Name: Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-04-07T14:45:00.000+00:00
Duration: 14 min 9 s
Description: Impara a quantificare massa, volume e densità cellulare con microscopia ottica standard e analisi di immagini MATLAB. Questa tecnica non invasiva evita fissazione e colorazione, permettendo lo studio di cellule vive.

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Questo lavoro è stato sostenuto da sovvenzioni dal National Institutes of Health (U54CA143906 a KGP, OJTM e R01HL101972 a OJTM) e una Fondazione per la Ricerca Medica dell&#39;Oregon anticipata Clinical Investigator Award (KGP). OJTM è un investigatore Fondata American Heart Association (13EIA12630000). Ringraziamo il Dott. Eric Anderson Cancer Institute Cavaliere per la preparazione di campioni di cellule utilizzate in questo lavoro.

1. Microscopio Specifiche Per eseguire l&#39;imaging nel modo corretto, il microscopio dovrebbe avere le seguenti specifiche: <ol><li> Possedere entrambi contrasto di interferenza differenziale (DIC) e campo chiaro (BF) contrasto. </li><li> Avere movimento asse z controllato da computer. </li><li> Avere un diaframma regolabile per variare l&#39;apertura numerica della lente condensatore. Un&#39;apertura con una regola graduata o lettura elettronica è tenuto a conoscere il valore della apertura numerica. L&#39;apertura numerica deve variare da 0,1 per NIQPM fino a 0.9 (o superiore) per HTDIC. </li><li> Il microscopio dovrebbe avere un filtro di colore a banda stretta per essere utilizzato per l&#39;imaging campo chiaro. Questo filtro è tenuta a fissare l&#39;incremento di rifrazione, una fabbricazione lunghezza d&#39;onda dipendente utilizzato per convertire fase della densità di massa per NIQP. </li></ol> 2. Interferenza differenziale contrasto (DIC) Acquisizione Z-stack <ol><li> Aprire il software SlideBook unnd creare una nuova diapositiva per raccolta di immagini. </li><li> Quindi, aprire la finestra di Focus. Nella sezione Filter Set selezionare DIC. Nella scheda Ambito, nella sezione condensatore, regolare la barra di scorrimento Aperture per la più giusta posizione (aperto tutto il senso). Questo fornisce alta numerico illuminazione dell&#39;apertura e migliora sezionamento ottico del campione. </li><li> Focus sul campione utilizzando un obiettivo DIC. Regolare l&#39;intensità della lampada alogena finché il campione è facilmente visibile. Per assicurare che la fotocamera non viene saturato, selezionare la scheda della fotocamera nella finestra di messa a fuoco e verificare che l&#39;istogramma di intensità dei pixel è all&#39;interno del range dinamico della telecamera. </li><li> Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Nella sezione Tipo di ripresa, selezionare la casella 3D. Nella sezione Capture 3D, selezionare l&#39;intervallo intorno al centro e torna alla posizione attuale </strong&gt; caselle e specificare l&#39;intervallo direzione Z, numero di aerei, e passo. La gamma Z-direzione dovrebbe includere l&#39;intero campione. </li><li> Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella DIC e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell&#39;immagine, il nome dell&#39;immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare il imaging. </li></ol> 3. Campo chiaro (BF) Acquisizione Z-stack <ol><li> Una volta che il microscopio ha finito di raccogliere il DIC Z-stack del campione, aprire la finestra Focus e selezionare Apri nella sezione Filter Set. Regolare la barra di scorrimento Aperture per la posizione più a sinistra (chiuso tutto il senso) per fornire l&#39;illuminazione bassa NA. </li><li> Cambiare il filtro di luce-path microscopio a verde. Regolare l&#39;intensità della lampada alogena finché il campione è visibile. Assicurarsi che non vi è saturazione della fotocamera selezionando la <strong&gt; scheda telecamera nella finestra di messa a fuoco e verificando che l&#39;istogramma di intensità dei pixel è entro l&#39;intervallo specificato. </li><li> Aprire la finestra Acquisizione Immagine. Verranno visualizzate le impostazioni di acquisizione 3D DIC acquisizione Z-stack. </li><li> Nella sezione Filtro Set della finestra Acquisizione Immagine, selezionare la casella OPEN e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione Informazioni dell&#39;immagine, il nome dell&#39;immagine (opzionale), e selezionare Start per avviare Z-stack acquisizione delle immagini. </li></ol> 4. Esportazione di Z-stack Immagini <ol><li> Aprire una cattura Z-stack. Modificare la visualizzazione al 100%. Regolare l&#39;istogramma dei valori di pixel da visualizzare tra 0 e il valore massimo del pixel della telecamera (4.095 per telecamere 12 bit, 65.535 per 16 bit.). </li><li> Selezionare Visualizza&gt; Esporta&gt; TIFF Series. Ciò esportare la Z-stack come una serie di immagini TIFF(Uno per ogni piano Z). Salvare la serie TIFF in una cartella separata con un nome che ha un carattere di sottolineatura alla fine (ad esempio &quot;DIC Stack 1_&quot;). Ripetere questa operazione con ogni DIC o BF Z-stack. </li></ol> 5. Misure Volume <ol><li> Aprire il programma HTDIC MATLAB intitolato &quot;JoVE_HTDIC_v1.m&quot;. </li><li> Sotto la sezione 0 del programma HTDIC, aggiornare la variabile directory dipendenze. Copia e incolla il directory contenente il hilbert_transform_dic.m e file sobel_edge_detect.m da Explorer (PC) tra le virgolette singole seguente &quot;dependencies_directory =&quot;. ExecuteSection 0 del programma JoVE_HTDIC_v1.m. </li><li> Nella sezione 1, aggiornare l&#39;&quot;images_directory&quot;. Ancora una volta, copiare e incollare la cartella contenente le immagini in-focus in. Forma tif tra le virgolette singole. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA. </li><li> Allineamento e rotazione delle immagini per Hilbert trasformano Run sezione 2 del codice. Apparirà una finestra di dialogo intitolata &quot;Definisci HTDIC Parametri&quot;. Cinque numbers sono richiesti dall&#39;utente: il numero di piano focale dove l&#39;immagine DIC del campione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell&#39;immagine), la risoluzione assiale (questo è il 0,1 per l&#39;acquisizione di immagini a 0.1 micron fasi assiali), l&#39;angolo di rotazione dell&#39;immagine DIC necessario per eseguire la trasformata di Hilbert, valori tipici sono 45 e -135. Infine, inserire la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di una scatola che appaiono successivamente - valore tipico è 400. Fare clic su OK. </li><li> Un&#39;immagine del piano focale DIC specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu. Posizionare la scatola sopra la caratteristica di interesse, ad esempio una cella. La scatola non deve essere quadrata. Una volta che il box è stato posizionato sopra la regione desiderata, fare doppio clic all&#39;interno della casella. </li><li> Un&#39;altra figura appare ora: questa figura contiene un&#39;immagine ritagliata e ruotata della regione di interesse selezionato nel passaggio precedente. Il contrasto dell&#39;immagine deve essere talecaratteristiche che scure sulla sinistra, mentre le caratteristiche luminose appaiono sulla destra. Trascinare la casella blu sopra la regione di interesse, rimodellare, se necessario. </li><li> Sezione 3 genera una maschera per il cubo z-stack. Ci sono due tipi di maschere disponibili: una maschera rettangolare per creare un rettangolo intorno alla cella e uno strumento a mano libera per delineare la cella di interesse a mano. </li><li> Per generare una maschera rettangolare, decommentare la linea 167 e commentare la linea 170 (commentare una linea fuori con un &quot;%&quot; all&#39;inizio della riga). Eseguire sezione 3 del programma. Fare clic nell&#39;immagine e trascinare il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Fare doppio clic sulla casella di accettarla. </li><li> Per generare una maschera disegnata a mano, commentare linea 167 e decommentare la linea 170 ed eseguire Sezione 3. Fare clic e disegnare la maschera desiderato con il mouse. Fare doppio clic sulla maschera di accettarla. </li><li> Sezione Eseguire 4to costruire la trasformata di Hilbert DIC pila di immagini e la corrispondente DIC pila immagine dell&#39;area di interesse.La maschera costruito nella Sezione 3 verrà applicato alla trasformata di Hilbert pila DIC e lo stack regolare DIC quando &quot;maskON&quot; è impostato a 1 alla riga 179. Impostazione &quot;maskON&quot; per 0 costruirà stack di immagini senza applicare la maschera. </li><li> Eseguire sezione 5 per ottimizzare la segmentazione dell&#39;immagine dei xz trasversali immagini sezionali della regione di interesse. Figura 500, prodotta dal programma, appare a visualizzare tre diversi tipi di contrasto. Il successo dell&#39;algoritmo per trovare i bordi della cella fa affidamento su una combinazione della maschera utilizzata e il valore di &quot;soglia&quot; alla riga 229 del programma. Iniziare con un valore di 0,5. Regolare il valore di soglia e rieseguire questa sezione del programma fino alla corretta delineazione è raggiunto in una delle colonne. </li><li> Se la delineazione era meglio nella colonna 1, utilizzare la sezione 6 per determinare il volume utilizzando DIC immagine segmentazione. Se colonna 2 ha dato risultati ottimali, sezione 7 per determinare il volume delle cellule da Hilbert-trasformata immagini DIC correre. Se colonna 3 gavE i risultati ottimali, eseguire la Sezione 8 per determinare il volume utilizzando Fourier filtrata Hilbert-trasformata immagini DIC. </li><li> Il volume di campione, riportato in micron cubico (fl) è presentato nel titolo della figura 600, 700, o 800 prodotto dal programma a seconda di quale viene scelto misura del volume. </li></ol> 6. Misure di massa <ol><li> Aprire il programma NIQPM MATLAB intitolato &quot;JoVE_NIQPM_v1.m&quot;. </li><li> Sotto la sezione 0 del programma NIQPM, aggiornare la posizione di tre directory necessarie per eseguire il programma. Questi sono i &quot;dependencies_directory&quot;, il &quot;brightfield_directory,&quot; e il &quot;dic_directory&quot;. </li><li> Avanti, sezione 1 eseguire. Questa sezione di codice genera un campo luminoso cubo del campo pieno di tutta la serie di immagini. SOLO RUN SEZIONE 1 VOLTA. </li><li> Avanti, Sezione 2 eseguire. Apparirà una finestra di dialogo intitolata &quot;Definisci NIQPM Parametri&quot;. Quattro numeri sono richiesti dall&#39;utente: il numero piano focale dove l&#39;immagine luminosa campo dellacampione è a fuoco, risoluzione laterale (micron / pixel nell&#39;immagine), la risoluzione assiale (questo è 0,1 per acquisizione immagini a 0,1 micron di passaggi assiali), e la regione di interesse dimensioni, questo parametro definisce la lunghezza di un lato di un dialogo che appaiono successivamente - un valore tipico è 200. Fare clic su OK. </li><li> Un&#39;immagine del piano focale campo luminoso specificato dal numero di piano focale apparirà con una scatola blu. <ol><li> Se l&#39;immagine non è a fuoco, fare doppio clic nella casella blu ed eseguire nuovamente sezione 2, assicurarsi di regolare il numero di piano focale nella finestra di dialogo. </li><li> Se l&#39;immagine è a fuoco, trascinare la casella blu intorno all&#39;immagine e ridimensionarlo selezionando i nodi della scatola e trascinandole come necessario. Posizionare la casella intorno la caratteristica di interesse, ad esempio un cellulare. La scatola non deve essere quadrata. Fare doppio clic all&#39;interno della casella di accettarla. </li></ol></li><li> Successivamente, eseguire Sezione 3 per costruire una pila di immagini in campo chiaro ritagliata nella regione di interesse. </li><li> Per generare la mappa di fase, pseudo immagine DIC e confronti con le immagini in campo chiaro e l&#39;immagine vera DIC, sezione 4 correre. </li><li> Con la pseudo DIC e DIC vere immagini il più possibile simili alla mappa di densità di massa, massa totale, e istogramma della densità cellulare possono essere determinati eseguendo Sezione 5a o 5b. Sezione 5 bis effettua il rilevamento automatico confine del campo - optimize &quot;soglia&quot; alla riga 300 - i valori tipici variano tra 0.1-1. Eseguire nuovamente questa sezione come necessario per ottimizzare il valore di soglia. Sezione 5b effettua la determinazione della massa, ecc dopo che l&#39;utente delinea la cella di interesse. </li></ol>

