Name: Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-03T19:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 33 s
Description: Impara l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX per l'espressione transitoria di geni in piante. Questi metodi funzionali permettono di studiare le interazioni pianta-patogeno e i meccanismi di resistenza.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro è parzialmente supportato dal Wageningen University Fund (WUF), dal China Scholarship Council Program for Graduate Students e da una borsa di studio NWO-VIDI 12378.

1. Condizioni di coltivazione e collaudo delle piante
<ol><li>Coltivare e mantenere piante in serre controllate o camere climatiche entro l'intervallo di temperatura di 18-22 °C e sotto regime di luce naturale o con un regime giorno/notte di 16 ore / 8 ore. Rimuovere i rami ascellari per rendere le piante più gestibili.</li>
	<li>Per le patate, mantenere le fiorine in vitro in barattoli di plastica sterili contenenti mezzo Murashige-Skoog (MS) (20 g/L di saccarosio, 5 g/L S.M. sali con vitamine, 8 g/L di agar, pH 5.8) in condizioni controllate in camere climatiche a 18 °C con regime giorno/notte di 16 ore/8 ore per due settimane e quindi trasferirli in vasi di terreno sterilizzato in compartimenti di serra regolamentati.</li>
</ol>2. Agroinfiltrazione
<ol><li>Materiale vegetale: Per Nicotiana benthamiana,utilizzare piante coltivate a semi di circa 4-5 settimane. Per la patata, utilizzare circa 4-5 settimane di trapianti da in vitro. Scegli foglie giovani, sane e completamente sviluppate per le infiltrazioni.</li>
	<li>
Cultura agrobatterio:<ol>
<li>Preparare in anticipo il mezzo YEB(tabella 1). Riempire i tubi da 50 ml con mezzo YEB da 10 ml integrato con acido solfonico di acetosyringone da 1 μl (200 mM), tampone MES da 100 μl (acido solfonico 2-(N-morfolino)-etano, 1 M) e gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD600 di circa 1,0.</li>
		<li>Raccogliere le cellule per centrifugazione a 3.000 x g per 10 min. Versare il supernatante e resospendare il pellet in mezzo MMA appena fatto(tabella 3)ad un OD600 di 0,3. Delicatamente cellule vortice per ripreposerle. Per la coinfiltrazione di due ceppi batterici, mescolare la coltura in un rapporto 1:1.</li>
		<li>Lasciare la coltura in panchina a temperatura ambiente per 1-6 ore prima delle infiltrazioni. Nel frattempo, etichettare le piante da infiltrare e la data dell'esperimento.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infiltrazioni: Utilizzare una siringa senza ago da 1 ml per infiltrarsi nelle sospensioni agrobacterium. Iniettare con attenzione e lentamente pannelli fogliari con le sospensioni dalla siringa (per motivi di salute e sicurezza la protezione degli occhi deve essere indossata durante questo processo). Infiltrarsi in almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati. Nota: Normalmente, 1 ml di sospensioni agrobatterio potrebbe essere sufficiente per 3 piante di N. benthamiana. Per la patata, è necessaria una maggiore sospensione perché le foglie delle specie Solanum sono più difficili da infiltrare. I volumi richiesti di sospensioni dipendono dalla specie Solanum. Evitare la contaminazione incrociata cambiando guanti o sterilizzando guanti con etanolo tra infiltrazioni e non annaffiando le piante fino al giorno dopo l'inoculazione.</li>
	<li>punteggio: Segnare risposte macroscopiche circa 3 giorni dopo l'infiltrazione quando il fenotipo di morte cellulare è chiaro (Figura 1). Se il fenotipo di morte cellulare è quantitativo, utilizzare i criteri specificati (Figura 2). In breve, le scale per il punteggio macroscopico della morte cellulare dipendono principalmente dalle percentuali di morte cellulare dell'area infiltrata. Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. Se lo si desidera, il punteggio macroscopico può anche essere valutato quantitativamente utilizzando moderne apparecchiature di foto-imaging.</li>
</ol>3. Agroinfezione PVX
<ol><li>Materiale vegetale: Per N. benthamiana,utilizzare circa 2-3 settimane di piante coltivate a semi. Per la patata, utilizzare circa 2-3 settimane di trapianti da in vitro. Per i test su larga scala, utilizzare piante leggermente più vecchie (4-5 settimane), poiché queste piante hanno foglie sempre più grandi per ospitare un numero maggiore di macchie di inoculazione di Agrobacterium.</li>
	<li>
Coltivazione dell'agrobatterio:<ol>
<li>Preparare il mezzo YEB in anticipo. Riempire i tubi da 10 ml con 3 ml di YEB integrati con gli antibiotici appropriati. Pipetta 20 μl di glicerolo dei ceppi desiderati(tabella 2) (contenente il gene di interesse) nello YEB. Inizia le colture per tutti i ceppi di Agrobacterium in questo saggio allo stesso tempo. Incubare le cellule tremando per 1-2 giorni a 28 °C e 200 giri/min a un OD600 di circa 1,0.</li>
		<li>Pipetta circa 300 μl di ogni ceppo agrobatterio e stenderli su piastre medie di agar solido LB integrate con gli antibiotici appropriati e incubare le cellule a 28 °C per 1-2 giorni.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Infezioni: Usa una spatola per raccogliere la coltura di Agrobacterium nel piatto. Immergere uno stuzzicadenti di legno nella coltura di Agrobacterium sulla spatola e perforare le foglie per inoculare una grande quantità di batteri. Inoculare almeno tre piante per ogni ceppo. Utilizzare tre foglie per pianta per servire come triplicati. In ogni foglia, creare più siti di inoculazione per ogni ceppo.</li>
	<li>punteggio: Segnare risposte macroscopiche circa due settimane dopo l'inoculazione (Figura 3). Per gli schermi ad alta velocità effettiva, registrare le risposte qualitative (sì/no) per ogni punto di inoculazione. Quindi calcola la percentuale di siti che rispondono e confrontali con i controlli.</li>
</ol>

