Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare le caratteristiche fisiche di base dei campioni cellulari, tra cui massa e volume, con un microscopio ottico standard e l'elaborazione delle immagini. Ciò si ottiene montando prima campioni cellulari cresciuti su vetrini di vetro su vetrini da microscopio. Successivamente, attraverso la messa a fuoco, il campo chiaro e le immagini di contrasto interferenziale differenziale, si ottengono immagini.

Quindi ogni stack Z di immagini viene inserito in programmi di elaborazione delle immagini MATLAB separati che estraggono i dati fisici. In definitiva, le proprietà fisiche di base dei campioni cellulari sono ottenute utilizzando misure di intensità di messa a fuoco, sotto contrasto in campo chiaro e microscopia a contrasto di interferenza differenziale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia a fluorescenza, è che i campioni cellulari non devono essere fissati, permeati o colorati.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia cellulare, come ad esempio come è organizzata la densità subcellulare durante il ciclo cellulare o tra diverse popolazioni cellulari che contribuiscono a uno stato patologico Utilizzando un microscopio con capacità sia DIC che in campo chiaro e specifiche aggiuntive secondo il protocollo di testo, iniziare aprendo il software del libro di diapositive e creando un nuovo vetrino per la raccolta di immagini. Quindi, apri la finestra di messa a fuoco e nella sezione del set di filtri seleziona DIC Nella scheda dell'oscilloscopio sotto la sezione del condensatore, regola la barra di scorrimento dell'apertura nella posizione più a destra. Ciò fornisce un'illuminazione ad alta apertura numerica e migliora il sezionamento ottico del campione.

Dopo aver acquisito una pila DIC del campione, aprire la finestra dello stato attivo e selezionare Apri. Nella sezione del set di filtri, regolare la barra di scorrimento dell'apertura nella posizione più a sinistra completamente chiusa per fornire un'illuminazione NA bassa. Dopo la regolazione dell'intensità del segnale, aprire la finestra di acquisizione dell'immagine.

Le impostazioni di acquisizione 3D dell'acquisizione dello stack DICZ verranno visualizzate nella sezione del set di filtri della finestra di acquisizione dell'immagine. Seleziona la casella aperta e specifica il tempo di esposizione. Nella sezione delle informazioni sull'immagine, assegnare un nome all'immagine e selezionare Avvia per avviare l'acquisizione dell'immagine Zack.

Quindi esporta gli stack Z secondo il protocollo di testo per eseguire le misurazioni del volume una volta nel programma H-T-D-I-C MATLAB intitolato JoVE HT DCO V one M Nella sezione zero, aggiorna la variabile della directory delle dipendenze copiando e incollando la directory contenente l'hilbert. Trasforma i file DM e sobel edge Rileva M da Explorer. Tra le virgolette singole che seguono la directory delle dipendenze è uguale a execute section zero del programma joco HT DCO V one M.

Nella prima sezione, aggiornare la directory delle immagini copiando e incollando la directory contenente le immagini a fuoco passante in forma TIF a punti. Tra le virgolette singole, esegui questa sezione solo una volta per allineare e ruotare le immagini. Per la trasformazione di Hilbert, eseguire la seconda sezione del codice: Apparirà una finestra di dialogo intitolata Definisci parametri HT DIC.

Quindi inserire il numero del piano focale in cui l'immagine DIC del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale, l'angolo di rotazione dell'immagine DIC necessaria per eseguire la trasformata di Hilbert e, infine, la dimensione della regione di interesse. Quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine del piano focale DIC specificato dal numero del piano focale con una casella blu.

Posizionare la casella sulla funzione di interesse, ad esempio una cella. Una volta che la casella è stata posizionata sulla regione desiderata, fare doppio clic all'interno del B.Il contrasto dell'immagine dovrebbe essere tale che le caratteristiche scure appaiano a sinistra mentre le caratteristiche luminose appaiano a destra. Trascinare la casella blu sulla regione di interesse e rimodellare se necessario.

Successivamente, nella sezione tre, per generare una maschera rettangolare, una riga di commento 1 6 7 e una riga di commento 1 7 0 eseguire la sezione tre del programma facendo clic sull'immagine e trascinando il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Quindi fare doppio clic sulla casella per accettarlo. Per generare una maschera disegnata a mano, commentare la riga 1 6 7 e commentare la riga 1 7 0 prima di eseguire la sezione tre Facendo clic e disegnando la maschera desiderata con il mouse, fare doppio clic sulla maschera per accettarla dopo aver eseguito la sezione quattro, per costruire pile di immagini trasformate di Hilbert secondo il protocollo di testo esegue la sezione cinque.

Ottimizzare la segmentazione delle immagini in sezione trasversale xz della regione di interesse. Viene visualizzata la figura 500 prodotta dal programma che mostra tre diversi tipi di contrasto. Il successo dell'algoritmo per trovare i bordi della cella dipende da una combinazione della maschera utilizzata e del valore della soglia alla riga 2, 2, 9 del programma inizia con un valore di 0,5 e regola il valore della soglia ed esegui nuovamente questa sezione del programma fino a quando non viene raggiunto il contorno corretto in una delle colonne.

