni di riserva x. Quando cresce linee cellulari, siero bovino fetale (FBS) può essere sostituito da plasma umano. </li><li> Preparazione del 10% formalina tamponata neutra (NBF): Aggiungi il 37% di soluzione di formaldeide magazzino a 1x PBS al 10% v / v Mescolare bene e conservare a temperatura ambiente per 2-3 settimane al riparo dalla luce. </li><li> Preparazione del 1% di albumina sierica bovina (BSA): Pesare giusta quantità di BSA e scioglierlo in 1x PBS. Conservare a 4 ° C ed utilizzare entro 1 settimana. Soluzione BSA tende ad ottenere contaminati se conservato in frigorifero per periodi più lunghi. In alternativa, la soluzione BSA può essere aliquotato e congelato a -20 ° C per una conservazione a lungo termine. Evitare cicli di congelamento-scongelamento. </li><li> Preparazione della soluzione di recupero di cellule (CRS): Make 5 EDTA mm, 1 mm vanadate sodio (Na &lt;soluzione sub&gt; 3 VO 4) e 1,5 mM fluoruro di sodio (NaF) in PBS 1x. Filtro sterile e conservare a 4 ° C fino a 6 mesi. </li></ol> 3. Integrato 3-D coltura di cellule BM umano non maligne e maligne <ol><li> Purificare cellule mononucleate midollari primarie per Ficoll Plaque centrifugazione in gradiente secondo le istruzioni del produttore. Passaggio facoltativo: le cellule possono essere etichettati con 0,25 micron carbossifluoresceina diacetato, estere succinimidyl (CFSE) secondo le istruzioni del produttore per seguire la proliferazione cellulare per tutto il periodo di coltura. Risoluzione dei problemi: Se le cellule muoiono dopo CFSE colorazione, titolare la quantità di CFSE come la concentrazione dipende dal tipo di cellula; 0,25 micron funziona bene per le cellule mononucleari BM primarie. </li><li> Aggiungere 65 ml di soluzione di rend in ciascun pozzetto di un tessuto coltura trattata piastra a 48 pozzetti. Distribuire uniformemente la soluzione a coprire l&#39;intera superficie del pozzetto ed incubare per&gt; 30min a RT. </li><li> Preparare la sospensione di cellule ad una densità di 0,5 x 10 6 cellule in 10 ml di PBS 1x per pozzetto di una piastra a 48 pozzetti. In una provetta da 1,5 ml microcentrifuga mescolare la sospensione cellulare con 100 ml di matrice MLF per pozzetto. Mescolare le cellule e la matrice RBM pipettando gentilmente su e giù; evitare l&#39;introduzione di bolle. Mantenere la miscela cellula / matrice in ghiaccio per evitare gelificazione della matrice. Nota: il sistema RBM è completamente scalabile, per configurare il sistema in un formato non-48-bene, adegua gli importi di tutti i reagenti (matrici e medie) in base alla superficie della piastra utilizzata. Ridimensionare il numero di cellule per essere placcato conseguenza. </li><li> Aspirare il restante Rend e aggiungere la miscela di cellule / matrice nel centro di un pozzo. Rapidamente, diffondere la miscela di cellule / matrice a coprire l&#39;intera superficie del pozzetto in modo uniforme. Posizionare la piastra per 30-60 min a 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore per consentire la matrice solidificare. Non agitare o disdisturbare la piastra durante l&#39;incubazione. Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice. Risoluzione dei problemi: per evitare distribuzione irregolare di cellule in RBM, mescolare bene prima di placcatura. Mescolare dopo ogni 5 ° ben placcato per evitare cellule sedimentazione al fondo della provetta. Una volta placcato, cellule non si depositano sul fondo del pozzo a causa della tensione superficiale nella matrice. </li><li> Preriscaldare BMGM in un bagno d&#39;acqua impostata a 37 ° C. </li><li> Dopo 30 minuti, verificare che la matrice ha impostato correttamente, si formerà un gel morbido come strato che non si muove quando la piastra è inclinata. Sovrapporre lo strato di cellule / matrice con 1 ml di caldo BMGM. Per evitare lacerazione della pipetta matrice mezzo molto delicatamente (dispensazione goccia a goccia) usandouna pipetta sierologica. Posizionare la cultura meccanismi assemblati in un 37 ° C, 5% CO 2 tessuto cultura incubatore e cultura per il periodo desiderato. Nota: vitalità cellulare viene mantenuta per almeno 30 giorni senza cambiare mezzo, se è necessaria medio cambiamento cambiare solo il 50% delle medie ogni volta. Passaggio critico: E &#39;fondamentale che il mezzo non è freddo come temperatura fredda potrebbe disturbare la matrice già impostato. Fare attenzione a non schizzare il mezzo sulla parte superiore della matrice a potrebbe rompere lo strato di matrice morbida. Risoluzione dei problemi: Se la vitalità delle cellule del sistema RBM è basso, la densità delle cellule può avere da determinare sperimentalmente quando si lavora con le cellule diverse dalle cellule mononucleate primarie da aspirati midollari. Quando si lavora con linee cellulari, diminuire il numero di cellule 10 volte, come linee cellulari immortalizzate proliferano più velocemente di cellule primarie. </li></ol> 4. Imaging &#39;In-matrix&#39; <ol><li><strong&gt; La microscopia ottica <ol><li> Immagine cellule coltivate