Name: PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-12-27T14:15:00.000+00:00
Duration: 12 min 48 s
Description: Impara a produrre nanoparticelle di PLGA con dimensioni controllate da 220 nm a 1,98 µm utilizzando la vitamina E-TPGS come emulsionante. Questo metodo permette di personalizzare i sistemi di rilascio farmaceutico per applicazioni terapeutiche mirate.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori non hanno riconoscimenti.

1. Preparazione delle nanoparticelle
Tutte le fasi che coinvolgono solvente o polimero disciolto/emulsionato devono essere eseguite in una cappa chimica.
<ol>
	<li>Pesare 100 mg (+/- 5 mg) di acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) e metterlo in una provetta da 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Trasferire 1 ml di solvente (acetato di etile (EtAc) o diclorometano (DCM)) nel campione con una pipetta sierologica di vetro.</li>
	<li>Coprire la parte superiore del tubo con un piccolo pezzo di carta stagnola e applicare il parafilm in modo sicuro, assicurandosi di avvolgere strettamente il Parafilm lungo il bordo superiore della fiala e il bordo inferiore della pellicola.</li>
	<li>Segnare il livello del solvente all'esterno della provetta. Lasciare sciogliere il polimero durante la notte, aggiungendo ulteriore solvente il giorno successivo se si verifica l'evaporazione. 
	Nota: il polimero può anche essere sciolto il giorno della preparazione delle nanoparticelle, se necessario. Seguire i passaggi 1.1-1.3, quindi vorticare in alto fino a quando tutto il polimero non è completamente disciolto (~10 min).</li>
	<li>Preparare un'area di lavoro nella cappa aspirante con le seguenti attrezzature/materiali accanto all'ultrasuonatore: un vortice, due piccole pipette Pasteur in vetro con bulbi di gomma e una piastra di agitazione magnetica. Posiziona un grande bicchiere pieno di acqua ghiacciata su un supporto sotto l'ultrasuonatore.</li>
	<li>Aggiungere 45 ml di vitamina E-TPGS allo 0,3% p/v in un becher di vetro da 200 ml con ancoretta magnetica e impostare la velocità di agitazione a 360 giri/min.</li>
	<li>Aggiungere 2 ml di vitamina E-TPGS allo 0,3% p/v in una provetta di vetro da 13 mm x 100 mm.</li>
	<li>Aggiungi farmaco: 
	Per gli agenti idrofobici: aggiungere l'incapsulante direttamente alla soluzione polimerica (facendo attenzione a evitare le pareti della provetta) e agitare la provetta fino a quando l'incapsulante non si disperde in modo omogeneo. 
	Per gli agenti idrofili: emulsionare l'incapsulante con la soluzione polimerica prima di procedere. Aggiungere fino a 50 μl di farmaco in acqua o tampone sulla superficie della soluzione polimerica. Ultrasuoni brevemente per emulsionare il farmaco con il polimero (in genere 10 secondi, o se necessario per ottenere una soluzione omogenea e opaca). Questa fase di sonicazione deve essere eseguita sul ghiaccio.</li>
	<li>Posizionare il polimero/incapsulante a tubo aperto vicino al vortexer. Tenendo la provetta contenente la vitamina E-TPGS verticalmente e su un vortice elevato, utilizzare una pipetta di vetro Pasteur per aggiungere il polimero/soluzione incapsulante goccia a goccia. Fare attenzione a evitare i lati del tubo e far cadere la soluzione polimerica direttamente sulla superficie dell'emulsionante vortex. Dopo che l'intero 1 ml di soluzione polimerica è stato aggiunto alla vitamina E-TPGS, continuare a far vorticare la soluzione (ora un'emulsione) per altri 15 secondi.</li>
	<li>Trasferire immediatamente il polimero emulsionato nell'ultrasuonatore. Tenere la provetta immersa in acqua ghiacciata e sonicare l'emulsione in tre raffiche di 10 secondi (ampiezza del 40% per un sonicatore da 700 W, dimensione della punta della sonda da 1/8 di pollice). Muovere l'emulsione su e giù per la sonda per garantire una sonicazione uniforme, facendo attenzione a non toccare la sonda con i lati o il fondo della provetta. Fate una pausa tra una sonicazione e l'altra di dieci secondi per consentire alla soluzione di raffreddarsi prima di procedere.</li>