<ol><li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+and+exploiting+late+blight+resistance+in+the+age+of+effectors%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">Understanding and exploiting late blight resistance in the age of effectors.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 49, 507-531 (2011).</li>
<li>Ellis, J. G., Rafiqi, M., Gan, P., Chakrabarti, A., Dodds, P. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recent+progress+in+discovery+and+functional+analysis+of+effector+proteins+of+fungal+and+oomycete+plant+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Plant+Biol%22%5BJournal%5D)">Recent progress in discovery and functional analysis of effector proteins of fungal and oomycete plant pathogens.</a> Curr. Opin. Plant Biol. 12, 399-405 (2009).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+genomics+accelerates+discovery+and+functional+profiling+of+potato+disease+resistance+and+Phytophthora+infestans+avirulence+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Effector genomics accelerates discovery and functional profiling of potato disease resistance and Phytophthora infestans avirulence genes.</a> Plos One. 3, 1-10 (2008).</li>
<li>Oh, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+screens+of+Phytophthora+infestans+RXLR+effectors+reveal+diverse+phenotypes%2C+including+activation+of+the+Solanum+bulbocastanum+disease+resistance+protein+Rpi-blb2%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">In planta expression screens of Phytophthora infestans RXLR effectors reveal diverse phenotypes, including activation of the Solanum bulbocastanum disease resistance protein Rpi-blb2.</a> Plant Cell. 21, 2928-2947 (2009).</li>
<li>Tyler, B. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phytophthora+genome+sequences+uncover+evolutionary+origins+and+mechanisms+of+pathogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Phytophthora genome sequences uncover evolutionary origins and mechanisms of pathogenesis.</a> Science. 313, 1261-1266 (2006).</li>
<li>Haas, B. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+and+analysis+of+the+Irish+potato+famine+pathogen+Phytophthora+infestans%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Genome sequence and analysis of the Irish potato famine pathogen Phytophthora infestans.</a> Nature. 461, 393-398 (2009).</li>
<li>Levesque, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome+sequence+of+the+necrotrophic+plant+pathogen+Pythium+ultimum+reveals+original+pathogenicity+mechanisms+and+effector+repertoire%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genome sequence of the necrotrophic plant pathogen Pythium ultimum reveals original pathogenicity mechanisms and effector repertoire.</a> Genome Biol. 11, 1-22 (2010).</li>
<li>Lamour, K. H., Win, J., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oomycete+genomics%3A+new+insights+and+future+directions%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Microbiol.+Lett%22%5BJournal%5D)">Oomycete genomics: new insights and future directions.</a> FEMS Microbiol. Lett. 274, 1-8 (2007).</li>
<li>Stassen, J. H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effector+identification+in+the+lettuce+downy+mildew+Bremia+lactucae+by+massively+parallel+transcriptome+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Effector identification in the lettuce downy mildew Bremia lactucae by massively parallel transcriptome sequencing.</a> Mol. Plant Pathol. 13, 719-731 (2012).</li>
<li>Kemen, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gain+and+loss+during+evolution+of+obligate+parasitism+in+the+white+rust+pathogen+of+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Gene gain and loss during evolution of obligate parasitism in the white rust pathogen of Arabidopsis thaliana.</a> PLoS Biol. 9, 1-21 (2011).</li>
<li>Win, J., et al. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWin%2C+J+%22Effector+biology+of+plant-associated+organisms%3A+concepts+and+perspectives%22">Effector biology of plant-associated organisms: concepts and perspectives</a>. , Cold Spring Harbor. 1-13 (2012).</li>
<li>Hogenhout, S. A., van der Hoorn, R. A. L., Terauchi, R., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+concepts+in+effector+biology+of+plant-associated+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Emerging concepts in effector biology of plant-associated organisms.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 22, 115-122 (2009).</li>
<li>Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+catalogue+of+the+effector+secretome+of+plant+pathogenic+oomycetes%5BTitle%5D)+AND+%22Ann.+Rev.+Phytopathol%22%5BJournal%5D)">A catalogue of the effector secretome of plant pathogenic oomycetes.</a> Ann. Rev. Phytopathol. 44, 41-60 (2006).</li>
<li>van der Hoorn, R. A. L., Laurent, F., Roth, R., De Wit, P. J. G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfiltration+is+a+versatile+tool+that+facilitates+comparative+analyses+of+Avr9%2FCf-9-induced+and+Avr4%2FCf-4-induced+necrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Microbe+Interact%22%5BJournal%5D)">Agroinfiltration is a versatile tool that facilitates comparative analyses of Avr9/Cf-9-induced and Avr4/Cf-4-induced necrosis.</a> Mol. Plant Microbe Interact. 13, 439-446 (2000).</li>
<li>Dangl, J. L., Jones, J. D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plant+pathogens+and+integrated+defence+responses+to+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Plant pathogens and integrated defence responses to infection.</a> Nature. 411, 826-833 (2001).</li>
<li>Kapila, J., de Rycke, R., van Montagu, M., Angenon, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+system+for+intact+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">An Agrobacterium-mediated transient gene expression system for intact leaves.</a> Plant Sci. 122, 101-108 (1997).</li>
<li>Kanneganti, T. D., Huitema, E., Kamoun, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+of+oomycete+and+fungal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">In planta expression of oomycete and fungal genes.</a> Methods Mol. Biol. 354, 35-43 (2007).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. G. A., Rietman, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+planta+expression+systems.+Oomycete+Genetics+and+Genomics%5BTitle%5D)+AND+%22Diversity%2C+Interactions%2C+and+Research+Tools%22%5BJournal%5D)">In planta expression systems. Oomycete Genetics and Genomics.</a> Diversity, Interactions, and Research Tools. Lamour, K., Kamoun, S. 23, 455-475 (2009).</li>
<li>Peng, W. T., Lee, Y. W., Nester, E. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phenolic+recognition+profiles+of+the+Agrobacterium+tumefaciens+VirA+protein+are+broadened+by+a+high+level+of+the+sugar+binding+protein+ChvE%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">The phenolic recognition profiles of the Agrobacterium tumefaciens VirA protein are broadened by a high level of the sugar binding protein ChvE.</a> J. Bacteriol. 180, 5632-5638 (1998).</li>
<li>Lu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+throughput+virus-induced+gene+silencing+implicates+heat+shock+protein+90+in+plant+disease+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">High throughput virus-induced gene silencing implicates heat shock protein 90 in plant disease resistance.</a> EMBO J. 22, 5690-5699 (2003).</li>
<li>Ma, L., Lukasik, E., Gawehns, F., Takken, F. L. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+agroinfiltration+for+transient+expression+of+plant+resistance+and+fungal+effector+proteins+in+Nicotiana+benthamiana+leaves%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The use of agroinfiltration for transient expression of plant resistance and fungal effector proteins in Nicotiana benthamiana leaves.</a> Methods Mol. Biol. 835, 61-74 (2012).</li>
<li>Bhaskar, P. B., Venkateshwaran, M., Wu, L., Ané, J. M., Jiang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agrobacterium-mediated+transient+gene+expression+and+silencing%3A+A+rapid+tool+for+functional+gene+assay+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plos+One%22%5BJournal%5D)">Agrobacterium-mediated transient gene expression and silencing: A rapid tool for functional gene assay in potato.</a> Plos One. 4, 1-8 (2009).</li>
