In utero Misurazione della frequenza cardiaca in mouse da non invasiva ecocardiografia M-mode

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare la frequenza cardiaca degli embrioni di topo in utero a E 18,5 utilizzando una semplice ecografia in modalità M. Ciò si ottiene posizionando prima in modo sicuro la femmina incinta sulla piattaforma con anestesia continua. In secondo luogo, la posizione degli embrioni viene identificata lungo l'epidermide dell'addome della femmina.

Il terzo passo consiste nel misurare la frequenza cardiaca di ogni embrione utilizzando un trasduttore da 30 megahertz. Quindi le code degli embrioni vengono raccolte per la genotipizzazione. In definitiva, i risultati possono mostrare come la frequenza cardiaca di ciascun embrione viene determinata in utero misurando il tempo impiegato in millisecondi per ciclo cardiaco.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto al metodo esistente come la videomicroscopia è che è un metodo semplice progettato sia per specialisti che per non specialisti e fornisce misurazioni della frequenza cardiaca estremamente accurate. Una corretta preparazione del sistema e del materiale è fondamentale e una procedura troppo lunga può influire sulle caratteristiche fisiologiche ed emodinamiche dei feti. Avviare il sistema di imaging a ultrasuoni.

Collegare la testina di scansione che corrisponde al trasduttore da 30 megahertz e collegare l'unità di controllo della fisiologia all'unità di controllo. Scegliere il programma di misurazione cardiaca. Quindi, riempire il nasello della testina di scansione con l'acqua ionizzata.

Evitare le bolle d'aria in quanto interferiscono con la risoluzione dell'immagine. Posizionare la testina di scansione con il sito dell'impugnatura rivolto verso l'alto sul suo supporto vicino alla piattaforma di imaging nell'area di lavoro disinfettata, riempire completamente il flacone di gel per ultrasuoni. Evitare la formazione di bolle di grandi dimensioni.

Metti la bottiglia capovolta nel suo contenitore di preriscaldamento impostato a 37 gradi Celsius. Verificare i livelli di ossigeno e isofluoro nel sistema di tubi per l'anestesia. Un esperimento con circa otto embrioni utilizzerà da 15 a 20 litri di ossigeno e non dovrebbe richiedere più di un'ora per essere eseguito.

Posizionare i flaconi di balsamo oftalmico, crema depilatoria e gel per elettrodi vicino alla piattaforma di imaging. Verificare che la lampada di calore a infrarossi funzioni. Dovrebbe essere impostato alla distanza e all'intensità corrette in modo che i topi posizionati al di sotto di esso possano mantenere la temperatura corporea e una frequenza cardiaca costante.

Anestetizzare la femmina gravida in una camera con un apporto continuo di 2% di isof, fluoro e ossigeno fino a quando non diventa non responsiva. Posizionare il mouse sulla piattaforma di imaging in posizione supina. Regolare il tubo per l'inalazione continua di fluoro iso all'1,5% e ossigeno e fissare il tubo di inalazione con del nastro adesivo.

Un'anestesia sufficiente deve essere confermata durante la procedura dalla postura rilassata del topo e dall'assenza di qualsiasi risposta ai pizzicamenti della coda e delle dita dei piedi. Posizionare il gel dell'elettrodo solo sui cuscinetti degli elettrodi in alto a sinistra e in basso a destra per le quattro zampe destre e la zampa posteriore sinistra. Per l'elettrocardiografia, fissare le quattro zampe a ciascun tampone con del nastro adesivo per prevenire la secchezza degli occhi.

Applicare una goccia di balsamo oftalmico in ciascun occhio. Quindi, radere l'addome dal petto alla vescica con un tagliacapelli. Fare attenzione a non tagliare i capezzoli, quindi applicare la crema depilatoria per due minuti e pulirla accuratamente con una garza per rimuovere eventuali peli rimanenti.

Infine, inserire il termometro prelubrificato con gel per elettrodi nel retto della femmina. Mantenere la temperatura corporea e la frequenza cardiaca regolando la lampada termica a infrarossi. Se la temperatura corporea scende sotto i 36,5 gradi Celsius, fermarsi, effettuare le regolazioni della lampada e attendere un paio di minuti prima di procedere.

