PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di formare nanoparticelle polimeriche di dimensioni regolabili. Ciò si ottiene dissolvendo prima il polimero in un solvente organico e aggiungendo un farmaco o un incapsulante fluorescente. Il secondo passaggio consiste nell'emulsionare il polimero con una fase acquosa contenente l'agente emulsionante, quindi lasciare che le particelle si induriscano in un volume acquoso maggiore man mano che il solvente evapora.

Successivamente, le particelle vengono lavate, raccolte mediante centrifugazione e liofilizzate per la conservazione a lungo termine. Il passo finale consiste nel caratterizzare le dimensioni delle nanoparticelle e la morfologia della superficie con la microscopia elettronica a scansione o l'imaging SEM. In definitiva, il SEM viene utilizzato per dimostrare che la dimensione delle nanoparticelle può essere controllata variando la concentrazione dell'emulsionante.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di una varietà di malattie umane perché le particelle possono essere personalizzate per incapsulare e fornire un'ampia gamma di agenti terapeutici per un'azione prolungata. Nel tessuto bersaglio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.

Le fasi di emulsione sono difficili da imparare perché aspetti sottili di come si forma l'emulsione possono avere un impatto significativo sulle proprietà delle particelle. Per iniziare la preparazione delle nanoparticelle, posizionare circa 100 milligrammi di acido polilattico co glicolico, noto anche come PLGA, in una provetta di 13 x 100 millimetri. Quindi, utilizzando una pipetta sierologica di vetro, trasferire un millilitro di acetato di etile nel campione, coprire la parte superiore della provetta con il foglio di alluminio e quindi applicare saldamente la pellicola parafilmica al foglio.

Assicurarsi di avvolgere strettamente il param lungo il bordo superiore del flaconcino e il bordo inferiore della pellicola per evitare l'evaporazione del solvente. Segnare il livello del solvente sulla provetta e lasciare che il polimero si sciolga durante la notte. Il giorno successivo, aggiungere altro solvente in caso di evaporazione.

Preparare le seguenti apparecchiature e materiali in una cappa aspirante vicino agli ultrasuoni. Un vortice, due piccole pipette da pascolo in vetro con bulbi di gomma e una piastra di agitazione magnetica. Inoltre, posiziona un grande bicchiere pieno di acqua ghiacciata su un supporto sotto l'ultrasuono.

Quindi, aggiungere 45 millilitri di 0,3% in peso per volume, vitamina E-T-P-G-S a un altoparlante di vetro da 200 millilitri, quindi impostare la velocità di agitazione a 360 giri/min. Quindi aggiungere due millilitri dello 0,3% in peso per volume, vitamina E-T-P-G-S a una provetta di vetro da 13 x 100 millimetri. Per miscelare gli agenti idrofobici, aggiungere l'incapsulante direttamente alla soluzione polimerica, facendo attenzione a evitare le pareti della provetta e agitare la provetta fino a quando l'incapsulante non si disperde in modo omogeneo.

Per gli agenti idrofili, emulsionare l'incapsulante con la soluzione polimerica. Aggiungere fino a 50 microlitri di farmaco in tampone sulla superficie della soluzione polimerica. Ultrasuoni la miscela su ghiaccio per circa 10 secondi o fino a quando la soluzione non è opaca e omogenea.

Quindi, agitare la provetta contenente la vitamina E-T-P-G-S in alto tenendo la provetta in verticale. Tenere la pipetta di postura in vetro uno o due centimetri sopra la parte superiore del tubo vortex e aggiungere lentamente la soluzione polimerica goccia a goccia sulla superficie dell'ul vortex. Fare attenzione che la pipetta non tocchi i lati della provetta dopo che l'intera soluzione polimerica è stata aggiunta.

Continuate a far girare la soluzione nel vortex. Ora un'emulsione per 15 secondi. Trasferire immediatamente il polimero emulsionato all'atomizzatore ad ultrasuoni.

Tenere la provetta immersa in acqua ghiacciata e sonicare l'emulsione in tre raffiche di dieci secondi. Spostare l'emulsione su e giù per garantire una sonicazione uniforme ed evitare di toccare la sonda ai lati o sul fondo della provetta. Mettere in pausa da cinque a 10 secondi tra una sonicazione e l'altra per consentire alla soluzione di raffreddarsi prima di procedere.

Quindi aggiungere uno o due millilitri di vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% dalla soluzione di agitazione all'emulsione. Questo diluirà il polimero emulsionato, facilitando il versamento, svuoterà l'emulsione nella soluzione di agitazione. Lavare la soluzione rimanente dalla provetta nella soluzione di agitazione.