<li>van der Fits, L., Deakin, E. A., Hoge, J. H. C., Memelink, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ternary+transformation+system%3A+constitutive+virG+on+a+compatible+plasmid+dramatically+increases+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The ternary transformation system: constitutive virG on a compatible plasmid dramatically increases Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 43, 495-502 (2000).</li>
<li>Huang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparative+genomics+enabled+the+isolation+of+the+R3a+late+blight+resistance+gene+in+potato%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+J%22%5BJournal%5D)">Comparative genomics enabled the isolation of the R3a late blight resistance gene in potato.</a> Plant J. 42, 251-261 (2005).</li>
<li>Armstrong, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+ancestral+oomycete+locus+contains+late+blight+avirulence+gene+Avr3a%2C+encoding+a+protein+that+is+recognized+in+the+host+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">An ancestral oomycete locus contains late blight avirulence gene Avr3a, encoding a protein that is recognized in the host cytoplasm.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 7766-7771 (2005).</li>
<li>Kim, H. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Broad+spectrum+late+blight+resistance+in+potato+differential+set+plants+MaR8+and+MaR9+is+conferred+by+multiple+stacked+R+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Theor.+Appl.+Genet%22%5BJournal%5D)">Broad spectrum late blight resistance in potato differential set plants MaR8 and MaR9 is conferred by multiple stacked R genes.</a> Theor. Appl. Genet. 124, 923-935 (2012).</li>
<li>Torto, T. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EST+mining+and+functional+expression+assays+identify+extracellular+effector+proteins+from+the+plant+pathogen+Phytophthora%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">EST mining and functional expression assays identify extracellular effector proteins from the plant pathogen Phytophthora.</a> Genome Res. 13, 1675-1685 (2003).</li>
<li>Vleeshouwers, V. G. A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agroinfection-based+high-throughput+screening+reveals+specific+recognition+of+INF+elicitins+in+Solanum%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Plant+Pathol%22%5BJournal%5D)">Agroinfection-based high-throughput screening reveals specific recognition of INF elicitins in Solanum.</a> Mol. Plant Pathol. 7, 499-510 (2006).</li>
<li>Koncz, C., Schell, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+promoter+of+TL-DNA+gene+5+controls+the+tissue-specific+expression+of+chimeric+genes+carried+by+a+novel+type+of+agrobacterium+binary%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Gen.+Genet%22%5BJournal%5D)">The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimeric genes carried by a novel type of agrobacterium binary.</a> Mol. Gen. Genet. 204, 383-396 (1986).</li>
<li>Lazo, G. R., Stein, P. A., Ludwig, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+DNA+transformation-competent+Arabidopsis+genomic+library+in+Agrobacterium%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-Technol%22%5BJournal%5D)">A DNA transformation-competent Arabidopsis genomic library in Agrobacterium.</a> Bio-Technol. 9, 963-967 (1991).</li>
<li>Rietman, H. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Putting+the+Phytophthora+infestans+genome+sequence+at+work%3B+multiple+novel+avirulence+and+potato+resistance+gene+candidates+revealed+%5B+%5D%22">Putting the Phytophthora infestans genome sequence at work; multiple novel avirulence and potato resistance gene candidates revealed [PhD thesis]</a>. , Wageningen University. (2011).</li>
<li>Wroblewski, T., Tomczak, A., Michelmore, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimization+of+Agrobacterium-mediated+transient+assays+of+gene+expression+in+lettuce%2C+tomato+and+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Biotechnol.+J%22%5BJournal%5D)">Optimization of Agrobacterium-mediated transient assays of gene expression in lettuce, tomato and Arabidopsis.</a> Plant Biotechnol. J. 3, 259-273 (2005).</li>
<li>van engelen, F. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((pBINPLUS+-+an+improved+plant+transformation+vector+based+on+pBIN19%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">pBINPLUS - an improved plant transformation vector based on pBIN19.</a> Transgenic Res. 4, 288-290 (1995).</li>
<li>Karimi, M., Inze, D., Depicker, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((GATEWAYTM+vectors+for+Agrobacterium-mediated+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Plant+Sci%22%5BJournal%5D)">GATEWAYTM vectors for Agrobacterium-mediated plant transformation.</a> Trends Plant Sci. 7, 193-195 (2002).</li>
<li>Xiang, C. B., Han, P., Lutziger, I., Wang, K., Oliver, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mini+binary+vector+series+for+plant+transformation%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">A mini binary vector series for plant transformation.</a> Plant Mol. Biol. 40, 711-717 (1999).</li>
<li>Curtis, M. D., Grossniklaus, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+gateway+cloning+vector+set+for+high-throughput+functional+analysis+of+genes+in+planta%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Physiol%22%5BJournal%5D)">A gateway cloning vector set for high-throughput functional analysis of genes in planta.</a> Plant Physiol. 133, 462-469 (2003).</li>
</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Saggi transitori come l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione sono metodi efficienti che sono vitali per la moderna ricerca sulla patologia vegetale molecolare. Nonostante alcune limitazioni, questi metodi soddisfano la domanda di analisi funzionali ad alta produttività efficienti e robuste negli impianti.
Il sistema di agroinfiltrazione è un saggio funzionale ampiamente utilizzato in una serie di specie vegetali. L'agroinfiltrazione facilita la consegna di diversi transgeni nella stessa cellula con espressione simultanea di proteine interagenti. Questo è vantaggioso per ricapitolare le relazioni R-AVR, coniando ceppi di Agrobacterium che esprimono geni Avr con ceppi che esprimono i geni R corrispondenti. Inoltre, per le coppie R-AVR note, tali coinfiltrazioni possono essere utilizzate come controlli positivi. L'inclusione di tali controlli è importante perché in alcuni genotipi dell'impianto, l'efficienza di trasformazione può essere inferiore alla soglia per rilevare le risposte. Includere controlli negativi, ad esempio un ceppo di Agrobatteri contenenti un vettore senza un inserto genico, è anche essenziale per determinare se un certo genotipo vegetale solleva risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium. Questa caratteristica si verifica a una certa frequenza nel germplasma delle patate, e non tutte le specie Solanum sono ben adatte per questo sistema di espressione a base di Agrobacterium. Generalmente, il saggio di agroinfiltrazione funziona molto bene in N. benthamiana e nella maggior parte dei genotipi di patate. Oltre all'effettioromica, ci sono varie altre potenziali applicazioni per la tecnica di agroinfiltrazione, come la produzione di proteine dai transgeni e la localizzazione proteica nelle cellule vegetali mediante microscopia confocale.
L'agroinfezione PVX è un sistema di screening altamente sensibile e in genere più adatto per screening ad alta produttività. Poiché l'Agrobacterium è ora presente solo localmente, le risposte non specifiche a questo batterio non sono ora molto inquietanti, poiché il virus PVX assume un'ulteriore diffusione del transgene. Tuttavia, le piante possono essere resistenti al PVX o montare risposte di resistenza estrema (ER) e in tal caso il metodo di agroinfezione non è adatto. Un'altra limitazione del metodo di agroinfezione PVX è la dimensione dell'inserto del gene di interesse. I fenotipi osservati di risposte possono variare da un'intensa necrosi nera che circonda la ferita a una debole necrosi vicino al punto di inoculazione. Sia nelle specie N. benthamiana che Solanum, l'agroinfezione PVX è riconosciuta come più sensibile dell'agroinfiltrazione.
Tenendo conto del fatto che il background genetico dei diversi genotipi vegetali testati può avere alcune restrizioni (vedi sopra), generalmente otteniamo conclusioni simili per agroinfezione PVX e agroinfiltrazione. Questi risultati sono comparabili anche come si ottengono in altri saggi, come le infiltrazioni proteiche29 ed ELISA3. Considerando i vantaggi e i limiti di entrambi i sistemi, si consiglia di utilizzare entrambi i metodi per completarsi a vicenda o confermare risultati indipendenti.