direttamente in RBM con campo chiaro, contrasto di interferenza differenziale (DIC), confocale o altre tecniche di imaging che permettono di imaging a lunga distanza come matrice di uno spessore di circa 1 mm. Utilizzare la funzione disponibile Z-stack su molti dei microscopi per l&#39;immagine intera cultura da cima a fondo. </li></ol></li><li> Immunofluorescenza Suggerimento: Per il protocollo immunostaining sotto evitare aspirazione soluzioni colorazione / lavaggio, invece inclinare il piatto e rimuovere soluzioni con una pipetta. <ol><li> Rimuovere il BMGM utilizzando una pipetta e lavare 2-3x con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS. Assicurarsi che sufficiente PBS viene utilizzato per coprire l&#39;intera superficie del pozzetto. </li><li> Fix celle della matrice aggiungendo 100 pl / pozzetto (per una piastra a 48 pozzetti) del 10% NBF per 15 minuti a RT. Rimuovere NBF e lavare le cellule due volte con 100 microlitri / lavaggio / pozzetto di RT 1x PBS. Appunto: Evitare di utilizzare a freddo NBF come può liquefare la matrice. </li><li> Rimuovere PBS, aggiungere BSA 1% per 1 ora a RT o a 4 ° C per una notte per bloccare il legame non specifico degli anticorpi. </li><li> Preparare la soluzione di anticorpo primario in 1% BSA alla diluizione necessaria. Diluizione varierà per ogni anticorpo, verificare con il produttore o il titolare di determinare la concentrazione ottimale di anticorpi. Aggiungere 100 pl / pozzetto di soluzione di anticorpo primario e incubare secondo le istruzioni del produttore. Passaggio fondamentale: Tutte le incubazioni che coinvolgono gli anticorpi coniugati a fluorofori o coloranti fluorescenti devono essere eseguite al buio. </li><li> Rimuovere soluzione di anticorpo primario e lavare 3x con 1x PBS per 5 min. </li><li> Per la colorazione immunofluorescenza indiretta, incubare con un anticorpo secondario coniugato con sonda fluorescente per 1 ora a RT. Diluire gli anticorpi in 1% BSA a concentrazione suggerito dal produttore. </li><li> Rimuovere il secondariosoluzione ntibody e lavare 3x con 1x PBS per 5 min. Risoluzione dei problemi: Per evitare elevato background durante l&#39;imaging, titolare anticorpi secondari coniugati modo fluorescente e utilizzare la più bassa concentrazione che fornisce il segnale adeguato. Se elevato background è ancora un problema, aumentare il numero e la durata delle fasi di lavaggio, oppure utilizzare anticorpi primari direttamente coniugati, e saltare il punto 4.2.6. </li><li> Per macchiare i nuclei aggiungono 4 &#39;,6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI) soluzione colorante nucleare, alla diluizione suggerito dal costruttore, e incubare per 7-10 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere la soluzione colorazione nucleare e lavare 2x 1x PBS per 5 min. </li><li> Rimuovere la PBS dall&#39;ultima pulizia e aggiungere una goccia di mezzo di montaggio (serie regolare), sul campione per conservare fluorescenza. Immagine utilizzando apposite impostazioni di eccitazione / emissione su un microscopio a fluorescenza o confocale. Nota: Imaging dovrebbe essere fatto entro 2 giorni di colorazioneper evitare il degrado della matrice e perdita di integrità meccanismi e perdita di segnale fluorescente. Se non è ripreso immediatamente, i campioni colorati devono essere conservati a 4 ° C, al riparo dalla luce, fino imaging. </li></ol></li></ol> 5. Isolamento di cellule dal RBM <ol><li> Rimuovere delicatamente mezzo senza disturbare lo strato di matrice. Non aspirare. </li><li> Lavare le cellule 2x con sterile 1x PBS. Non aspirare. </li><li> Aggiungere 0,5 ml di CRS ghiaccio freddo a ciascun pozzetto e rimuovere l&#39;intero strato di matrice insieme con le cellule, vigorosamente pipettando su e giù. Raccogliere le cellule, matrice, e CRS in una provetta da 1,5 ml microcentrifuga. Mettere sul ghiaccio. </li><li> Aggiungere un ulteriore 0,5 ml CRS allo stesso bene e raccogliere tutto il materiale residuo. Trasferimento alla stessa provetta. </li><li> Vortex la miscela di cellule, matrice, e CRS e incubare in ghiaccio per 1 ora. Cellule Vortex ogni 15 min per facilitare il rilascio dalla matrice. </li><li> Controllare la miscela dopo 1 ora, senza grumi visibilidi matrice dovrebbe essere presente. Risoluzione dei problemi: se ciuffi di matrice sono ancora visibili dopo 1 ora, le cellule di trasferimento / matrix / CRS miscela in un tubo più grande, aggiungere ulteriori 2-5 ml di CRS, e incubare per altri 30-60 min. </li><li> Centrifugare le cellule in CRS a 1.000 rpm per 5-10 minuti a 4 ° C. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 1 ml di freddo 1x PBS. </li><li> Centrifugare a 1000 rpm per 5-10 minuti e rimuovere il surnatante. Ripetere il lavaggio PBS ancora una volta. </li><li> Il secondo lavaggio PBS completa il recupero delle cellule dalla matrice e cellule isolate può essere utilizzato per applicazioni a valle come l&#39;isolamento di DNA / RNA / proteine, citometria a flusso, trapianto in vivo, ecc. </li></ol>