Ciò richiederà pazienza dopo aver preparato la madre con tutti gli strumenti a portata di mano, premuta delicatamente sull'addome nudo per localizzare gli embrioni lentamente e leggermente. Distribuiscili per avere la maggior parte degli embrioni in un unico strato sotto la superficie addominale in ogni corno uterino, i sacchi sono collegati linearmente. Cerca di rispettare questo ordine quando distribuisci.

In alcuni ceppi, alcuni embrioni si trovano sotto gli altri. Escludere questi embrioni dall'analisi. Contrassegna ogni embrione sull'addome nudo della femmina con un pennarello permanente con le loro direzioni ventrale anteriore, posteriore e dorsale.

Numerare gli embrioni nelle corna destra e sinistra a partire dalla cervice. Quindi disegna la loro posizione su un pezzo di carta per rintracciarli. Posizionare una piccola quantità di gel per ultrasuoni preriscaldato sull'addome nudo e distribuirlo uniformemente.

Evitare la formazione di bolle. Aggiungere circa cinque millilitri di gel sull'area specifica per visualizzare la perdita di capelli con anestesia lunga e gel ad ultrasuoni. Sebbene il preriscaldamento possa portare all'ipotermia e successivamente influenzare la temperatura corporea delle femmine.

Se la temperatura corporea scende al di sotto di 36,5 gradi Celsius o la frequenza cardiaca scende al di sotto di 400 battiti al minuto, in qualsiasi momento durante la procedura, fermarsi, avvicinare la lampada riscaldante e attendere un paio di minuti per consentire ai segni vitali di riadattarsi. Tenere la sonda a contatto con lo spesso strato di gel e muovere gradualmente la sonda verso la pelle mentre si cerca il cuore pulsante. Quindi regolare l'angolo della sonda in modo che entrambi i ventricoli siano della loro dimensione massima nel piano di imaging.

Inizia ad acquisire le immagini con l'avambraccio appoggiato sulla stazione. Posizionare il trasduttore sul gel per ultrasuoni per ottenere un'immagine dal vivo sullo schermo di visualizzazione. Mantenere la cresta del trasduttore rivolta verso l'alto e fare clic sull'indicatore di orientamento della testina della pelle.

Avviando la cervice, spostati sull'embrione più vicino e visualizza il cuore pulsante al centro dello schermo nella zona focale. Muovere delicatamente la sonda su e giù e anche lateralmente senza perdere il contatto con il gel. Per ottenere il piano dell'immagine desiderato, acquisire la registrazione dal vivo.

Ottenere l'immagine dell'esploratore e riprendere la registrazione per almeno cinque secondi prima di procedere all'embrione successivo. Una volta analizzati tutti gli embrioni, premere Sfoglia sulla tastiera. Per visualizzare l'elenco delle registrazioni, riprodurre ogni tracciamento in modalità M registrato e misurare la spaziatura tra almeno sei picchi adiacenti per ottenere la frequenza cardiaca media.

Non muovere il topo, ma eseguire la procedura chirurgica sulla piattaforma di imaging per tenere traccia degli embrioni numerati utilizzando forbici chirurgiche pulite e pinze longitudinalmente nelle dimensioni, nella pelle e negli strati muscolari dell'addome. Individua i sacchi in ogni corno uterino e abbina i numeri. Taglia il sacco di quercia per esporre l'embrione nell'ordine usato sopra.

Se non in una disposizione lineare, vedere lo schizzo su carta delle posizioni dell'embrione tagliate circa quattro millimetri di ciascuna coda. Per la genotipizzazione, poiché il DNA genomico viene estratto in modo molto efficiente dalle code embrionali una volta terminato, sopprimere tutti gli animali in base al comitato per la cura degli animali. Utilizzando il metodo descritto, è stato valutato l'impatto della proteasi furina siriana nelle cellule endoteliali.

La misurazione della frequenza cardiaca degli embrioni di topo a E 18,5 in utero ha rivelato che gli embrioni eco omozigoti ma non eterozigoti privi di furina soffrivano di tachicardia Una volta padroneggiati. Questa tecnica può essere eseguita in circa un'ora per un litro di sei-otto embrioni.