L'effectoromica, un approccio genomico funzionale ad alta produttività è recentemente emerso come un potente strumento per identificare igeni di resistenza (R)nelle piante coltivate e abbinare i geni di avirulenza(Avr)degli agenti patogeni1-4. In contrasto con la trasformazione stabile più dispendiosa in termini di tempo con i geni R, la strategia dell'effettoromica si basa su saggi transitori di sequenze geniche patogene.
Fin dall'era genomica, i genomi degli agenti patogeni vegetali sono stati ampiamente esplorati. Ad esempio per gli oomiceti, che includono gli agenti patogeni vegetali più devastanti, sono state generate e analizzate grandi raccolte di sequenze per geni che svolgono un ruolo durantel'interazione con la pianta 5-10. Una classe di proteine patogene rappresenta gli effettori, che manipolano la struttura e la funzione delle cellule ospiti sia per facilitare l'infezione (fattori di virulenza) sia per innescare risposte di difesa (fattori di avirulenza)11-13. L'espressione dei geni Avr nelle cellule vegetali contenenti geni R di solito si traduce nella risposta di morte cellulare ipersensibile (HR)14,15. Nella planta espressione dei geni R e Avr può essere realizzata utilizzando sistemi di espressione transitoria come Agrobacterium tumefaciens -trasformazione transitoria basata sulla base (agroinfiltrazione)16. Questa trasformazione transitoria può essere applicata anche in combinazione con sistemi di espressione virale (agroinfezione)17,18.
Per l'agroinfiltrazione, l'agente più comunemente usato è A . tumefaciens, un'ampia gamma di agenti patogeni delle piante dicot. Un tumefaciens contiene un plasmide che induce il tumore (Ti). Trasferire il DNA (T-DNA) da un plasmide Ti si trasferirà nelle cellule vegetali dopo l'attivazione del meccanismo di virulenza del batterio. Questo può essere innescato nelle cellule vegetali ferite, dai composti fenolici a basso peso molecolare rilasciati e dai monosaccaridi in un ambiente leggermente acido19. Il gene della virulenza si attiva dopo l'infiltrazione delle sospensioni dell'Agrobacterium nei pannelli fogliari definiti dalle vene maggiori. Quindi le cellule vegetali nei pannelli fogliari saranno trasformate ed esprimeranno i transgeni contenuti nella regione T-DNA.
L'agroinfezione si basa sull'Agrobatterioinoculato dalla ferita , che media la traslocazione di un virus alle cellule vegetali. Il virus si diffonde quindi ulteriormente ai tessuti vegetali adiacenti, in assenza di Agrobacterium. Per l'agroinfezione, è possibile utilizzare diversi virus vegetali. I virus dell'RNA sono vettori ideali per l'espressione genica perché possono moltiplicarsi a livelli molto alti nelle piante infette. Tra i virus dell'RNA vegetale, Potato Virus X (PVX) è ampiamente utilizzato per gli schermi di effettioromica. Per facilitare i test funzionali per un gene inserito, i vettori binari che contengono il genoma PVX affiancato dal promotore del virus del mosaico di Cavolfiore 35S e dal terminatore della nopalina sintasi, sono stati clonati nel T-DNA di A. tumefaciens20. Dopo che il T-DNA è stato trasferito in cellule vegetali, il genoma PVX contenuto nel T-DNA viene trascritto dal promotore 35S. Quindi le particelle virali si diffondono sistemicamente nelle piante infette, con conseguente espressione del gene inserito. Questo metodo basato sia sull'Agrobatterio che sul PVX è chiamato agroinfezione PVX.
Qui mostriamo esempi sia per i saggi di agroinfiltrazione che per i saggi di agroinfezione PVX. Come piante ospiti utilizziamo il germoplasma delle patate(sezione Solanum Petota), per il quale gli approcci di effettioromica sono stati pionieri e si sonodimostrati efficaci 3,4. Utilizziamo anche Nicotiana benthamiana,rinomata come impianto modello nelle piante Solanaceous 14,21,22.

