Agroinfiltrazione e Agroinfezione PVX in Benthamiana di Patate e Nicotiana

L'obiettivo generale del seguente esperimento è verificare se gli effettori dei patogeni sono riconosciuti dalle proteine resistenti nelle piante. Ciò si ottiene infettando prima le foglie delle piante con una coltura liquida di agrobatterio o attraverso l'infezione da PVX agro, che esprimerà transitoriamente gli effettori nel tessuto vegetale. Quindi le piante vengono lasciate incubare e le piante vengono valutate per la morte cellulare.

Si ottengono risultati che mostrano risposte di morte cellulare al riconoscimento di disertori espressi transitoriamente dalle proteine di resistenza nelle piante. Il vantaggio principale di queste tecniche rispetto ai metodi esistenti come gli studi genetici con marcatori molecolari è che si tratta di saggi funzionali. Non solo dimostrano che il gene di resistenza è presente nella pianta, ma anche che funziona e che le risposte di difesa sono attivamente indotte.

Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nella patologia molecolare delle piante, come ad esempio scoprire rapidamente la resistenza ai bot e i geni AFI dei criminali, la cui disponibilità di entrambe le sequenze genomiche La dimostrazione della procedura sarà eseguita da du, uno studente di dottorato di un laboratorio per generare piante di patate. Conservare le piantine in vitro in barattoli di plastica sterili contenenti più shige, scoog o terreno MS in camere climatiche a 18 gradi Celsius con un regime di 16 ore, otto ore giorno notte per due settimane. Quando le piante crescono, le radici bianche le trasferiscono in vasi di terra sterilizzata.

Nei compartimenti regolamentati delle serre per le piante utilizzate in questi esperimenti vengono utilizzati semi di NCOA hamana coltivati a quattro o cinque settimane e trapianti di patate di quattro o cinque settimane generati in vitro. Per preparare la coltura dell'agrobatterio, iniziare riempiendo provette da 50 millilitri con 10 millilitri di terreno YEB, integrati con un microlitro di acetofenone, 100 microlitri di MES e gli antibiotici appropriati. Successivamente, pipettare 20 microlitri di glicerolo stock dei ceppi desiderati di agrobatterio contenenti il gene di interesse nello YEB.

Incubare le colture a 28 gradi Celsius e 200 RPM per uno o due giorni fino a un OD 600 di circa 1,0. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 3000 GS per 10 minuti. Quindi versare il supernat e risospendere il pellet.

In MMA appena fatto medio fino a un OD 600 di 0,3. Agitare delicatamente le cellule per sospenderle per l'infiltrazione di due ceppi batterici. Mescola la cultura con un rapporto uno a uno.

Lasciare riposare le colture a temperatura ambiente da una a sei ore prima di infiltrarsi nelle piante. Nel frattempo, etichettare le piante da infiltrare con il ceppo e la data dell'esperimento per effettuare le infiltrazioni indossando una protezione per gli occhi. Utilizzare una siringa da un millilitro senza ago per iniettare con attenzione e lentamente sospensioni di agrobatteri nei pannelli fogliari.

Iniettare almeno tre piante e tre foglie per pianta per fungere da triplicati per evitare la contaminazione incrociata. Cambiare o sterilizzare i guanti tra un'infiltrazione e l'altra ed evitare di annaffiare le piante fino al giorno dopo. Inoculazione circa tre giorni dopo l'infiltrazione, valutare le piante per la morte cellulare su una scala da zero a 100% con zero che rappresenta nessun sintomo.

100%indica la morte cellulare per confluenza e valori intermedi che vanno dalla sclerosi all'aumento dei livelli di morte cellulare. Effettuare l'infezione da PVX agro in piante coltivate con semi di due o tre settimane e da seme di hamana e trapianti di patate di due o tre settimane coltivate in vitro a tre millilitri di YEB integrati con antibiotici. Aggiungere 20 microlitri di glicerolo stock di agrobacterium incubare a 28 gradi Celsius e 200 RPM a un OD 600 di circa 1,0.

Distribuire circa 300 microlitri di ciascun ceppo di agrobatterio su piastre di agar LB con antibiotici e incubare a 28 gradi Celsius per uno o due giorni. Usa una spatola per raccogliere l'agrobatterio. Quindi inoculare una foglia con una grande quantità di batteri.

Immergi uno stuzzicadenti nella coltura e usalo per perforare la pianta. Foglia Inoculare ogni foglia in più posizioni attraverso foglie per pianta e tre piante per ceppo. Due settimane dopo l'inoculazione, segna macroscopicamente ogni punto registrando qualitativamente ogni punto come sì o no.

Quindi calcola la percentuale di siti che rispondono e confrontala con i controlli mostrati. Ecco i risultati rappresentativi dell'agroinfiltrazione nell'hamana finale e in due specie di patate, Solenium JI 3 49 dash tre e CV Desiree circa tre giorni dopo l'inoculazione. C'è morte cellulare di confluenza nel pannello fogliare co infiltrato con la miscela di agrobatterio ceppo AGL uno PVRG contenente P bin più R tre A e PK sette WG due A VR tre A mentre non si verifica alcuna risposta di morte con il controllo negativo PI più R tre A o PK sette WG due A VR tre A in questa figura PVX agroinfezione di n e due specie di patate S uno Kae 3 54 dash one e S micro DOUM 360 dash one vengono mostrati circa due settimane dopo l'inoculazione.

C'è un'espansione della morte cellulare nei siti inoculati con il controllo positivo PGR 1 0 6 CRN due. Ciò codifica per un gene che induce la morte cellulare generale da Phytophthora Infest e PGR 1 0 6 in uno che codifica per un gene illecito da P Infest. Non si osserva alcuna morte cellulare in espansione nel sito inoculato con il controllo negativo PGR 1 0 6 pozzetto vuoto.

Tentare questa procedura è importante per ricordarsi di coltivare materiale vegetale di buona qualità. Questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione dell'effetto omico nella patata e in altre specie vegetali per i ricercatori in patologia molecolare vegetale e miglioramento genetico delle piante. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi funzionale efficiente e robusta ad alto rendimento del gene della lattina nelle piante.