<ol><li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Das+Phasenkontrastverfahren+bei+der+mikroskopischen+Beobachtung%5BTitle%5D)+AND+%22Z.+Technische+Physik%22%5BJournal%5D)">Das Phasenkontrastverfahren bei der mikroskopischen Beobachtung.</a> Z. Technische Physik. 16, 454-457 (1935).</li>
<li>Zernike, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phase+contrast%2C+a+new+method+for+the+microscopic+observation+of+transparent+objects%5BTitle%5D)+AND+%22Physica%22%5BJournal%5D)">Phase contrast, a new method for the microscopic observation of transparent objects.</a> Physica. 9 (42), 974-986 (1942).</li>
<li>Blow, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Finding+Phase%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Finding Phase.</a> Nat. Cell Biol. 11, (2009).</li>
<li>Smith, F. H. Microscopic interferometry, Research. 8, 385-395 (1955).</li>
<li>Nomarski, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microinterf%C3%A9rom%C3%A8tre+diff%C3%A9rentiel+%C3%A0+ondes+polaris%C3%A9es%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Phys.+Radium%22%5BJournal%5D)">Microinterféromètre différentiel à ondes polarisées.</a> J. Phys. Radium. 16, (1955).</li>
<li>Lang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nomarski+differential-interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Zeiss+Inform%22%5BJournal%5D)">Nomarski differential-interference contrast microscopy.</a> Zeiss Inform. 70, 114-120 (1968).</li>
<li>Allen, R. D., Allen, N. S., Travis, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video-enhanced+contrast%2C+differential+interference+contrast+%28VEC-DIC%29+microscopy%3A+a+new+method+capable+of+analyzing+microtubule-related+motility+in+the+reticulopodial+network+of+Allogromia+laticollaris%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Motil.+Cytoskel%22%5BJournal%5D)">Video-enhanced contrast, differential interference contrast (VEC-DIC) microscopy: a new method capable of analyzing microtubule-related motility in the reticulopodial network of Allogromia laticollaris.</a> Cell Motil. Cytoskel. 1, 291-302 (1981).</li>
<li>Inoué, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Video+image+processing+greatly+enhances+contrast%2C+quality%2C+and+speed+in+polarization-based+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Video image processing greatly enhances contrast, quality, and speed in polarization-based microscopy.</a> J. Cell Biol. 89, 346-356 (1981).</li>
<li>Aslan, J. E., Itakura, A., Gertz, J. M., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Platelet+shape+change+and+spreading%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Platelet shape change and spreading.</a> Methods Mol. Biol. , 10-1007 (2012).</li>
<li>Barer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Interference+microscopy+and+mass+determination%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Interference microscopy and mass determination.</a> Nature. 169, 366-367 (1038).</li>
<li>Ross Barer, R., Tkaczyk, K. F. A., S, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractometry+of+living+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Refractometry of living cells.</a> Nature. 171, 720-724 (1953).</li>
<li>Preza, C., Snyder, D. L., Conchello, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Theoretical+development+and+experimental+evaluation+of+imaging+models+for+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Theoretical development and experimental evaluation of imaging models for differential interference contrast microscopy.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 16, 2185-2199 (1999).</li>
<li>Arnison, M. R., Larkin, K. G., Sheppard, C. J., Smith, N. I., Cogswell, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+phase+imaging+using+differential+interference+contrast+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Linear phase imaging using differential interference contrast microscopy.</a> J. Microsc. 214, 7-12 (2004).</li>
<li>Van Munster, E. B., Van Vliet, L. J., Aten, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reconstruction+of+optical+pathlength+distributions+from+images+obtained+by+a+wide%E2%80%90field+differential+interference+contrast+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Reconstruction of optical pathlength distributions from images obtained by a wide‐field differential interference contrast microscope.</a> J. Microsc. 188, 149-157 (1997).</li>
<li>Kou, S. S., Waller, L., Barbastathis, G., Sheppard, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transport-of-intensity+approach+to+differential+interference+contrast+%28TI-DIC%29+microscopy+for+quantitative+phase+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Transport-of-intensity approach to differential interference contrast (TI-DIC) microscopy for quantitative phase imaging.</a> Opt. Lett. 35, 447-449 (2010).</li>
<li>Xu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scattering-phase+theorem%3A+anomalous+diffraction+by+forward-peaked+scattering+media%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Scattering-phase theorem: anomalous diffraction by forward-peaked scattering media.</a> Opt. Exp. 19, 21643-21651 (2011).</li>
<li>Duncan, D. D., Fischer, D. G., Dayton, A., Prahl, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Carr%C3%A9+differential+interference+contrast+microscopy+to+assess+phase+and+amplitude%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">Quantitative Carré differential interference contrast microscopy to assess phase and amplitude.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 28, 1297-1306 (2011).</li>
<li>Barty, A., Nugent, K. A., Paganin, D., Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+optical+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantitative optical phase microscopy.</a> Opt. Lett. 23, 817-819 (1998).</li>
<li>Paganin, D., Nugent, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Non-interferometric+phase+imaging+with+partially+coherent+light%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Non-interferometric phase imaging with partially coherent light.</a> Phys. Rev. Lett. 80, 2586-2589 (1998).</li>