<table><tbody><tr><td>Estratto di manzo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B4888</td><td></td></tr><tr><td>Peptone batteriologico</td><td>Oxoid</td><td>LP0037</td><td></td></tr><tr><td>Estratto di lievito</td><td>Oxoid</td><td>LP0021</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4</td><td>Sigma-Aldrich 208094</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sali MS (senza vitamine)</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0221</td><td></td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo in polvere</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td></td></tr><tr><td>Siringa (1 ml)</td><td>BD Plastipak</td><td>300013</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore</td><td>Infors HT</td><td>Multitron II</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga</td><td>Heraeus</td><td>Multifuge 3S-R</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Biofotometro Eppendorf</td><td>6131</td><td></td></tr></tbody></table>

agroinfiltrazione e agroinfezione pvx in benthamiana di patate e nicotiana

Agroinfiltration and PVX Agroinfection in Potato and Nicotiana benthamiana

Agroinfiltrazione e agroinfezione PVX sono due efficaci saggi di espressione transitoria per l'analisi funzionale dei geni candidati nelle piante. L'agente più comunemente usato per l'agroinfiltrazione è Agrobacterium tumefaciens, un agente patogeno di molte specie di piante dicot. Ciò implica che l'agroinfiltrazione può essere applicata a molte specie vegetali. Qui presentiamo i nostri protocolli e i risultati attesi quando applichiamo questi metodi allapatata (Solanum tuberosum),alle sue specie solanum porta tuberiche selvatiche correlate(sezione Solanum Petota)e alla pianta modello Nicotiana benthamiana. Oltre all'analisi funzionale di singoli geni, come i geni di resistenza (R) o avirulenza(Avr), il saggio di agroinfiltrazione è molto adatto per ricapitolare le interazioni R-AVR associate a specifiche interazioni patogene ospiti semplicemente fornendo transgeni R e Avr nella stessa cellula. Tuttavia, alcuni genotipi vegetali possono aumentare le risposte di difesa non specifiche all'Agrobacterium, come abbiamo osservato ad esempio per diversi genotipi di patate. Rispetto all'agroinfiltrazione, il rilevamento dell'attività AVR con agroinfezione PVX è più sensibile, più ad alto throughput negli schermi funzionali e meno sensibile alle risposte di difesa aspecifiche all'Agrobacterium. Tuttavia, può verificarsi una difesa aspecifica del PVX e c'è il rischio di perdere risposte a causa di una resistenza estrema indotta da virus. Nonostante tali limitazioni, nella nostra esperienza, l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono saggi adatti e complementari che possono essere utilizzati contemporaneamente per confermare i risultati l'uno dell'altro.