<ol><li>Carrel, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((On+the+Permanent+Life+of+Tissues+Outside+of+the+Organism%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Exp.+Med%22%5BJournal%5D)">On the Permanent Life of Tissues Outside of the Organism.</a> J. Exp. Med. 15, 516-528 (1912).</li>
<li>Harrison, R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Observations+on+the+living+developing+nerve+fiber%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Soc.+Exp.+Biol.+Med%22%5BJournal%5D)">Observations on the living developing nerve fiber.</a> Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 4, 140-143 (1907).</li>
<li>Earle, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+malignancy+in+vitro.+IV.+The+mouse+fibroblast+cultures+and+changes+seen+in+the+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Production of malignancy in vitro. IV. The mouse fibroblast cultures and changes seen in the living cells.</a> J. Natl. Cancer Inst. 4, 165-212 (1943).</li>
<li>Gey, G. O., Coffman, W. D., Kubicek, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tissue+Culture+Studies+of+the+Proliferative+Capacity+of+Cervical+Carcinoma+and+Normal+Epithelium%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Tissue Culture Studies of the Proliferative Capacity of Cervical Carcinoma and Normal Epithelium.</a> Cancer Res. 12, 264-265 (1952).</li>
<li>Barcelloshoff, M. H., Aggeler, J., Ram, T. G., Bissell, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional-Differentiation+and+Alveolar+Morphogenesis+of+Primary+Mammary+Cultures+on+Reconstituted+Basement-Membrane%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Functional-Differentiation and Alveolar Morphogenesis of Primary Mammary Cultures on Reconstituted Basement-Membrane.</a> Development. 105, 223-227 (1989).</li>
<li>Lamb, R., Ambler, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+propagated+in+serum-free%2C+feeder-free+culture+conditions+fail+to+form+stratified+epidermis+in+a+reconstituted+skin+model%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes propagated in serum-free, feeder-free culture conditions fail to form stratified epidermis in a reconstituted skin model.</a> PloS One. 8, (2013).</li>
<li>Duong, H. S., Le, A. D., Zhang, Q. Z., Messadi, D. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+3-dimensional+culture+system+as+an+in+vitro+model+for+studying+oral+cancer+cell+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Exp.+Pathol%22%5BJournal%5D)">A novel 3-dimensional culture system as an in vitro model for studying oral cancer cell invasion.</a> Int. J. Exp. Pathol. 86, 365-374 (2005).</li>
<li>Kirshner, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+unique+three-dimensional+model+for+evaluating+the+impact+of+therapy+on+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">A unique three-dimensional model for evaluating the impact of therapy on multiple myeloma.</a> Blood. 112, 2935-2945 (2008).</li>
<li>Gudjonsson, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Normal+and+tumor-derived+myoepithelial+cells+differ+in+their+ability+to+interact+with+luminal+breast+epithelial+cells+for+polarity+and+basement+membrane+deposition%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Normal and tumor-derived myoepithelial cells differ in their ability to interact with luminal breast epithelial cells for polarity and basement membrane deposition.</a> J. Cell Sci. 115, 39-50 (2002).</li>
<li>Kirshner, J., Chen, C. J., Liu, P., Huang, J., Shively, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CEACAM1-4S%2C+a+cell-cell+adhesion+molecule%2C+mediates+apoptosis+and+reverts+mammary+carcinoma+cells+to+a+normal+morphogenic+phenotype+in+a+3D+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci+U.S.A%22%5BJournal%5D)">CEACAM1-4S, a cell-cell adhesion molecule, mediates apoptosis and reverts mammary carcinoma cells to a normal morphogenic phenotype in a 3D culture.</a> Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 100, 521-526 (2003).</li>
<li>Weaver, V. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reversion+of+the+malignant+phenotype+of+human+breast+cells+in+three-dimensional+culture+and+in+vivo+by+integrin+blocking+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Reversion of the malignant phenotype of human breast cells in three-dimensional culture and in vivo by integrin blocking antibodies.</a> J. Cell Biol. 137, 231-245 (1997).</li>
<li>Gunn, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+natural+products+parthenolide+and+andrographolide+exhibit+anti-cancer+stem+cell+activity+in+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Leukemia+Lymphoma%22%5BJournal%5D)">The natural products parthenolide and andrographolide exhibit anti-cancer stem cell activity in multiple myeloma.</a> Leukemia Lymphoma. 52, 1085-1097 (2011).</li>
<li>Hsiao, A. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((384+hanging+drop+arrays+give+excellent+Z-factors+and+allow+versatile+formation+of+co-culture+spheroids%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">384 hanging drop arrays give excellent Z-factors and allow versatile formation of co-culture spheroids.</a> Biotechnol. Bioeng. 109, 1293-1304 (2012).</li>
<li>Meads, M. B., Gatenby, R. A., Dalton, W. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Environment-mediated+drug+resistance%3A+a+major+contributor+to+minimal+residual+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">Environment-mediated drug resistance: a major contributor to minimal residual disease.</a> Nat. Rev. Cancer. 9, 665-674 (2009).</li>
<li>Golde, D. W., Cline, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Human+Bone-Marrow+in+Liquid+Culture%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Growth of Human Bone-Marrow in Liquid Culture.</a> Blood. 41, 45-57 (1973).</li>
<li>Gartner, S., Kaplan, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long-Term+Culture+of+Human-Bone+Marrow-Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+Biol%22%5BJournal%5D)">Long-Term Culture of Human-Bone Marrow-Cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. Biol. 77, 4756-4759 (1980).</li>
<li>Caligaris-Cappio, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+bone+marrow+stromal+cells+in+the+growth+of+human+multiple+myeloma%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Role of bone marrow stromal cells in the growth of human multiple myeloma.</a> Blood. 77, 2688-2693 (1991).</li>
<li>Pike, B. L., Robinson, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+bone+marrow+colony+growth+in+agar-gel%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Human bone marrow colony growth in agar-gel.</a> J. Cell. Physiol. 76, 77-84 (1970).</li>
<li>Bug, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rho+family+small+GTPases+control+migration+of+hematopoietic+progenitor+cells+into+multicellular+spheroids+of+bone+marrow+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Leukocyte+Biol%22%5BJournal%5D)">Rho family small GTPases control migration of hematopoietic progenitor cells into multicellular spheroids of bone marrow stroma cells.</a> J. Leukocyte Biol. 72, 837-845 (2002).</li>
<li>Provenzano, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Collagen+reorganization+at+the+tumor-stromal+interface+facilitates+local+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Med%22%5BJournal%5D)">Collagen reorganization at the tumor-stromal interface facilitates local invasion.</a> BMC Med. 4, (2006).</li>
<li>Tancred, T. M., Belch, A. R., Reiman, T., Pilarski, L. M., Kirshner, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+Expression+of+Fibronectin+and+Collagens+I+and+IV+in+Multiple+Myeloma+and+Monoclonal+Gammopathy+of+Undetermined+Significance%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Histochem.+Cytochem%22%5BJournal%5D)">Altered Expression of Fibronectin and Collagens I and IV in Multiple Myeloma and Monoclonal Gammopathy of Undetermined Significance.</a> J. Histochem. Cytochem. 57, 239-247 (2009).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano nessun conflitto di interessi.