<li>Frank, J., Altmeyer, S., Wernicke, G. N. on-interferometric <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((non-iterative+phase+retrieval+by+Green%E2%80%99s+functions%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Opt.+Soc.+Am.+A%22%5BJournal%5D)">non-iterative phase retrieval by Green’s functions.</a> J. Opt. Soc. Am. A. 27, 2244-2251 (2010).</li>
<li>Phillips, K. G., Velasco, C. R., Li, J., Kolatkar, A., Luttgen, M., Bethel, K., Duggan, B., Kuhn, P., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+quantification+of+cellular+mass%2C+volume%2C+and+density+of+circulating+tumor+cells+identified+in+an+ovarian+cancer+patient%5BTitle%5D)+AND+%22Front.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Optical quantification of cellular mass, volume, and density of circulating tumor cells identified in an ovarian cancer patient.</a> Front. Oncol. 2, 1-8 (2012).</li>
<li>Phillips, K. G., Jacques, S. L., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+single+cell+refractive+index%2C+dry+mass%2C+volume%2C+and+density+using+a+transillumination+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Measurement of single cell refractive index, dry mass, volume, and density using a transillumination microscope.</a> Phys. Rev. Lett. 109, 1-5 (2012).</li>
<li>Park, Y. K., Diez-Silva, M., Popescu, G., Lykotrafitis, G., Choi, W., Feld, M. S., Suresh, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Refractive+index+maps+and+membrane+dynamics+of+human+red+blood+cells+parasitized+by+Plasmodium+falciparum%5BTitle%5D)+AND+%22%22%5BJournal%5D)">Refractive index maps and membrane dynamics of human red blood cells parasitized by Plasmodium falciparum.</a> , 105-13730 (2008).</li>
<li>Mir, M., Wang, Z., Shen, Z., Bednarz, M., Bashir, R., Golding, I., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cycle-dependent+cell+growth%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cycle-dependent cell growth.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 108, 13124-13129 (2011).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Goda, K., Best-Popescu, C. A., Laposata, M., Manley, S., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+measurement+of+cell+membrane+tension%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical measurement of cell membrane tension.</a> Phys. Rev. Lett. 97, 1-4 (2006).</li>
<li>Popescu, G., Ikeda, T., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diffraction+phase+microscopy+for+quantifying+cell+structure+and+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Diffraction phase microscopy for quantifying cell structure and dynamics.</a> Opt. Lett. 31, 775-777 (2006).</li>
<li>Choi, W., Fang-Yen, C., Badizadegan, K., Oh, S., Lue, N., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tomographic+phase+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Methods%22%5BJournal%5D)">Tomographic phase microscopy.</a> Nat. Methods. 4 (9), 717-719 (2007).</li>
<li>Charrière, F., Marian, A., Montfort, F., Kuehn, J., Colomb, T., Cuche, E., Depeursinge, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+refractive+index+tomography+by+digital+holographic+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Cell refractive index tomography by digital holographic microscopy.</a> Opt. Lett. 31, 178-180 (2006).</li>
<li>Joo, C., Akkin, T., Cense, B., Park, B. H., de Boer, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectral-domain+optical+coherence+phase+microscopy+for+quantitative+phase-contrast+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Spectral-domain optical coherence phase microscopy for quantitative phase-contrast imaging.</a> Opt. Lett. 30, 2131-2133 (2005).</li>
<li>Wang, Z., Millet, L., Mir, M., Ding, H., Unarunotai, S., Rogers, J., Popescu, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+light+interference+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22SLIM%29.+Opt.+Exp%22%5BJournal%5D)">Spatial light interference microscopy.</a> SLIM). Opt. Exp. 19, 1016-1026 (2011).</li>
<li>Ikeda, T., Popescu, G., Dasari, R. R., Feld, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hilbert+phase+microscopy+for+investigating+fast+dynamics+in+transparent+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Hilbert phase microscopy for investigating fast dynamics in transparent systems.</a> Opt. Lett. 30, 1165-1167 (2005).</li>
<li>Shaked, N. T., Rinehart, M. T., Wax, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dual-interference-channel+quantitative-phase+microscopy+of+live+cell+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Opt.+Lett%22%5BJournal%5D)">Dual-interference-channel quantitative-phase microscopy of live cell dynamics.</a> Opt. Lett. 34, 767-769 (2009).</li>
<li>Popescu, G., Park, Y., Lue, N., Best-Popescu, C., Deflores, L., Dasari, R. R., Badizadegan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+imaging+of+cell+mass+and+growth+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Physiol.+Cell+Physiol%22%5BJournal%5D)">Optical imaging of cell mass and growth dynamics.</a> Am. J. Physiol. Cell Physiol. 295, (2008).</li>
<li>Arnison, M. R., Cogswell, C. J., Smith, N. I., Fekete, P. W., Larkin, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Using+the+Hilbert+transform+for+3D+visualization+of+differential+interference+contrast+microscope+images%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Microsc%22%5BJournal%5D)">Using the Hilbert transform for 3D visualization of differential interference contrast microscope images.</a> J. Microsc. 199, 79-84 (2001).</li>
<li>Baker, S. M., Phillips, K. G., McCarty, O. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+label-free+imaging+technique+for+the+quantification+of+thrombus+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Mol.+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Development of a label-free imaging technique for the quantification of thrombus formation.</a> Cell. Mol. Bioeng. 5, 488-492 (2012).</li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari nel lavoro presentato.

