Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare caratteristiche fisiche fondamentali di campioni cellulari, inclusi massa e volume, utilizzando un microscopio ottico standard ed elaborazione delle immagini. Questo viene ottenuto innanzitutto montando campioni cellulari coltivati su coprioggetti di vetro su portaslide per microscopio. Successivamente, vengono acquisite immagini a campo chiaro e in contrasto di interferenza differenziale attraverso messa a fuoco.

Successivamente, ogni stack Z di immagini viene inserito in programmi separati di elaborazione delle immagini in MATLAB che estraggono i dati fisici. In definitiva, le proprietà fisiche fondamentali dei campioni cellulari vengono ottenute mediante misurazioni dell'intensità a fuoco attraverso contrasto in campo chiaro e microscopia a contrasto di interferenza differenziale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza, è che i campioni cellulari non devono essere fissati, permeabilizzati o colorati.

Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come ad esempio come è organizzata la densità subcellulare durante il ciclo cellulare o tra diverse popolazioni cellulari che contribuiscono a uno stato patologico. Utilizzando un microscopio dotato sia di contrasto di interferenza differenziale (DIC) che di illuminazione in campo chiaro, e con ulteriori specifiche indicate nel protocollo, iniziare aprendo il software slide book e creando una nuova diapositiva per la raccolta delle immagini. Successivamente, aprire la finestra di messa a fuoco e, nella sezione set di filtri, selezionare DIC. Nella scheda microscopio, nella sezione condensatore, regolare la barra scorrevole dell'apertura nella posizione più a destra. Questo fornisce un'illuminazione ad alta apertura numerica e migliora la sezione ottica del campione.

Dopo aver acquisito uno stack DIC del campione, aprire la finestra del fuoco e selezionare "apri". Nella sezione set di filtri, regolare la barra di apertura nella posizione più a sinistra, completamente chiusa, per fornire un'illuminazione a bassa apertura numerica (NA). Dopo aver regolato l'intensità del segnale, aprire la finestra di acquisizione dell'immagine.

Le impostazioni di acquisizione 3D dello stack DICZ verranno visualizzate nella sezione del set di filtri della finestra di acquisizione dell'immagine. Selezionare la casella di controllo e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione informazioni immagine, assegnare un nome all'immagine e selezionare avvio per iniziare l'acquisizione dell'immagine Zack.

Quindi esportare gli stack Z seguendo il protocollo testuale per effettuare le misurazioni volumetriche nel programma MATLAB H-T-D-I-C intitolato JoVE HT DCO V one M. Nella sezione zero, aggiornare la variabile della directory delle dipendenze copiando e incollando la directory contenente i file hilbert. Transform DM e sobel edge Detect M da Explorer. Tra le virgolette singole successive a "dependencies directory equals", eseguire la sezione zero del programma joco HT DCO V one M.

Nella sezione uno, aggiornare la directory delle immagini copiando e incollando la directory contenente le immagini a fuoco attraverso in formato TIF. Tra gli apici singoli, eseguire questa sezione una sola volta per allineare e ruotare le immagini. Per la trasformata di Hilbert, eseguire la sezione due del codice: apparirà una finestra di dialogo intitolata Definisci parametri HT DIC.

Quindi inserire il numero del piano focale in cui l'immagine DIC del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale, l'angolo di rotazione dell'immagine DIC necessario per eseguire la trasformata di Hilbert e, infine, la dimensione della regione di interesse. Quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine del piano focale DIC specificato dal numero del piano focale, con un riquadro blu.

Posizionare la casella sulla caratteristica di interesse, ad esempio una cellula. Una volta posizionata la casella sulla regione desiderata, fare doppio clic all'interno della B. Il contrasto dell'immagine deve essere tale che le caratteristiche scure appaiano a sinistra mentre quelle chiare a destra. Trascinare la casella blu sulla regione di interesse e ridimensionarla secondo necessità.

Successivamente, nella sezione tre, per generare una maschera rettangolare, decommentare la riga 1 6 7 e commentare la riga 1 7 0; eseguire la sezione tre del programma cliccando sull'immagine e trascinando il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Quindi fare doppio clic sulla casella per accettarla. Per generare una maschera disegnata a mano, commentare la riga 1 6 7 e decommentare la riga 1 7 0 prima di eseguire la sezione tre. Cliccando e disegnando la maschera desiderata con il mouse, fare doppio clic sulla maschera per accettarla. Dopo aver eseguito la sezione quattro, per costruire pile di immagini trasformate secondo Hilbert come descritto nel protocollo, eseguire la sezione cinque.

Per ottimizzare la segmentazione dell'immagine nelle sezioni trasversali xz della regione di interesse. La figura 500 generata dal programma mostra tre tipi diversi di contrasto. Il successo dell'algoritmo nel rilevare i bordi della cellula dipende dalla combinazione della maschera utilizzata e dal valore della soglia alla riga 2, 2, 9 del programma: iniziare con un valore di 0,5 e modificare il valore della soglia, quindi rieseguire questa sezione del programma finché non si ottiene un contorno adeguato in una delle colonne.