La figura 1 mostra un esperimento rappresentativo di agroinfiltrazione con 7 diversi effettori (E1-E7) in patate e N. benthamiana. La morte cellulare appare nei pannelli fogliari infiltrati circa 3 giorni dopo l'infiltrazione. L'estensione del fenotipo di morte cellulare deve essere confrontata con i controlli. Una miscela del ceppo Agrobacterium AGL1(pVirG)23 contenente pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a è stata utilizzata come controllo positivo24,25, mentre AGL1(pVirG) è stato utilizzato come controllo negativo. Le figure 1A e 1B mostrano buoni esempi di agroinfiltrazione nel genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8)26 e N. benthamiana, rispettivamente, che sono molto suscettibili di agroinfiltrazione. C'è una morte cellulare confluente nel pannello fogliare coinfiltrato con controllo positivo, mentre non si verifica alcuna risposta di morte cellulare con controllo negativo o pBINplus-R3a. In MaR8, due effettori AVR3a (E2) e AVR4 (E3) inducono una morte cellulare, mentre gli altri effettori (E1 ed E4-E7) non lo fanno. In N. benthamiana, nessuno degli effettori testati induce una risposta di morte cellulare. Le figure 1C e 1D mostrano esempi di agroinfiltrazione nella patata selvatica Solanum berthaultii 483-1 e Solanum rechei 210-5, che non sono ben disponibili per la tecnica di agroinfiltrazione. In S. berthaultii 483-1, il tessuto fogliare mostra una necrosi non specifica ai controlli negativi e a tutti gli effettori testati. In S. rechei 210-5, i pannelli fogliari infiltrati mostrano una risposta di morte cellulare molto debole al controllo positivo.
La figura 2 mostra una serie di scale di punteggio che possono essere utilizzate per quantificare la risposta all'Agrobatterio agroinfiltrato . Le percentuali di morte cellulare sono raffigurate su una scala dello 0-100%. I fenotipi osservati vanno da sintomi macroscopicamente non visibili (0%), attraverso una serie di risposte intermedie che mostrano clorosi e livelli crescenti di morte cellulare, fino alla morte cellulare confluente (100%).
La figura 3 mostra un esperimento rappresentativo dopo l'agroinfezione PVX nella patata. Normalmente, l'espansione della morte cellulare può essere trovata nei siti circa due settimane dopo l'inoculazione del dente. Come mostrato in entrambi i pannelli di figura, la morte cellulare in espansione è presente nei siti che sono stati inoculati con pGR106-CRN2 (controllo positivo usando l'effettore crinkler Crn2), che è un gene che induce la morte cellulare generale da P. infestans27. A parte una risposta minore al mento, non si nota alcuna morte cellulare in espansione nei siti che sono stati inoculati con il pGR106-vuoto (controllo negativo). Nella figura 3A, che rappresenta il genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3), due effetti pGR106 (E1 ed E2) non hanno indotto la morte cellulare. Nella figura 3Bviene presentato un risultato positivo dello screening dell'effettore nella selvaggia Solanum huancabambense 354-1; la risposta di morte cellulare è stata osservata a due pGR106-effettori (E1-E3, che rappresentano le elicitina)28.
<img alt="Figure 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig1.jpg"> Figura 1. Esempi di agroinfiltrazione in patate e N. benthamiana. Piante tra cui (A) un genotipo di patata MaR8 (Mastenbroek R8), (B) N. benthamiana, (C) Solanum berthaultii 483-1 e (D) Solanum rechei 210-5 sono stati infiltrati con una miscela del ceppo agrobatterio AGL1(pVirG) 23 contenente pBINplus-R3a e pK7WG2-AVR3a (controllo positivo), AGL1(pvirG) (controllo negativo), pBINplus-R3a, e sette effettori (E1-E7). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig2.jpg"> Figura 2. Quantificazione delle risposte agroinfiltrazione. La fotografia mostra scale di punteggio rappresentative per la morte cellulare, che vanno dallo 0% (nessun sintomo) al 100% (morte cellulare confluente). Le risposte intermedie vanno da risposte deboli come la clorosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
<img alt="Figure 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971fig3.jpg"> Figura 3. Esempi di agroinfezione PVX in patate. Genotipo di patata MaR3 (Mastenbroek R3) (A) e Solanum huancabambense 354-1 (B) dente inoculato con pGR106-CRN2 (controllo positivo), pGR106-vuoto (controllo negativo) e pGR106-E1-2 (effettori) o pGR106-E1-E3, rispettivamente. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50971/50971fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine più grande</a>.
La tabella 1. Mezzo YEB
<table border="1"><tbody>
<tr>
<td>1 L</td>
			<td>distillato H2O</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>saccarosio</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>estratto di manzo</td>
		</tr>
<tr>
<td>5 g</td>
			<td>peptone batteriologico</td>
		</tr>
<tr>
<td>1 g</td>
			<td>estratto di lievito</td>
		</tr>
<tr>
<td>2 ml</td>
			<td>MgSO4 (1 M)</td>
		</tr>
</tbody></table>La tabella 2. Vettori e ceppi utilizzati per l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX. È possibile utilizzare diversi vettori binari. I vettori nella lista seguente consentono un'alta espressione dei geni candidati e hanno funzionato bene nelle nostre mani. Preferiamo utilizzare il ceppo Agrobacterium GV3101(pMP90)29 in N. benthamiana e trovare AGL130 contenente il pVirG plasmide aiutante (pBBR1MCS-5.virGN54D)23 più adatto nellapatata 31. Ulteriori ceppi sono stati analizzati in altri gruppi su varie piante modello tra cui N. benthamiana ma non nella patata32.
<img alt="Table 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table2.jpg">
GW: gateway versione36
La tabella 3. Media MMA. <img alt="Table 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50971/50971table3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50971/50971table3.jpg">
Regolare il pH a 5,6.

L'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX sono test funzionali di routine per l'espressione ectopica transitoria dei geni nelle piante. Questi metodi sono test efficienti nelle strategie di effettioromica (rapida resistenza e scoperta del gene dell'avirulenza) e cruciali per la moderna ricerca nella patologia vegetale molecolare. Soddisfano la domanda di solide analisi funzionali ad alta produttività negli impianti.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Agroinfiltration and PVX agroinfection are two efficient transient expression assays for functional analysis of candidate genes in plants. The most ...