In generale, NIQPM è una tecnica di diffrazione limitata convalidata su percorso lunghezze ottiche vanno ,25-44,7. Validazione è stata eseguita su n = 1.596 sfere di polistirene variano in diametro 0,11-9,8 micron sospese in Fluoromount G (dati non mostrati). Cellule possiedono percorso lunghezze ottiche che vanno da quasi 0-7. Quando si misura la distribuzione della densità di un esemplare si può scoprire che l&#39;immagine pseudo DIC guarda bene mentre la mappa di densità possiede contribu...

L&#39;uso della microscopia ottica è ormai onnipresente nelle indagini di organismi cellulari. Grazie al loro basso endogeni di assorbanza e di scattering deboli strutture in spettro ottico visibile, le cellule non influenzano fortemente l&#39;ampiezza delle onde ottiche li attraversano e quindi appaiono semitrasparente quando ripreso con microscopi da campo luminoso standard. Campioni cellulari, tuttavia, rallentano onde ottiche viaggiano attraverso di loro in un modo che è linearmente correlata alla quantità di densità di massa locale in una particolare regione dello spazio attraverso il quale la luce viaggia. Utilizzo di questo sfasamento temporale eterogenea profilo o &quot;fase&quot; di onde ottiche trasmessi attraverso campioni microscopici è stato descritto nel 1935 da Frits Zernike 1 e sperimentale realizzato da Zernikein 1942 2. Zernike ha ricevuto il premio Nobel nel 1953 per questo risultato. Zeiss commercializzato questa modalità nel 1945 3. Nel 1955, Smith e NomarskVorrei presentare il loro lavoro iniziale per l&#39;uso 4 e 5 teoria di contrasto di interferenza differenziale (DIC) microscopio, una modalità che utilizza il gradiente spaziale di fase come un meccanismo di contrasto. DIC è stato commercializzato da Zeiss nel 1965in stretta collaborazione con Nomarski 6. Nel 1981, due laboratori hanno dimostrato il primo registrato cellule vive DIC immagini con l&#39;incorporazione di telecamere nel treno ottica del microscopio DIC 7, 8. L&#39;era di imaging cellulare dal vivo è nato. Da questo momento, l&#39;esecuzione sia contrasto di fase e DIC sui microscopi commerciali è sostanzialmente rimasta invariata. Questi metodi sono principalmente utilizzati dai biologi per produrre immagini di cellule a fini qualitativi: il monitoraggio della morfologia, il monitoraggio delle strutture subcellulari, e ricerche di dinamica della membrana 9. Queste tecniche sono di qualità nella loro configurazione &quot;off-the-shelf&quot; sia come fase e DIImmagini c sono funzioni arbitrarie della intensità della sorgente luminosa, le impostazioni ottica di illuminazione, e guadagno della telecamera CCD, gamma, e le impostazioni di esposizione. Una piccola legione di fisici e ingegneri ottici si è sforzata di rendere le modalità di imaging commerciali quantitativa. Tra i primi sforzi erano due lettere a Nature nel 1952 e nel 1953 in cui il medico-gir-biofisico Robert Barer dimostrato l&#39;uso della microscopia fase per determinare la massa secca cellulare delle cellule stimando sfasamenti attraverso questi tipi di cellule utilizzando un microscopio a fase disponibile in commercio 10, 11. Il campo ha sviluppato una moltitudine di tecniche nel corso degli anni successivi, basata soprattutto tre meccanismi di contrasto di base label-free: microscopia fase di 10,11, DIC microscopia 12-17, e in campo chiaro 18-22 per determinare ottica percorso di lunghezza, fase, massa densità, indice di rifrazione, e volume cellulare. In parallel, una vasta collezione di strumenti ottici personalizzati sono stati sviluppati dal 1950, e hanno fatto di vasta portata misurazioni ottiche che vanno da applicazioni in crescita del parassita 23, a documentare il ciclo cellulare da 24 a indagare le dinamiche della membrana dei globuli rossi 25. In particolare, negli ultimi dieci anni ha visto una ricchezza di microscopia quantitativa label-free in forma di microscopia fase di diffrazione 26, tomografica microscopio fase 27, digitale microscopia olografica 28, sensibile alla fase a coerenza ottica microscopio 29, spaziale microscopio interferenza della luce 30, Hilbert fase microscopia 31, e microscopia fase quantitativa 32. Nonostante i loro successi collettivi, questi strumenti non sono stati diffusi al campo più ampio dei ricercatori biologici a causa, principalmente, alla loro complessa strumentazione e requisiti di calcolo. Qui abbiamo DEscribe l&#39;uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e DIC immaginario. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC), per determinare il volume. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica. Le condizioni di imaging necessaria per la corretta esecuzione rientrano nell&#39;ambito del normale funzionamento della maggior parte dei microscopi disponibili in commercio. Inoltre, gli algoritmi di post-processing sono stabili, veloce e robusto - essendo stato implementato in MATLAB utilizzando trasformata veloce di Fourier algoritmi (FFT) basate quando possibile. NIQPM è un metodo per ricostruire fase e la densità di massa assialmente integrata di celesemplari lular provenienti da campi immagini luminose. Sommatoria di questa densità di massa assialmente integrata sull&#39;area del campione si ottiene il tenore massa secca totale del campione. Il protocollo NIQPM si basa sulle fondamenta sperimentali previste dal Paganin e Nugent 18, 19 - in cui è stato dimostrato che il profilo fase di una cella potrebbe essere ricostruita dal passante focalizzazione campo chiaro immaginario del campione - e il lavoro teorico di Frank , Altmeyer, e Wernicke 20 - sulla soluzione dei modelli di onda retti in modo