	<li>Aggiungere 1-2 ml di vitamina E-TPGS allo 0,3% dalla soluzione di agitazione all'emulsione con una pipetta di vetro Pasteur, che diluisce il polimero emulsionato in modo che si versi più facilmente. Svuotare l'emulsione nella soluzione di agitazione. Ripetere questo passaggio per eliminare la soluzione rimanente dalla provetta nella soluzione di agitazione.</li>
	<li>Lasciare indurire le nanoparticelle mescolando per tre ore. Se l'incapsulante è sensibile alla luce, il becher può essere avvolto in un foglio di alluminio, lasciando la parte superiore aperta per facilitare l'evaporazione del solvente.</li>
</ol>
2. Raccolta di nanoparticelle
<ol>
	<li>Dividere le nanoparticelle indurite in due provette da centrifuga Oak Ridge (30 ml di volume nominale) e bilanciarle con una precisione di 0,1 g.</li>
	<li>Centrifugare le nanoparticelle in un rotore ad angolo fisso per 15 minuti a 17.000 x g. Tempi di centrifugazione più lunghi comporteranno la raccolta di una frazione maggiore di nanoparticelle più piccole.</li>
	<li>Scartare il surnatante, facendo attenzione a non disturbare il pellet di nanoparticelle (l'acqua può essere versata o pipettata). Aggiungere 15 ml di diH2O e utilizzare un sonicatore e/o un vortice a bagno d'acqua per risospendere completamente le nanoparticelle.</li>
	<li>Unire il contenuto delle due provette da centrifuga in una sola e ripetere i passaggi 2.1-2.3 2 volte di più, per un totale di tre lavaggi in 30 ml di diH2O ogni volta. Il volume del fluido dell'ultima risospensione in pellet deve essere di 4-5 ml. 
	A questo punto può essere aggiunto un rapporto in peso di 1:2 trealosio:polimero come crioprotettore (congelare una piccola aliquota di nanoparticelle senza trealosio per l'imaging SEM). I cristalli di ghiaccio che si formano durante il processo di congelamento possono danneggiare la superficie delle particelle e indurre aggregazione, e l'inclusione di trealosio ha dimostrato di migliorare la risospensione uniforme e completa delle nanoparticelle di PLGA13.</li>
	<li>Trasferire le nanoparticelle in una provetta da centrifuga da 5 ml prepesata e congelare a -80 °C per almeno 30 minuti.</li>
	<li>Muovendosi rapidamente per non far sciogliere il contenuto congelato, stappare il tubo e coprire la parte superiore fissando il tessuto di laboratorio sulla parte superiore con un elastico. **In caso di scioglimento, ricongelare prima di metterlo nel liofilizzatore.</li>
	<li>Liofilizzare 72 ore per un volume di 5 ml. Conservare le particelle liofilizzate in una provetta avvolta in Parafilm a -80 °C.</li>
</ol>
3. Dimensionamento e morfologia della superficie
Microscopia Elettronica a Scansione
<ol>
	<li>I campioni per il SEM devono essere preparati il giorno dell'imaging. Posiziona una striscia di nastro biadesivo di carbonio su un tronchetto SEM. Il pennarello indelebile può essere utilizzato per etichettare la parte metallica del mozzicone per riferimento futuro.</li>
	<li>Utilizzare una spatola metallica per raccogliere una piccola quantità di nanoparticelle liofilizzate e stenderle delicatamente sulla superficie del nastro. Spazzolare la superficie del tronchetto con un fazzoletto di carta da laboratorio o utilizzare aria compressa per rimuovere le nanoparticelle sciolte.</li>
	<li>Ricoprire il campione con gold-paladium per 30-120 secondi. Un tempo di sputtering più lungo produrrà una superficie più liscia per l'imaging, anche se ciò può comportare la perdita di dettagli superficiali fini.</li>
	<li>I parametri tipici per la visualizzazione delle particelle sono una distanza di lavoro di 5-15 mm, un'intensità del fascio di 5-12 kV e una dimensione dello spot di 1-3. Intensità del fascio più elevate possono provocare un riscaldamento regionale del campione, che altererà la morfologia superficiale delle particelle. Le microparticelle sono osservate a un ingrandimento di 100X e le nanoparticelle saranno distinguibili a un ingrandimento di 3.000X.</li>
