PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS

L'obiettivo generale di questa procedura è formare nanoparticelle polimeriche di dimensioni regolabili. Questo risultato si ottiene sciogliendo innanzitutto un polimero in un solvente organico e aggiungendo un farmaco o un agente incapsulante fluorescente. Il secondo passaggio consiste nell'emulsionare il polimero con una fase acquosa contenente l'agente emulsionante, per poi permettere alle particelle di indurirsi in un volume acquoso più grande man mano che il solvente evapora.

Successivamente, le particelle vengono lavate, raccolte mediante centrifugazione e liofilizzate per un immagazzinamento a lungo termine. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare le dimensioni delle nanoparticelle e la morfologia superficiale mediante microscopia elettronica a scansione o imaging al SEM. In definitiva, il SEM viene utilizzato per dimostrare che le dimensioni delle nanoparticelle possono essere controllate variando la concentrazione dell'emulsionante.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse malattie umane, poiché le particelle possono essere personalizzate per incapsulare e rilasciare una vasta gamma di agenti terapeutici con azione prolungata. Nel tessuto bersaglio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Le fasi di emulsionamento sono difficili da apprendere perché aspetti sottili della formazione dell'emulsione possono avere un impatto significativo sulle proprietà delle particelle. Per iniziare la preparazione delle nanoparticelle, mettere circa 100 milligrammi di acido polilattico-co-glicolico, noto anche come PLGA, in un tubo da 13 per 100 millimetri. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica di vetro, trasferire un millilitro di acetato di etile nel campione, coprire l'apertura del tubo con della carta d'alluminio e quindi sigillare accuratamente la carta con del para film.

Assicurarsi di avvolgere bene il parafilm lungo il bordo superiore della provetta e il bordo inferiore della stagnola per evitare l'evaporazione del solvente. Segnare il livello del solvente sul tubo da saggio e lasciare sciogliere il polimero per tutta la notte. Il giorno successivo, aggiungere ulteriore solvente se si verifica dell'evaporazione.

Preparare le seguenti attrezzature e materiali in una cappa chimica vicina all'ultrasuoni. Vortexare due piccole pipette di Pasteur in vetro con bulbi di gomma e una piastra magnetica di agitazione. Inoltre, posizionare un grande becher pieno di acqua ghiacciata su un supporto al di sotto dell'ultrasuoni.

Successivamente, aggiungere 45 millilitri di vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% peso/volume in un becher di vetro da 200 millilitri, quindi impostare la velocità di agitazione a 360 giri al minuto. Aggiungere quindi 2 millilitri della vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% peso/volume in un tubo di prova di vetro da 13 × 100 millimetri. Per incorporare agenti idrofobici, aggiungere l'incapsulante direttamente alla soluzione polimerica, avendo cura di evitare le pareti del tubo e vorticare il tubo fino a quando l'incapsulante non risulti omogeneamente disperso.

Per agenti idrofili, emulsionare l'incapsulante con la soluzione polimerica. Aggiungere fino a 50 microlitri di farmaco in tampone sulla superficie della soluzione polimerica. Sottoporre la miscela a ultrasuoni su ghiaccio per circa 10 secondi o fino a quando la soluzione diventa opaca e omogenea.

Successivamente, agitare il tubo da provetta contenente vitamina E-T-P-G-S a velocità elevata mantenendo il tubo in posizione verticale. Tenere la pipetta di vetro ad una distanza di uno-due centimetri sopra l'estremità superiore del tubo in vortice e aggiungere lentamente la soluzione polimerica goccia a goccia sulla superficie del vortice. Prestare attenzione affinché la pipetta non tocchi le pareti del tubo dopo che l'intera soluzione polimerica è stata aggiunta.

Continuare a vorticare la soluzione. Formare ora un'emulsione per 15 secondi. Trasferire immediatamente il polimero emulsionato all'ultrasuonatore.

Mantenere il tubo da provetta immerso in acqua ghiacciata e sottoporre l'emulsione a sonificazione in tre impulsi di dieci secondi ciascuno. Muovere l'emulsione su e giù lungo la sonda per garantire una sonificazione uniforme ed evitare di far toccare la sonda alle pareti o al fondo del tubo da provetta. Fare una pausa di cinque-dieci secondi tra ogni sonificazione di dieci secondi per permettere alla soluzione di raffreddarsi prima di procedere.

Quindi aggiungere uno o due millilitri di vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% dalla soluzione in agitazione all'emulsione. Questo ridurrà la viscosità del polimero emulsionato, rendendolo più facile da versare; svuotare l'emulsione nella soluzione in agitazione. Lavare eventuali residui rimasti nel tubo di prova all'interno della soluzione in agitazione.