Il modello RBM fornisce un sistema completo in cui la composizione cellulare della BM è mantenuta ex vivo per un massimo di 30 giorni. Cellule BM coltivate in RBM self-stratificare in base alla loro funzione mimando l&#39;architettura BM trovato in vivo. Inoltre, questo è il primo sistema che permette l&#39;espansione del mieloma multiplo clone 8. I passi più critici per assicurare la robusta crescita delle cellule BM e il successo complessivo della coltura sono: 1) per ottenere una popolazi...

Coltura tissutale è stato sviluppato per studiare il comportamento delle cellule in un ambiente controllato per ridurre al minimo la variabilità sistemica quando si confrontano i vari processi in organismi intatti. Questo metodo è stata fondata nei primi anni del 1900 a 1,2 e si riferisce ad una tecnica in cui espianti di tessuto sono state coltivate ex vivo in un piatto di vetro. A metà del 1900 il sistema è stato adattato per far crescere le cellule disperse piuttosto che frammenti di tessuti intatti, e &#39;la cultura del tessuto&#39; i termini e &#39;di coltura cellulare&#39; diventato sinonimo 3. In tali sistemi di colture cellulari convenzionali cellule sono cresciute sulla superficie della plastica coltura di tessuti sovrapposti con terreno di coltura addizionato con diversi fattori di crescita. Due tipi di colture sono emersi sulla base delle capacità di adesione di cellule diverse: coltura di cellule aderenti, in cui le cellule si attaccano e diffondono sulla plastica coltura tissutale e colture non aderenti, in cui le cellule vengono propagate in sospensione. Fin dai primi giorni di cellacultura, più linee cellulari immortali sono state create, come HeLa 4, la prima linea di cellule di cancro umano. Queste linee cellulari hanno la capacità di proliferare indefinitamente in coltura cellulare, e la maggior parte non richiedono alcun trattamento speciale per mantenere la vitalità. L&#39;approccio riduzionista dei metodi di coltura cellulare originale è stato progettato per semplificare il sistema, per quanto possibile includendo solo i componenti minimo necessario per mantenere la vitalità e la proliferazione cellulare. Tuttavia, gli approcci di coltura cellulare semplificati non riescono a sostenere ex vivo la maggior parte dei tipi principali di cellule umane con limitata durata. Pertanto, i nuovi sistemi di coltura sono stati progettati per approssimare il microambiente tissutale più vicino possibile, permettendo così espianti di cellule di crescere in condizioni fisiologiche. In contrasto con le / approcci convenzionali di coltura cellulare riduzioniste, 3-dimensionale (3-D) sistemi di coltura stanno diventando il metodo preferito per la cultura in modo efficiente varilinee cellulari umane e cellule primarie di studiare successivamente meccanismi coinvolti nella salute e malattia, nel contesto di un microambiente favorevole. Tali sistemi 3-D sono solitamente realizzate utilizzando matrici ricostruite e / o medie, completata con fattori di crescita, per ricapitolare microambiente tissutale per studiare tipi cellulari di interesse. La prima di queste 3 dimensioni (3-D) modelli di coltura è stato sviluppato per studiare lo sviluppo della ghiandola mammaria. Per fornire le cellule con condizioni native cellule epiteliali mammarie sono stati incorporati in Matrigel, collagene IV e ricca fonte-laminina di matrice extracellulare (ECM), e ricoperto con terreno di crescita. In tali condizioni, le cellule epiteliali mammarie formano cluster somiglianti acini mammaria, e dopo stimolazione con ormoni lattogenica, questi acini secreti caseina e altre proteine ​​del latte, nel Lumena cavità delle strutture acini simili. Secrezione di caseina non è stata osservata in culture normali anche dopo aggiunta di prolattina 5, Sottolineando ulteriormente il ruolo del microambiente nel preservare le caratteristiche morfologiche e fenotipiche delle cellule. Un&#39;altra dimostrazione della perdita della