Lasciare indurire le nanoparticelle mescolando per tre ore. Se l'incapsulante è sensibile alla luce, avvolgere il becher in un foglio di alluminio e lasciare la parte superiore aperta per facilitare l'evaporazione del solvente per raccogliere le nanoparticelle, iniziare dividendo il cuore in nanoparticelle in due provette da centrifuga a cresta di quercia di 30 millilitri di volume nominale e bilanciarlo entro 0,1 grammi l'uno dall'altro. Quindi centrifugare le nanoparticelle in un rotore ad angolo fisso per 15 minuti a 17.000.

Tempi di centrifugazione più lunghi si tradurranno nella raccolta di una frazione maggiore di nanoparticelle più piccole. Scartare il surnatante facendo attenzione a non disturbare il pellet di nanoparticelle.

Aggiungere cinque millilitri di acqua distillata e utilizzare un bagnomaria, un ator e un vortice per sospendere completamente le nanoparticelle. Unire il contenuto delle due provette da centrifuga in una sola e aggiungere 20 millilitri di acqua distillata per un volume totale di 30 millilitri. Ripetere quindi le fasi di centrifugazione e lavaggio altre due volte per un totale di tre lavaggi.

Il volume del fluido dell'ultima sospensione di pellet Resus dovrebbe essere di quattro o cinque millilitri. Congelare una piccola aliquota di nanoparticelle libere telos per l'imaging SEM al resto. Aggiungere un rapporto in peso di uno a due TLO al polimero come crioprotettore per una sospensione uniforme e completa di nanoparticelle di PLGA.

In questo modo si eviterà la formazione di cristalli di ghiaccio che potrebbero danneggiare la superficie delle particelle e indurre l'aggregazione. Trasferire le nanoparticelle in una provetta da centrifuga da cinque millilitri pre-pesata, quindi congelare a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Quindi, aprire il tubo e coprire la parte superiore fissando il tessuto di laboratorio sulla parte superiore con un elastico.

Muoversi rapidamente in modo che il contenuto non si sciolga in caso di fusione. Ricongelare prima di metterlo nel liofilizzatore, deporre liofilizzare il campione da cinque millilitri per 72 ore. Quindi riposizionare il tappo e avvolgere il tubo con particelle liofilizzate a meno 80 gradi Celsius.

Il giorno dell'imaging, posizionare una striscia di nastro biadesivo di carbonio su un troncone SEM. Etichetta la parte metallica del mozzicone con un pennarello indelebile per riferimento futuro. Utilizzare una spatola metallica per raccogliere una piccola quantità di nanoparticelle liofilizzate e stenderle delicatamente sulla superficie del nastro.

Spazzolare la superficie del tronchetto con tessuto da laboratorio o utilizzare aria compressa per rimuovere le nanoparticelle sciolte. La visualizzazione delle particelle utilizzando una distanza di lavoro da cinque a 15 millimetri di fascio, un'intensità da cinque a 12 kilovolt e una dimensione dello spot da uno a tre gradi più elevati può provocare un riscaldamento regionale del campione, che altererà la morfologia superficiale delle particelle. Le microparticelle vengono osservate a un ingrandimento di 100 volte e le nanoparticelle saranno distinguibili a 3000 volte.

Ingrandimento Concentrarsi sulla parte superiore di una sfera per localizzare particelle che possono essere facilmente visualizzate con il SEM, raccogliere almeno tre immagini per lotto al fine di ottenere un campione rappresentativo della dimensione e della morfologia delle particelle. Utilizzando questo metodo, le particelle possono essere create da una singola emozione che appare come singole sfere non fuse con una morfologia superficiale liscia e un'ampia gamma di dimensioni distribuite in tutto il campione. Le microparticelle qui mostrate hanno un diametro medio di 730 nanometri.

Qui sono mostrate le nanoparticelle create da una singola emozione che incapsulano il farmaco idrofobico campin. Queste particelle sono diventate ancora più piccole con un diametro medio di 340 nanometri. Concentrazioni più elevate di emulsionante hanno prodotto particelle più piccole con diametri medi che decrescono da 2000 a 200 nanometri.

Poiché la concentrazione dell'emulsionante è aumentata da 0,01 a 0,3%, come mostrato dalle immagini SEM qui. Tuttavia, quando la concentrazione di vitamina E-T-P-G-S era troppo alta, non si formavano particelle discrete quando veniva utilizzata l'1% di vitamina E-T-P-G-S, si trovavano pesanti fusioni e strutture simili a fogli presenti in tutta la struttura. Vero. Una volta che hai imparato a fabbricare nanoparticelle di PLG mediante emulsione, altri metodi come la modifica della superficie possono essere eseguiti per ingegnerizzare nanoparticelle per l'interazione con specifici tipi di cellule o regioni del corpo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come formare particelle con dimensioni riproducibili e regolabili mediante emulsione.