Se il contorno era migliore nella prima colonna, nella segmentazione DIC, utilizzare la sezione sei per determinare il volume. Se la colonna due ha dato risultati ottimali, eseguire la sezione sette per determinare il volume della cella da Hilbert, trasformare le immagini DIC Se la colonna tre ha dato i risultati ottimali, utilizzare le immagini DIC in trasformata di Hilbert filtrate dal forer durante l'esecuzione della sezione otto per determinare il volume per l'esecuzione delle misurazioni di massa nel programma NIQ PM MATLAB e intitolato JO VCO NI qpm V1 M Nella sezione zero. Aggiorna la posizione delle dipendenze delle tre directory, BRIGHTFIELD e DIC directory dopo aver eseguito la prima sezione, esegui la seconda sezione nella finestra di dialogo intitolata definisci parametri N-I-Q-P-M, inserisci il numero del piano focale in cui l'immagine del campo chiaro del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale e la dimensione della regione di interesse.

Quindi fare clic su OK. Un'immagine del piano focale del campo chiaro specificato dal numero del piano focale apparirà con una casella blu. Dopo aver regolato la messa a fuoco, se necessario, rieseguendo la seconda sezione, trascina la casella attorno all'immagine e seleziona i nodi della casella e trascinala per ridimensionarla prima di fare doppio clic all'interno della casella per accettarla.

Una volta che una pila di immagini in campo chiaro è stata costruita eseguendo la sezione tre, eseguire la sezione quattro per generare la mappa di fase, le immagini pseudo DIC e i confronti con le immagini in campo chiaro e la vera immagine DIC quando le immagini pseudo DIC e true DIC sono il più simili possibile, eseguire la sezione cinque A o cinque B che consente all'utente di delineare la cella per generare la mappa della densità di massa, La massa totale e l'istogramma della densità cellulare sono corretti. L'illuminazione del campione durante l'acquisizione dell'immagine attraverso la messa a fuoco è fondamentale per il successo dell'implementazione dell'algoritmo N-I-Q-P-M e H-T-D-I-C. Questa figura illustra l'illuminazione NA bassa e alta sia in DIC che in campo chiaro per una sfera di polistirene e la linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano SW six 20.

Questi pannelli dimostrano un imaging ottimale per N-I-Q-P-M e un imaging ottimale per HT DIC. Queste immagini dimostrano la dipendenza dai parametri dell'algoritmo NIQ PM, evidenziando sia le implementazioni riuscite che quelle non riuscite. Qui esploriamo il profilo di fase di una sfera di polistirene di 4,8 micrometri di diametro.

Il profilo atteso è noto teoricamente e può quindi essere confrontato direttamente con la ricostruzione NIQ PM. Questi pannelli presentano la migliore ricostruzione ottenibile per gli effetti di diffrazione della sfera, sia ai bordi della sfera che all'interno, impedendo una ricostruzione stabile in tutti i punti della sfera. La regione centrale della sfera può essere catturata con N-I-Q-P-M con un errore percentuale dall'uno al 5%, come si vede nei campioni cellulari del pannello L le cui proprietà di fase non sono note.

A priori può essere ricostruito utilizzando NIQ PMM in combinazione con una procedura per confrontare un'immagine pseudo DIC con un'immagine DIC reale. N-I-Q-P-M ha un parametro libero. Il piano nella pila di immagini del campo destro in cui è centrato il calcolo.

Questo piano focale centrale deve essere regolato fino a quando le immagini pseudo DIC e true DIC appaiono il più simili possibile. Qui vengono presentate un'immagine pseudo DIC sfocata, un'immagine pseudo DIC ottimale e la corrispondente immagine DIC della cella ripresa con un'illuminazione NA di 0,9. È interessante notare che la migliore mappa di fase e la corrispondente immagine pseudo DIC non corrispondono necessariamente a un'immagine in campo chiaro a fuoco come mostrato in questi pannelli.

Infine, qui sono mostrati i passaggi coinvolti nell'algoritmo di elaborazione delle immagini H-T-D-I-C dal DIC attraverso immagini a fuoco con illuminazione NA uguale a 0,9, la trasformata di Hilbert viene eseguita per rimuovere il rilievo di base delle immagini DIC. Questo viene fornito con alcune sfocature lungo l'asse ottico che possono essere rimosse dal filtro forer passa-alto. Queste immagini finali sono facilmente segmentate per determinare l'area in ciascun piano della sezione trasversale del campione per dedurre il volume cellulare totale.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare l'illuminazione corretta per l'imaging a contrasto differenziale in campo chiaro o dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande utilizzando la colocalizzazione della forza di fondo con le mappe di densità del campione.