normale funzione cellulare quando le cellule sono prese fuori dal contesto della loro microambiente fisiologico è la dimostrazione che senza microambiente favorevole, cheratinociti non riescono a formare epidermide stratificati 6. Un certo numero di altri modelli 3-D è stato creato per permettere a ex vivo propagazione di pile 7,8. Il ruolo cruciale del microambiente nel comportamento cellulare era elegantemente dimostrata in uno studio in cui cellule epiteliali mammarie formate &quot;inside-out&quot; acini quando coltivate in collagene I matrice, rispetto al acini polarizzata corretto e che si sono formate in Matrigel. Questa perdita di corretta morfologia è invertita quando le cellule mioepiteliali-laminina produzione sono stati aggiunti alle colture collagene I 9. Inoltre, corretta microambiente è necessario per l&#39;accuratagenotipo manifestazione. Cresciuto in un piatto, cellule tumorali mammarie MCF7 trasfettate con una cellula-cellula molecola di adesione CEACAM1 si comportano esattamente come le cellule negative CEACAM non trasfettate. Tuttavia, quando coltivate in Matrigel, a contatto con la ECM, strutture tumore-come forma di tipo selvatico MCF7 mentre MCF7 cellule trasfettate con CEACAM1 ritornano ad un fenotipo e forma normale acini con Lumena vuoto, come è stato stabilito con nonmalignant epitelio mammario 10. Analogamente, il blocco-β1 integrine in cellule di carcinoma mammario non cambia il loro comportamento in condizioni standard di coltura, ma lo stesso esperimento condotto in colture 3-D dimostra che bloccare β1-integrina ritorna cellule maligne ad un fenotipo normale 11. Pertanto, microambiente tissutale non è necessaria solo per mantenere la vitalità cellulare, ma anche di mantenere corretta funzionalità delle cellule. Oltre a fornire un sistema in cui il comportamento delle cellule può essere studiato in condizioni fisiologiches, culture 3-D funzionano mezzo robusto e affidabile per la prova preclinica di nuove terapie 8,12,13. Coltura di cellule in 3-D permette lo screening di composti sperimentali nelle condizioni di ambiente mediata farmaco-resistenza 14, in cui potrebbe essere valutato il contributo di cellula-cellula e cellula-ECM adesione. Inoltre, la tossicità fuori bersaglio di nuovi composti può essere accertata incorporando diversi compartimenti cellulari di vari tessuti. Tali schermi possono essere eseguite più rapidamente e sono più conveniente rispetto gli studi comparabili in vivo 8. Qui vi presentiamo un impostazione di un modello 3-D di midollo osseo ricostruito (RBM), dove normale e maligna del midollo osseo (BM), le cellule proliferano ex vivo in un sistema mimando il microambiente del BM umana. Precedenti tentativi di crescita delle cellule umane primarie BM nelle culture 2-D, liquido o co-colture aderenti con i vari componenti della BM stroma, O 3-D, culture agar semisolido hanno avuto un successo limitato a causa della loro incapacità di fornire le cellule con i componenti del tessuto microambiente 15-18. In questi sistemi cellule midollari primarie hanno avuto scarsa vitalità e non è riuscito a proliferare ex vivo. Un altro sistema in cui le cellule progenitrici midollari umane sono coltivate in co-colture sferoidali con cellule stromali BM è un sistema 3-D in cui è stata sostenuta vitalità e la proliferazione di cellule staminali per almeno 96 ore 19. Tuttavia, anche se di grande beneficio per la comprensione della biologia progenitrici ematopoietiche, questo sistema non fedelmente ricapitolare il microambiente del BM per l&#39;assenza di componenti ECM, pertanto, limitando la sua utilità. Il modello RBM qui descritta presenta un sistema completo in cui entrambi i compartimenti cellulari ed extracellulari della BM umano sono ricostruiti in vitro. Abbiamo dimostrato che le culture meccanismi in grado di supportare la crescita ex vivo di cellule normali BM umane, come abbiamoll come cellule isolate da pazienti con vari disturbi ematologici.