efficiente basata su FFT. Il collegamento di fase alla densità massa secca si basa sul lavoro da Barer 10, 11 e 33 Popescu. Informazioni volumetrica può essere ottenuta da passante fuoco DIC imagery sotto alte condizioni di illuminazione NA che consentono sezionamento ottico del campione lungo l&#39;asse ottico. Trasformata di Hilbert trattamenti sulle pile di immagini DIC aumenta notevolmentealgoritmi di rilevamento dei bordi per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. Questo lavoro nasce con Arinson et al. 34 sebbene abbiamo introdotto entrambi i metodi di filtraggio di Fourier per aumentare il contrasto e un metodo di rilevamento del bordo basato Sobel per l&#39;analisi volumetrica automatizzata del campione. Abbiamo anche convalidato HTDIC precedenza su sfere di polistirolo che variano nel formato dal limite di diffrazione fino a 20 micron di diametro 36. Mentre sia NIQPM e HTDIC sono tecnologicamente accessibili a causa del loro sviluppo sui microscopi commerciali, i metodi sono fondamentalmente limitate dalla configurazione hardware dei microscopi stessi. I limiti principali di queste tecniche sono duplici: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali, grazie alla traduzione di tutta la fase del campione in contrasto con appena la lente obiettivo, Attualmente limita l&#39;indagine dei fenomeni più veloce di circa 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l&#39;utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti che variano nel formato da 0,2 fino a 10 e 20 micron di diametro, rispettivamente. Quindi, il campione e le sue dinamiche temporali associati di interesse devono soddisfare determinate dimensioni e dei vincoli temporali per consentire l&#39;utilizzo di questi metodi su strumenti tipici &quot;off-the-shelf&quot;. Eccitante, la maggior parte dei campioni cellulari fissi sono prontamente studiate con questi metodi. Una panoramica del NIQPM e protocolli HTDIC sono indicati nella figura 1. Nella figura 2 si illustrano di imaging ottimale e subottimale attraverso fuoco in NA condizioni sia bassa e alta illuminazione sia per campo chiaro e DIC immagini. Figure 3 e 4 dimostrano la dipendenza dei parametri dell&#39;algoritmo NIQPM evidenziando implementazioni di successo e insuccesso. <strong&gt; Figura 5 illustra i passaggi necessari per l&#39;algoritmo di elaborazione delle immagini HTDIC e illustra l&#39;implementazione ottimale dell&#39;algoritmo per determinare il volume cellulare.

<table><tbody><tr><td>Microscopio Zeiss Axio Imager 2</td><td>Carl Zeiss MicroImaging GmbH, Germania</td><td>Microscopio Axio Imager D2</td><td></td></tr><tr><td>Filtro verde (&lambda; = 540 &plusmn; 25 nm)</td><td>Chroma Technology Corp., Bellows Falls, Vermont</td><td>D540/25x</td><td>Filtro verde</td></tr><tr><td>Software SlideBook 5.5</td><td>Intelligent Imaging Innovations, Denver, Colorado</td><td></td><td>Software di acquisizione immagini</td></tr><tr><td>Polistirene microsfere</td><td>Bangs Laboratory, Inc., Fishers, IN</td><td>PS06N</td><td>Sfere di polistirene</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>SouthernBiotech, Birmingham, Alabama</td><td>0100-01</td><td>Mezzi di montaggio</td></tr></tbody></table>

quantitative microscopia ottica: misura di biofisica cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

Quantitative Optical Microscopy: Measurement of Cellular Biophysical Features with a Standard Optical Microscope

Descriviamo l&#39;uso di un microscopio ottico standard effettuare misurazioni quantitative di massa, volume e densità su campioni cellulari attraverso una combinazione di campo luminoso e interferenze immaginario contrasto differenziale. Due approcci principali sono presentati: noninterferometric microscopia fase quantitativa (NIQPM), effettuare misurazioni di massa cellulare totale e la distribuzione subcellulare densità e trasformata di Hilbert differenziale microscopio a contrasto di interferenza (HTDIC) per determinare il volume. NIQPM si basa su un modello semplificato di propagazione delle onde, chiamata approssimazione parassiale, con tre ipotesi di base: bassa apertura numerica (NA), illuminazione, diffusione deboli e debole assorbimento della luce da parte del campione. Fortunatamente, i campioni cellulari non colorati soddisfano questi presupposti e bassa illuminazione NA è facilmente raggiunti nei microscopi commerciali. HTDIC viene utilizzato per ottenere informazioni volumetrico da tramite a fuoco DIC immagini ad alta illumin NAcondizioni di cooperazione. Illuminazione elevata NA agevola la massima sezionamento del campione lungo l&#39;asse ottico. Trasformata di Hilbert di elaborazione dell&#39;immagine DIC su pile migliora notevolmente algoritmi di rilevamento del bordo per la localizzazione dei bordi del provino in tre dimensioni separando i valori di grigio di intensità campione da quelli dello sfondo. I vantaggi principali di NIQPM e HTDIC laici nella loro accessibilità tecnologica con microscopi &quot;off-the-shelf&quot;. Ci sono due limiti fondamentali di questi metodi: slow z-stack tempo di acquisizione in ambiti commerciali attualmente abroga l&#39;indagine dei fenomeni più veloce di 1 fotogramma / minuto, e in secondo luogo, gli effetti di diffrazione limitano l&#39;utilità di NIQPM e HTDIC agli oggetti da 0.2 fino a 10 (NIQPM) e 20 (HTDIC) micron di diametro, rispettivamente. Quindi, la dinamica dei campioni e la sua associata di interesse devono soddisfare certa dimensione e vincoli temporali per consentire l&#39;uso di questi metodi. Eccitante, cellula più fissoI campioni r sono prontamente studiate con questi metodi.