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare se gli effettori dei patogeni vengano riconosciuti dalle proteine di resistenza nelle piante. Questo viene ottenuto innanzitutto infettando le foglie delle piante con una coltura liquida di agrobatterio oppure mediante infezione agro con PVX, che esprimerà transitoriamente gli effettori nel tessuto vegetale. Successivamente, le piante vengono lasciate incubare e vengono valutate per la morte cellulare.Si ottengono risultati che mostrano risposte di morte cellulare in seguito al riconoscimento di defettori espressi in modo transitorio da proteine di resistenza nelle piante. Il principale vantaggio di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti, come gli studi genetici con marcatori molecolari, è che si tratta di saggi funzionali. Essi non solo mostrano che il gene di resistenza è presente nella pianta, ma anche che è funzionante e che le risposte di difesa vengono attivamente indotte.Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande fondamentali nella patologia molecolare delle piante, come la rapida identificazione di geni di resistenza a bot, RA e AFI, la cui disponibilità di entrambe le sequenze genomiche sarà dimostrata mediante la procedura eseguita da du, uno studente di dottorato di un laboratorio per generare piante di patata. Mantenere le piantine in vitro in barattoli di plastica sterili contenenti mezzo di Murashige e Scoog (MS) in camere climatiche a 18 gradi Celsius con un regime di 16 ore di luce e 8 ore di buio per due settimane. Quando le piante sviluppano radici bianche, trasferirle in vasi contenenti terreno sterilizzato.In compartimenti di serra regolati per piante utilizzate in questi esperimenti, utilizzare piantine di NCOA hamana di quattro-cinque settimane e talee di patata di quattro-cinque settimane generate in vitro. Per preparare la coltura di agrobatterio, iniziare riempiendo provette da 50 millilitri con 10 millilitri di mezzo YEB, integrato con un microlitro di acetofenone, 100 microlitri di MES e gli antibiotici appropriati. Successivamente, pipettare 20 microlitri di stock glicerolato dei ceppi desiderati di agrobatterio contenenti il gene di interesse nel mezzo YEB.Incubare le colture a 28 gradi Celsius e 200 giri al minuto (RPM) per uno o due giorni fino a un OD 600 di circa 1,0. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3000 ×g per 10 minuti. Quindi eliminare il soprannatante e risospendere il pellet.In mezzo MMA appena preparato fino a un OD 600 di 0,3. Vortexare delicatamente le cellule per ri-sospendere e consentire la co-infiltrazione di due ceppi batterici. Mescolare la coltura in rapporto uno a uno.Lasciare le colture a temperatura ambiente per uno a sei ore prima di infiltrare le piante. Nel frattempo, etichettare le piante da infiltrare con il ceppo e la data dell'esperimento, eseguendo le infiltrazioni indossando protezioni per gli occhi. Utilizzare una siringa da un millilitro senza ago per iniettare con attenzione e lentamente le sospensioni di agrobatterio nelle foglie.Iniettare almeno tre piante e tre foglie per pianta, in modo da avere delle triplicazioni e prevenire contaminazioni incrociate. Cambiare o sterilizzare i guanti tra un'infiltrazione e l'altra ed evitare di innaffiare le piante fino al giorno successivo. Circa tre giorni dopo l'infiltrazione, valutare l'inoculo assegnando un punteggio alla morte cellulare su una scala da 0 a 100%, dove 0 indica l'assenza di sintomi.100% indicante morte cellulare confluenziale e valori intermedi che vanno dalla sclerosi a livelli crescenti di morte cellulare. Eseguire l'agroinfezione con PVX su piante di tabacco e di patata coltivate in vitro, rispettivamente di due-tre settimane di età, utilizzando tre millilitri di terreno YEB supplementato con antibiotici. Aggiungere 20 microlitri di stock glicerolato di agrobatterio e incubare a 28 gradi Celsius e 200 RPM fino a un OD 600 di circa 1,0.Spargere circa 300 microlitri di ciascun ceppo di agrobatterio su piastre di agar LB con antibiotici e incubare a 28 gradi Celsius per uno o due giorni. Utilizzare una spatola per raccogliere l'agrobatterio. Quindi inoculare una foglia con una grande quantità di batteri.Inserire uno stuzzicadenti nella coltura e utilizzarlo per forare la pianta. Inoculare ogni foglia in più posizioni, con un numero di foglie per pianta e tre piante per ceppo. Due settimane dopo l'inoculazione, valutare macroscopicamente registrando ogni lesione qualitativamente come sì o no.Quindi calcolare la percentuale di siti rispondenti e confrontarla con i controlli mostrati. Di seguito sono riportati risultati rappresentativi dell'agroinfiltrazione in end hamana e in due specie di patata, Solenium JI 3 49 dash three e CV Desiree, circa tre giorni dopo l'inoculazione. Si osserva morte cellulare confluenziale nel pannello fogliare co-infiltrato con la miscela di ceppo di agrobatterio AGL one PVRG contenente P bin più R three A e PK seven WG two A VR three A, mentre nessuna risposta di morte si verifica con il controllo negativo PI più R three A o PK seven WG two A VR three A. In questa figura, l'agroinfezione da PVX in n e in due specie di patata, S one Kae 3 54 dash one e S micro DOUM 360 dash one, è mostrata circa due settimane dopo l'inoculazione.Si osserva una morte cellulare in espansione nei siti inoculati con il controllo positivo PGR 1 0 6 CRN due, che codifica un gene induttore generale della morte cellulare da Phytophthora Infestans, e PGR 1 0 6 in uno che codifica un gene elicitor da P. Infestans. Nessuna morte cellulare in espansione è osservata nel sito inoculato con il controllo negativo PGR 1 0 6 empty Well.È importante ricordare, quando si tenta questa procedura, di coltivare materiale vegetale di buona qualità. Questa tecnica ha aperto la strada allo studio degli effetti omici nella patata e in altre specie vegetali, per ricercatori nel campo della patologia molecolare delle piante e dell'agronomia. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi funzionale ad alto rendimento efficiente e robusta del gene can nelle piante.

agroinfiltration-pvx-agroinfection-potato-nicotiana

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

Descrizione di un virus-indotto silenziamento genico (VIGS) metodo per knock-down di espressione genica...