Se il contorno era migliore nella colonna uno, nella segmentazione DIC, utilizzare la sezione sei per determinare il volume. Se la colonna due ha fornito i risultati ottimali, eseguire la sezione sette per determinare il volume cellulare a partire dall'immagine DIC trasformata con Hilbert. Se la colonna tre ha fornito i risultati ottimali, utilizzare l'immagine DIC filtrata con trasformata di Hilbert eseguendo la sezione otto per determinare il volume ai fini delle misurazioni di massa nel programma MATLAB NIQ PM intitolato JO VCO NI qpm V1 M nella sezione zero. Aggiornare la posizione delle tre directory dipendenze, BRIGHTFIELD e directory DIC; dopo aver eseguito la sezione uno, eseguire la sezione due; nella finestra di dialogo intitolata definire i parametri N-I-Q-P-M inserire il numero del piano focale in cui l'immagine in campo chiaro del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale e la dimensione della regione di interesse.

Quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine del piano focale in campo chiaro specificato dal numero del piano focale, con un riquadro blu. Dopo aver regolato il fuoco se necessario, ripetendo la sezione due, trascinare il riquadro sull'immagine e selezionare i nodi del riquadro trascinandoli per ridimensionarlo, quindi fare doppio clic all'interno del riquadro per confermarlo.

Dopo aver costruito uno stack di immagini in campo chiaro eseguendo la sezione tre, eseguire la sezione quattro per generare la mappa di fase, le immagini pseudo DIC e i confronti con le immagini in campo chiaro e con l'immagine DIC reale; quando le immagini pseudo DIC e quelle DIC reali sono il più simili possibile, eseguire la sezione cinque A o la sezione cinque B, che consentono all'utente di delineare la cellula per generare la mappa di densità di massa, la massa totale e l'istogramma corretto della densità cellulare. L'illuminazione del campione durante l'acquisizione delle immagini in messa a fuoco è fondamentale per l'implementazione corretta degli algoritmi N-I-Q-P-M e H-T-D-I-C. Questa figura illustra un'illuminazione a bassa e alta NA in condizioni di contrasto DIC e in campo chiaro, rispettivamente, per una sfera di polistirene e per la linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano SW six 20.

Questi pannelli mostrano l'imaging ottimale per N-I-Q-P-M e questi mostrano l'imaging ottimale per HT DIC. Queste immagini illustrano la dipendenza dai parametri dell'algoritmo NIQ PM, evidenziando implementazioni sia riuscite che non riuscite. Qui esploriamo il profilo di fase di una sfera di polistirene con diametro di 4,8 micrometri.

Il profilo previsto è noto teoricamente e può quindi essere confrontato direttamente con la ricostruzione NIQ PM. Questi pannelli mostrano la migliore ricostruzione ottenibile per gli effetti di diffrazione della sfera; tuttavia, ai bordi della sfera e all'interno di essa, tali effetti impediscono una ricostruzione stabile in tutti i punti della sfera. La regione centrale della sfera può essere riprodotta con N-I-Q-P-M con un errore percentuale compreso tra l'1% e il 5%, come mostrato nel pannello L, su campioni cellulari le cui proprietà di fase non sono note.

Un'immagine a priori può essere ricostruita utilizzando il PMM NIQ in combinazione con una procedura per confrontare un'immagine DIC pseudo con un'immagine DIC reale. N-I-Q-P-M ha un parametro libero: il piano all'interno della serie di immagini del campo destro in cui viene centrato il calcolo.

Questo piano focale centrale deve essere regolato finché le immagini in pseudo DIC e in DIC reale non risultano il più simili possibile. Vengono qui presentate un'immagine in pseudo DIC fuori fuoco, un'immagine in pseudo DIC ottimale e l'immagine in DIC corrispondente della cellula, acquisita con un NA di illuminazione di 0,9. In modo interessante, la mappa di fase migliore e l'immagine corrispondente in pseudo DIC non corrispondono necessariamente a un'immagine a campo chiaro a fuoco, come mostrato in questi pannelli.

Infine, qui vengono mostrati i passaggi coinvolti nell'algoritmo di elaborazione delle immagini H-T-D-I-C a partire dalle immagini DIC in funzione del fuoco ottenute con illuminazione a NA uguale a 0,9; viene eseguita la trasformata di Hilbert per rimuovere il rilievo di base delle immagini DIC. Questo comporta un certo sfocamento lungo l'asse ottico, che può essere eliminato mediante un filtro passa-alto. Queste immagini finali possono essere facilmente segmentate per determinare l'area in ciascun piano trasversale del campione, al fine di ricavare il volume cellulare totale.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare l'illuminazione corretta per l'immagine in campo chiaro o in contrasto di fase differenziale dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive mediante la codistribuzione della forza del pavimento con le mappe di densità del campione.