<table><tbody><tr><td>Kit di proliferazione CellTrace CFSE per citometria a flusso</td><td>Invitrogen/Life Technologies</td><td>C34554</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectina da plasma umano</td><td>Millipore</td><td>NG1884448</td><td></td></tr><tr><td>Ficoll-Paque PLUS</td><td>GE Lifesciences</td><td>17-1440-02</td><td></td></tr><tr><td>Matrice della membrana basale Matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Collagene a coda di ratto di tipo I</td><td>BD Biosciences</td><td>354249</td><td>Collagen I di Millipore non polimerizza correttamente utilizzando questo protocollo</td></tr><tr><td>Mezzo di montaggio VECTASHIELD per fluorescenza (set regolare)</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>SigmaFast Red TR/Napthol AS-MX compresse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4648</td><td>Per la colorazione TRAP</td></tr><tr><td>SigmaFast BCIP/NBT compresse</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5655</td><td>Per la colorazione con fosfatasi alcalina</td></tr><tr><td>Microscopio confocale Zeiss LSM 510&nbsp;</td><td>Software Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Zeiss 510</td> Software di analisi delle immagini <td>Carl Zeiss</td><td></td><td>Software per l'analisi confocale</td></tr><tr><td>Microscopio invertito Zeiss Axiovert 200M&nbsp;</td><td>Software Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MetaMorph</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td>Software di analisi delle immagini per citometro a flusso Axiovert 200M</td></tr><tr><td>FACSort</td><td>Software BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CellQuest Pro&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>Software per l'analisi dei dati di citometria a flusso</td></tr></tbody></table>