Corretta illuminazione campione durante passante fuoco acquisizione delle immagini è fondamentale per la corretta attuazione del NIQPM un algoritmi HTDIC nd. Nella figura 2 si illustrano alta e bassa illuminazione NA sia sotto DIC e contrasto campo chiaro di una sfera di polistirolo e la linea cellulare di adenocarcinoma del colon umano SW620. Figure 2A, 2C, 2I, e 2K dimostrano di imaging ottimale per NIQPM. Figure 2F, 2H, 2N e 2P dimos...

Descriviamo l'uso di un microscopio ottico standard per eseguire misurazioni quantitative della massa, del volume e della densità cellulare attraverso una combinazione di immagini in campo chiaro e contrasto interferenziale differenziale.

Quantitative Microscopia ottica: Misura di Biofisica Cellulare caratteristiche con un microscopio ottico standard

We describe the use of a standard optical microscope to perform quantitative measurements of mass, volume, and density on cellular specimens through a ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quantificare caratteristiche fisiche fondamentali di campioni cellulari, inclusi massa e volume, utilizzando un microscopio ottico standard ed elaborazione delle immagini. Questo viene ottenuto innanzitutto montando campioni cellulari coltivati su coprioggetti di vetro su portaslide per microscopio. Successivamente, vengono acquisite immagini a campo chiaro e in contrasto di interferenza differenziale attraverso messa a fuoco.Successivamente, ogni stack Z di immagini viene inserito in programmi separati di elaborazione delle immagini in MATLAB che estraggono i dati fisici. In definitiva, le proprietà fisiche fondamentali dei campioni cellulari vengono ottenute mediante misurazioni dell'intensità a fuoco attraverso contrasto in campo chiaro e microscopia a contrasto di interferenza differenziale. Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la microscopia a fluorescenza, è che i campioni cellulari non devono essere fissati, permeabilizzati o colorati.Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della biologia cellulare, come ad esempio come è organizzata la densità subcellulare durante il ciclo cellulare o tra diverse popolazioni cellulari che contribuiscono a uno stato patologico. Utilizzando un microscopio dotato sia di contrasto di interferenza differenziale (DIC) che di illuminazione in campo chiaro, e con ulteriori specifiche indicate nel protocollo, iniziare aprendo il software slide book e creando una nuova diapositiva per la raccolta delle immagini. Successivamente, aprire la finestra di messa a fuoco e, nella sezione set di filtri, selezionare DIC. Nella scheda microscopio, nella sezione condensatore, regolare la barra scorrevole dell'apertura nella posizione più a destra. Questo fornisce un'illuminazione ad alta apertura numerica e migliora la sezione ottica del campione.Dopo aver acquisito uno stack DIC del campione, aprire la finestra del fuoco e selezionare "apri". Nella sezione set di filtri, regolare la barra di apertura nella posizione più a sinistra, completamente chiusa, per fornire un'illuminazione a bassa apertura numerica (NA). Dopo aver regolato l'intensità del segnale, aprire la finestra di acquisizione dell'immagine.Le impostazioni di acquisizione 3D dello stack DICZ verranno visualizzate nella sezione del set di filtri della finestra di acquisizione dell'immagine. Selezionare la casella di controllo e specificare il tempo di esposizione. Nella sezione informazioni immagine, assegnare un nome all'immagine e selezionare avvio per iniziare l'acquisizione dell'immagine Zack.Quindi esportare gli stack Z seguendo il protocollo testuale per effettuare le misurazioni volumetriche nel programma MATLAB H-T-D-I-C intitolato JoVE HT DCO V one M. Nella sezione zero, aggiornare la variabile della directory delle dipendenze copiando e incollando la directory contenente i file hilbert. Transform DM e sobel edge Detect M da Explorer. Tra le virgolette singole successive a "dependencies directory equals", eseguire la sezione zero del programma joco HT DCO V one M.Nella sezione uno, aggiornare la directory delle immagini copiando e incollando la directory contenente le immagini a fuoco attraverso in formato TIF. Tra gli apici singoli, eseguire questa sezione una sola volta per allineare e ruotare le immagini. Per la trasformata di Hilbert, eseguire la sezione due del codice: apparirà una finestra di dialogo intitolata Definisci parametri HT DIC.Quindi inserire il numero del piano focale in cui l'immagine DIC del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale, l'angolo di rotazione dell'immagine DIC necessario per eseguire la trasformata di Hilbert e, infine, la dimensione della regione di interesse. Quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine del piano focale DIC specificato dal numero del piano focale, con un riquadro blu.Posizionare la casella sulla caratteristica di interesse, ad esempio una cellula. Una volta posizionata la casella sulla regione desiderata, fare doppio clic all'interno della B. Il contrasto dell'immagine deve essere tale che le caratteristiche scure appaiano a sinistra mentre quelle chiare a destra. Trascinare la casella blu sulla regione di interesse e ridimensionarla secondo necessità.Successivamente, nella sezione tre, per generare una maschera rettangolare, decommentare la riga 1 6 7 e commentare la riga 1 7 0; eseguire la sezione tre del programma cliccando sull'immagine e trascinando il mouse per iniziare a definire la maschera rettangolare. Quindi fare doppio clic sulla casella per accettarla. Per generare una maschera disegnata a mano, commentare la riga 1 6 7 e decommentare la riga 1 7 0 prima di eseguire la sezione tre. Cliccando e disegnando la maschera desiderata con il