Lasciare indurire le nanoparticelle mescolando per tre ore. Se l'incapsulante è sensibile alla luce, avvolgere il becher in un foglio di alluminio e lasciare il recipiente aperto per favorire l'evaporazione del solvente. Per raccogliere le nanoparticelle, iniziare suddividendo il contenuto in due provette per centrifuga Oak Ridge da 30 millilitri di volume nominale, bilanciate tra loro entro 0,1 grammi. Centrifugare quindi le nanoparticelle in un rotore ad angolo fisso per 15 minuti a 17.000 ×g.

RC f. Tempi di centrifugazione più lunghi porteranno alla raccolta di una frazione maggiore di nanoparticelle più piccole. Eliminare il soprannatante avendo cura di non disturbare il pellet di nanoparticelle.

Aggiungere cinque millilitri di acqua distillata e utilizzare un bagno a ultrasuoni, un agitatore e un vortice per sospendere completamente le nanoparticelle. Unire il contenuto dei due tubi da centrifuga in uno solo e aggiungere 20 millilitri di acqua distillata per un volume totale di 30 millilitri. Ripetere quindi i passaggi di centrifugazione e lavaggio altre due volte, per un totale di tre lavaggi.

Il volume del fluido dell'ultima sospensione del pellet deve essere di quattro-cinque millilitri. Congelare un'aliquote piccola di nanoparticelle prive di telo per l'immagine al microscopio elettronico a scansione rispetto al resto. Aggiungere un rapporto ponderale da uno a due di TLO al polimero come crioprotettante per una sospensione di risospensione uniforme e completa di nanoparticelle PLGA.

Questo impedirà la formazione di cristalli di ghiaccio che potrebbero danneggiare la superficie delle particelle e indurre aggregazione. Trasferire le nanoparticelle in un tubo da centrifuga da cinque millilitri pre-pesato, quindi congelare a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Successivamente, togliere il tappo dal tubo e coprire l'apertura fissando un fazzoletto da laboratorio sulla sommità con un elastico.

Spostarsi rapidamente in modo che il contenuto non si sciolga, nel caso si verifichi uno scioglimento. Rigelare prima di posizionare nel liofilizzatore, quindi sottoporre a liofilizzazione il campione di cinque millilitri per 72 ore. Successivamente, sostituire il tappo e avvolgere il tubo per conservare le particelle liofilizzate a meno 80 gradi Celsius.

Nel giorno dell'acquisizione delle immagini, posizionare una striscia di nastro adesivo in carbonio bifacciale su un supporto per SEM. Etichettare la parte metallica del supporto con un pennarello indelebile per riferimenti successivi. Utilizzare una spatola metallica per raccogliere una piccola quantità di nanoparticelle liofilizzate e distribuirle delicatamente sulla superficie del nastro.

Spazzolare la superficie del supporto con un fazzoletto da laboratorio o utilizzare aria compressa per rimuovere le nanoparticelle libere. Visualizzare le particelle utilizzando una distanza di lavoro di cinque a 15 millimetri del fascio, un'intensità di cinque a 12 chilovolt e una dimensione del punto da uno a tre; intensità del fascio più elevate possono provocare un riscaldamento locale del campione, il che altererà la morfologia superficiale delle particelle. I microparticelle vengono osservate a un ingrandimento di 100 volte e le nanoparticelle saranno distinguibili a 3000 volte.

Ingrandire la parte superiore di una sfera per individuare le particelle facilmente visualizzabili al microscopio elettronico a scansione (SEM); acquisire almeno tre immagini per ogni lotto al fine di ottenere un campione rappresentativo della dimensione e della morfologia delle particelle. Utilizzando questo metodo, le particelle possono formarsi mediante un'unica emulsione, apparendo come sfere singole non fuse con una superficie liscia e un'ampia distribuzione di dimensioni nell'intero campione. Le microparticelle mostrate in questo caso hanno un diametro medio di 730 nanometri.

Qui sono mostrate nanoparticelle create da un singolo emulsionante che incapsulano il farmaco idrofobico campin. Queste particelle si sono rivelate ancora più piccole, con un diametro medio di 340 nanometri. Concentrazioni più elevate di emulsionante hanno prodotto particelle più piccole, con diametri medi che diminuiscono da 2000 a 200 nanometri.

Man mano che la concentrazione dell'emulsionante aumentava da 0,01 a 0,3%, come mostrato dalle immagini SEM riportate qui. Tuttavia, quando la concentrazione di vitamina E-T-P-G-S era troppo elevata, non si formavano particelle discrete: utilizzando l'1% di vitamina E-T-P-G-S, si osservavano fusioni intense e strutture simili a lamine presenti in tutta la struttura. È vero. Una volta appreso come fabbricare nanoparticelle di PLG mediante emulsionificazione, è possibile eseguire altri metodi, come la modifica della superficie, per progettare nanoparticelle in grado di interagire con specifici tipi cellulari o regioni del corpo.

Dopo aver visionato questo Video, dovresti avere una buona comprensione di come formare particelle con dimensioni riproducibili e regolabili mediante emulsionificazione.