a three-dimensional tissue culture modello per studiare primario osso osseo e le sue malignità

A Three-dimensional Tissue Culture Model to Study Primary Human Bone Marrow and its Malignancies

Coltura di tessuti è stato uno strumento prezioso per studiare molti aspetti della funzione delle cellule, dallo sviluppo normale della malattia. Metodi di coltura cellulare convenzionali si basano sulla capacità delle cellule sia per legarsi a un substrato solido di un piatto di coltura di tessuti o di crescere in sospensione in mezzo liquido. Diverse linee cellulari immortali sono stati creati e coltivati ​​con tali approcci, tuttavia, questi metodi spesso falliscono quando le cellule primarie devono essere coltivate ex vivo. Tale guasto è stato attribuito alla mancanza dei componenti della matrice extracellulare appropriate del microambiente tessuto dai sistemi standard dove coltura tissutale di plastica è usato come superficie per la crescita cellulare. Matrice extracellulare è parte integrante del microambiente tissutale e la sua presenza è essenziale per il mantenimento delle funzioni fisiologiche come polarizzazione delle cellule, la sopravvivenza e la proliferazione. Qui vi presentiamo un metodo di coltura di tessuto a 3 dimensioni in cui il midollo osseo primario celLS sono cresciuti in matrice extracellulare formulato ricapitolare il microambiente dell&#39;osso umano (sistema RBM). Incorporato nella matrice extracellulare, cellule ricevono sostanze nutritive attraverso il mezzo supplementato con plasma umano, fornendo così un sistema completo in cui la sopravvivenza e la proliferazione cellulare possono essere mantenuti fino a 30 giorni, mantenendo la composizione cellulare del tessuto primario. Utilizzando il sistema RBM siamo cresciuti con successo le cellule del midollo osseo primarie da donatori sani che in pazienti con amiloidosi, e varie neoplasie ematologiche. Il sistema RBM permette, visualizzazione diretta in matrice tempo reale del comportamento delle cellule e la valutazione di efficacia preclinica di nuove terapie. Inoltre, le cellule possono essere isolate dal MLF e successivamente utilizzati per trapianto in vivo, selezione cellulare, citometria a flusso, e acido nucleico e proteina analisi. Nel loro insieme, il metodo RBM fornisce un sistema affidabile per la crescita di ossa primario Marrow cellule in condizioni fisiologiche.

Poiché le cellule del midollo osseo primario non riescono a proliferare in condizioni di coltura tissutale standard, il sistema di meccanismo è stato creato per imitare strettamente microambiente dell&#39;osso, fornendo un sistema di coltura ed espandere cellule BM ex vivo. I principali componenti della matrice extracellulare BM, fibronectina, collagene I, collagene IV, laminina e 21, sono state incorporate nella matrice meccanismi per fornire l&#39;impalcatura strutturale di questa cultura 3-D. Endo...

Nei metodi standard di coltura le cellule sono presi dal loro ambiente fisiologico e cresciute sulla superficie di plastica di un piatto. Per studiare il comportamento delle cellule primarie midollo osseo umano è stato creato un sistema di coltura 3-D in cui le cellule sono coltivate in condizioni riassumono il microambiente nativo del tessuto.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Tissue culture has been an invaluable tool to study many aspects of cell function, from normal development to disease. Conventional cell culture methods ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di allestire un sistema di coltura che riproduca in modo fedele il microambiente cellulare e intracellulare del midollo osseo umano. In primo luogo, la superficie di una piastra per colture cellulari viene rivestita con la matrice industriale. Successivamente, le cellule mononucleate del midollo osseo, oppure altre cellule di interesse, vengono mescolate con la matrice del midollo osseo.In seguito, la matrice industriale viene rimossa e la miscela di matrice cellulare viene aggiunta al pozzetto. Una volta che la matrice si è solidificata, viene ricoperta con mezzo di crescita. Infine, le cellule possono essere visualizzate direttamente all'interno della matrice o possono essere isolate per analisi successive rispetto ai metodi esistenti per la coltivazione cellulare.Ad esempio, metodi standard di coltura cellulare o modelli di co-coltura in cui le cellule vengono coltivate su plastica. Il principale vantaggio dell'uso di un metodo di coltura 3D è che le cellule vengono coltivate all'interno del microambiente fisiologico e quindi permette di studiare le cellule nelle condizioni native del tessuto. Preparare una piastra a 48 pozzetti

a-three-dimensional-tissue-culture-model-to-study-primary-human-bone

Research

Ricerca

JoVE Journal

Medicine

Medicina

Un sistema di coltura 3D per ematopoiesi è descritta utilizzando sangue umano corda e leucemiche cellule del midollo osseo. Il metodo si basa sull'impiego di un poliuretano poroso scaffold sintetico rivestito con proteine ​​della matrice extracellulare. Questa impalcatura è adattabile per soddisfare una vasta gamma di celle.

Ex vivo Mimicry di emopoiesi normale e anormale umana

Sono descritti metodi per creare tessuti tumorali 3D umani come sistemi di test. Queste tecnologie si basano su un decellularized biologica vascolarizzato impalcatura (BioVaSc), cellule umane primarie e una linea di cellule tumorali, che possono essere coltivate in condizioni statiche e in condizioni dinamiche in un bioreattore flusso.