mouse, fare doppio clic sulla maschera per accettarla. Dopo aver eseguito la sezione quattro, per costruire pile di immagini trasformate secondo Hilbert come descritto nel protocollo, eseguire la sezione cinque.Per ottimizzare la segmentazione dell'immagine nelle sezioni trasversali xz della regione di interesse. La figura 500 generata dal programma mostra tre tipi diversi di contrasto. Il successo dell'algoritmo nel rilevare i bordi della cellula dipende dalla combinazione della maschera utilizzata e dal valore della soglia alla riga 2, 2, 9 del programma: iniziare con un valore di 0,5 e modificare il valore della soglia, quindi rieseguire questa sezione del programma finché non si ottiene un contorno adeguato in una delle colonne.Se il contorno era migliore nella colonna uno, nella segmentazione DIC, utilizzare la sezione sei per determinare il volume. Se la colonna due ha fornito i risultati ottimali, eseguire la sezione sette per determinare il volume cellulare a partire dall'immagine DIC trasformata con Hilbert. Se la colonna tre ha fornito i risultati ottimali, utilizzare l'immagine DIC filtrata con trasformata di Hilbert eseguendo la sezione otto per determinare il volume ai fini delle misurazioni di massa nel programma MATLAB NIQ PM intitolato JO VCO NI qpm V1 M nella sezione zero. Aggiornare la posizione delle tre directory dipendenze, BRIGHTFIELD e directory DIC; dopo aver eseguito la sezione uno, eseguire la sezione due; nella finestra di dialogo intitolata definire i parametri N-I-Q-P-M inserire il numero del piano focale in cui l'immagine in campo chiaro del campione è a fuoco, la risoluzione laterale, la risoluzione assiale e la dimensione della regione di interesse.Quindi fare clic su OK. Apparirà un'immagine del piano focale in campo chiaro specificato dal numero del piano focale, con un riquadro blu. Dopo aver regolato il fuoco se necessario, ripetendo la sezione due, trascinare il riquadro sull'immagine e selezionare i nodi del riquadro trascinandoli per ridimensionarlo, quindi fare doppio clic all'interno del riquadro per confermarlo.Dopo aver costruito uno stack di immagini in campo chiaro eseguendo la sezione tre, eseguire la sezione quattro per generare la mappa di fase, le immagini pseudo DIC e i confronti con le immagini in campo chiaro e con l'immagine DIC reale; quando le immagini pseudo DIC e quelle DIC reali sono il più simili possibile, eseguire la sezione cinque A o la sezione cinque B, che consentono all'utente di delineare la cellula per generare la mappa di densità di massa, la massa totale e l'istogramma corretto della densità cellulare. L'illuminazione del campione durante l'acquisizione delle immagini in messa a fuoco è fondamentale per l'implementazione corretta degli algoritmi N-I-Q-P-M e H-T-D-I-C. Questa figura illustra un'illuminazione a bassa e alta NA in condizioni di contrasto DIC e in campo chiaro, rispettivamente, per una sfera di polistirene e per la linea cellulare di adenocarcinoma colorettale umano SW six 20.Questi pannelli mostrano l'imaging ottimale per N-I-Q-P-M e questi mostrano l'imaging ottimale per HT DIC. Queste immagini illustrano la dipendenza dai parametri dell'algoritmo NIQ PM, evidenziando implementazioni sia riuscite che non riuscite. Qui esploriamo il profilo di fase di una sfera di polistirene con diametro di 4,8 micrometri.Il profilo previsto è noto teoricamente e può quindi essere confrontato direttamente con la ricostruzione NIQ PM. Questi pannelli mostrano la migliore ricostruzione ottenibile per gli effetti di diffrazione della sfera; tuttavia, ai bordi della sfera e all'interno di essa, tali effetti impediscono una ricostruzione stabile in tutti i punti della sfera. La regione centrale della sfera può essere riprodotta con N-I-Q-P-M con un errore percentuale compreso tra l'1% e il 5%, come mostrato nel pannello L, su campioni cellulari le cui proprietà di fase non sono note.Un'immagine a priori può essere ricostruita utilizzando il PMM NIQ in combinazione con una procedura per confrontare un'immagine DIC pseudo con un'immagine DIC reale. N-I-Q-P-M ha un parametro libero: il piano all'interno della serie di immagini del campo destro in cui viene centrato il calcolo.Questo piano focale centrale deve essere regolato finché le immagini in pseudo DIC e in DIC reale non risultano il più simili possibile. Vengono qui presentate un'immagine in pseudo DIC fuori fuoco, un'immagine in pseudo DIC ottimale e l'immagine in DIC corrispondente della cellula, acquisita con un NA di illuminazione di 0,9. In modo interessante, la mappa di fase migliore e l'immagine corrispondente in pseudo DIC non corrispondono necessariamente a un'immagine a campo chiaro a fuoco, come mostrato in questi pannelli.Infine, qui vengono mostrati i passaggi coinvolti nell'algoritmo di elaborazione delle immagini H-T-D-I-C a partire dalle immagini DIC in funzione del fuoco ottenute con illuminazione a NA uguale a 0,9; viene eseguita la trasformata di Hilbert per rimuovere il rilievo di base delle immagini DIC. Questo comporta un certo sfocamento lungo l'asse ottico, che può essere eliminato mediante un filtro passa-alto. Queste immagini finali possono essere facilmente segmentate per determinare l'area in ciascun piano trasversale del campione, al fine di ricavare il volume cellulare totale.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare l'illuminazione corretta per l'immagine in campo chiaro o in contrasto di fase differenziale dopo questa procedura. Altri metodi, come la microscopia a fluorescenza, possono essere eseguiti per rispondere a domande aggiuntive mediante la codistribuzione della forza del pavimento con le mappe di densità del campione.

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