Virale silenziamento genico (VIGS) in Nicotiana benthamiana E Pomodoro

Un modo semplice, efficace e robusto per sincronizzare l'erogazione di più componenti virali di cellule vegetali...

Semplice e robusta In vivo E In vitro</emApproccio> per lo Studio Assemblea Virus

Fonte: Shi, J., et al. Screening e identificazione dei soppressori silenzianti dell'RNA da effettori secreti di patogeni vegetali. J. Vis. Esp. (2020)Questo video mostra un saggio di coinfiltrazione per identificare proteine effettrici patogene che sopprimono il silenziamento dell'RNA in Nicotiana benthamiana 16c. Un reporter fluorescente e un gene candidato effettore vengono introdotti nelle foglie delle piante tramite Agrobacterium. Normalmente, il silenziamento dell'RNA degrada i...

Test di coinfiltrazione per lo screening degli effettori patogeni che sopprimono il silenziamento dell'RNA vegetale

Piante offrono un sistema innovativo per la produzione di proteine ​​farmaceutiche su scala commerciale che è più scalabile, economica e sicura rispetto paradigmi attuale espressione. In questo studio, riportiamo un approccio semplice e conveniente, ma scalabile per introdurre target-gene...

Agroinfiltration efficiente di impianti di alto livello espressione transiente di proteine ​​ricombinanti

Produzione di proteine ​​transitoria nelle piante di Nicotiana sulla base di infiltrazione sottovuoto con Agrobacteria trasportando i vettori di lancio (Tobacco Mosaic Virus-based) è un approccio rapido ed economico per la produzione di antigeni e proteine ​​terapeutiche. Abbiamo semplificato la procedura e migliorato l'accumulo di destinazione ottimizzando le condizioni di coltivazione batteri, selezionando specie ospite e co-introduzione di silenziamento dell'RNA soppressori.

Ottimizzazione e utilizzo di<em&gt; Agrobacterium</em&gt;-Mediata transitoria produzione di proteine ​​in<em&gt; Nicotiana</em

In questo studio è stata confrontata l'espressione di una proteina ricombinante umana bersaglio in diverse piattaforme di produzione. Ci siamo concentrati sulle colture tradizionali basate su fermentatori e sugli impianti, descrivendo il set-up di ciascun sistema ed evidenziando, sulla base dei risultati riportati, i limiti e i vantaggi intrinseci per ogni piattaforma.

Un&#39;analisi comparativa di espressione della proteina ricombinante in diversi biofabbriche: batteri, cellule di insetto e impianti

Presentiamo un protocollo dettagliato per il sistema di silenziamento dei microRNA (VbMS) basato sul virus della patata X (PVX) per caratterizzare funzionalmente i microRNA endogeni (miRNA) nella patata. Le molecole mimiche bersaglio (TM) di miRNA di interesse sono integrate nel vettore PVX ed espresse transitoriamente in patata per silenziare il miRNA bersaglio o la famiglia di miRNA.

Virus della patata Silenziamento del microRNA basato sull'X (VbMS) nella patata.

Viene presentato un protocollo di iniezione (agroiniezione) a base di Agrobacterium per l'inoculazione del virus del mosaico a coda di volpe e dei virus del mosaico della canna da zucchero in piantine di mais. L'inoculazione in questo modo porta a infezioni virali, silenziamento genico indotto da virus di geni marcatori e sovraespressione virale di GFP.

Agroinoculazione diretta di piantine di mais per iniezione con cloni infettivi del virus del mosaico della coda di volpe ricombinante e virus del mosaico della canna da zucchero

Questo protocollo presenta un riepilogo dettagliato delle strategie per inoculare le radici delle piante con microbi trasmessi dal suolo. Esemplificato per i funghi Verticillium longisporum e Verticillium dahliae, vengono descritti tre diversi sistemi di infezione delle radici. Vengono evidenziate le potenziali applicazioni e le possibili analisi a valle e vengono discussi vantaggi o svantaggi per ciascun sistema.

Strategie di inoculazione per infettare le radici delle piante con microrganismi trasmessi dal suolo

Qui presentiamo il primo protocollo per l'infiltrazione sottovuoto localizzata per studi in vivo della trasformazione genetica di piante di grandi dimensioni. Utilizzando questa metodologia, abbiamo ottenuto per la prima volta la trasformazione transitoria del cacao mediata da Agrobacterium in planta .

Agroinfiltrazione forzata sottovuoto per la trasformazione in planta di piante recalcitranti: il cacao come caso di studio

Il protocollo descrive l'infezione delle radici di Solanum tuberosum con nematodi parassiti delle piante in condizioni di serra in vivo e radici transgeniche in vitro di patate per l'analisi istochimica della struttura radicale attraverso la microscopia ottica.

Infezione in vivo e in vitro delle radici della patata con nematodi parassiti delle piante per la valutazione dei cambiamenti strutturali indotti

Impara l'agroinfiltrazione e l'agroinfezione PVX per l'espressione transitoria di geni in piante. Questi metodi funzionali permettono di studiare le interazioni pianta-patogeno e i meccanismi di resistenza.

Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

Esplora altri video