Ingegneria dei tessuti di un Umano 3D<em&gt; In vitro</em&gt; Sistema Tumore test

I protocolli sono descritti per studiare la migrazione delle cellule del cancro al seno, la proliferazione e la colonizzazione in un tessuto osseo sistema modello espianto umana.

Metodi per la coltura di femore umano espianti di tessuto di studio sul carcinoma della mammella cellulare colonizzazione della nicchia metastatico

Mieloma multiplo (MM), le cellule umane richiedono il microambiente favorevole cellule mesenchimali e componenti della matrice extracellulare per la sopravvivenza e la proliferazione. Abbiamo stabilito un vivo pollo modello embrione con cellule di mieloma e mesenchimali umane trapiantate per studiare gli effetti dei farmaci anti-tumorali sulla crescita del tumore, l'invasione e l'angiogenesi.

Istituzione di un mieloma multiplo umano Xenograft modello nel pollo per studiare la crescita del tumore, invasione e l&#39;angiogenesi

Viene presentato un metodo per creare e vivere immagini diverse nicchie di midollo osseo umanizzato nei topi. Sulla base della nicchia di supporto creata da cellule mesenchimali umane, l'aggiunta di cellule endoteliali umane induce la formazione di vasi umani, mentre l'aggiunta di rhBMP-2 induce la formazione di tessuto osseo chimerico maturo umano-mouse.

Bioingegneria dei microrganismi del midollo osseo umano nel mouse e la loro visualizzazione mediante imaging live

Questo protocollo descrive lo sviluppo di un in vitro umano modello preclinico di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico in coltura con linee cellulari di cancro al seno per simulare l'interazione cellula-osteoclasto cancro. Il modello potrebbe essere utilizzato per avanzare la nostra comprensione della formazione di metastasi ossea e migliorare le opzioni terapeutiche.

Sviluppo di un modello preclinico umano di osteoclastogenesi dai monociti del sangue periferico co-coltivati con linee cellulari di cancro al seno

La coltura ex vivo degli espianti ossei può essere uno strumento prezioso per lo studio della fisiologia ossea e la potenziale valutazione dei farmaci nel rimodellamento osseo e nelle malattie ossee. Il protocollo presentato descrive la preparazione e la cultura delle calvarias isolate dai crani dei topi neonati, nonché le sue applicazioni.

Misurare il rimodellamento osseo e ricreare il microambiente tumore-osso utilizzando la co-cultura Calvaria e l'ibitorometria

Il modello di matrice extracellulare (BEM) dell'osso per osteosarcoma (OS) è ben consolidata e mostrato qui. Può essere utilizzato come impalcatura adatta per che imita tumore primario crescita in vitro e fornendo un modello ideale per studiare l'eterogeneità istologica e cytogenic del sistema operativo.

Modello di matrice extracellulare tridimensionale dell'osso per Osteosarcoma

Qui, descriviamo un sistema microfisiologico standardizzato e facile da implementare che riflette la complessità della struttura in vivo del midollo osseo umano, fornendo un modello pertinente per studiare con precisione una vasta gamma di eventi normali e patologici.

Un modello 3D di midollo osseo umano per studiare le dinamiche e le interazioni tra cellule residenti in contesti fisiologici o tumorali

Un modello in vitro della nicchia vascolare del midollo osseo viene stabilito seminando cellule mesenchimali ed endoteliali su idrogel PEG 3D prefabbricati. Le reti endoteliali, i componenti della ECM e l'attività ALP delle nicchie variano a seconda del fattore di crescita utilizzato. La piattaforma può essere utilizzata per modelli avanzati di cancro.

Semplice creazione di una nicchia vascolarizzata del midollo osseo osteogenico utilizzando idrogel prefabbricati di poli(glicole etilenico) (PEG) in una micropiastra di imaging

Questo protocollo descrive la fabbricazione di costrutti ossei 3D utilizzando osteociti umani incorporati in idrogel di gelatina metacrilata (GelMA) integrati con matrice extracellulare decellularizzata. Il metodo è a basso costo, scalabile e compatibile con le apparecchiature di laboratorio di base, offrendo una piattaforma traslazionale per lo studio dei processi delle malattie muscoloscheletriche.

Una piattaforma di coltura ossea 3D che utilizza osteociti umani e matrice extracellulare decellularizzata per la modellazione delle malattie muscoloscheletriche

Scopri la coltura tridimensionale di cellule del midollo osseo umano per studiare il microambiente fisiologico. Questo metodo consente la visualizzazione diretta e l'analisi downstream delle cellule.

A Three-dimensional Tissue Culture modello per studiare Primario Osso Osseo e le sue Malignità

Esplora altri video