	<li>Il campione ideale sarà costituito da un rivestimento uniforme di particelle sulla superficie piana del troncone. Occasionalmente, strutture secondarie (tra cui scaglie o sfere) possono derivare dalla liofilizzazione. Concentrarsi sul bordo di un fiocco, dove il fiocco incontra il nastro, o sulla parte superiore di una sfera aiuterà a localizzare le particelle che possono essere facilmente visualizzate con il SEM. Raccogli almeno tre immagini per lotto al fine di ottenere un campione rappresentativo della dimensione e della morfologia delle particelle.</li>
</ol>

<ol><li>Peer, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanocarriers+as+an+emerging+platform+for+cancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanocarriers as an emerging platform for cancer therapy.</a> Nat. Nanotechnol. 2, 751-760 (2007).</li>
<li>Jiang, W., Gupta, R. K., Deshpande, M. C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+poly%28lactic-co-glycolic+acid%29+microparticles+for+injectable+delivery+of+vaccine+antigens%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradable poly(lactic-co-glycolic acid) microparticles for injectable delivery of vaccine antigens.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 57, 391-410 (2005).</li>
<li>Haag, R., Kratz, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+therapeutics%3A+Concepts+and+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem%22%5BJournal%5D)">Polymer therapeutics: Concepts and applications.</a> Angew. Chem. 45, 1198-1215 (2006).</li>
<li>Tong, R., Cheng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Anticancer+polymeric+nanomedicines%5BTitle%5D)+AND+%22Polym.+Rev%22%5BJournal%5D)">Anticancer polymeric nanomedicines.</a> Polym. Rev. 47, 345-381 (2007).</li>
<li>Kumari, A., Yadav, S. K., Yadav, S. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+polymeric+nanoparticles+based+drug+delivery+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Colloids+and+Surf.+B+Biointerfaces%22%5BJournal%5D)">Biodegradable polymeric nanoparticles based drug delivery systems.</a> Colloids and Surf. B Biointerfaces. 75, 1-18 (2010).</li>
<li>Anderson, J. M., Shive, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradation+and+biocompatibility+of+PLA+and+PLGA+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Deliv.+Rev%22%5BJournal%5D)">Biodegradation and biocompatibility of PLA and PLGA microspheres.</a> Adv. Drug Deliv. Rev. 28, 5-24 (1997).</li>
<li>Jain, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+manufacturing+techniques+of+various+drug+loaded+biodegradable+poly%28lactide-co-glycolide%29+%28PLGA%29+devices%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The manufacturing techniques of various drug loaded biodegradable poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) devices.</a> Biomaterials. 21, 2475-2490 (2000).</li>
<li>Danhier, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA-based+nanoparticles%3A+An+overview+of+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">PLGA-based nanoparticles: An overview of biomedical applications.</a> J. Control. Rel. 161, 505-522 (2012).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+novel+controlled+release+formulation+for+the+anticancer+drug+paclitaxel+%28Taxol%29%3A+PLGA+nanoparticles+containing+vitamin+E+TPGS.%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">A novel controlled release formulation for the anticancer drug paclitaxel (Taxol): PLGA nanoparticles containing vitamin E TPGS.</a> J. Control. Rel. 86, 33-48 (2003).</li>
<li>Mu, L., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PLGA%2FTPGS+nanoparticles+for+controlled+release+of+paclitaxel%3A+effects+of+the+emulsifier+and+drug+loading+ratio%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">PLGA/TPGS nanoparticles for controlled release of paclitaxel: effects of the emulsifier and drug loading ratio.</a> Pharm. Res. 20, 1864-1872 (2003).</li>
<li>Collnot, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vitamin+E+TPGS+P-glycoprotein+inhibition+mechanism%3A+influence+on+conformational+flexibility%2C+intracellular+ATP+levels%2C+and+role+of+time+and+site+of+access%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Vitamin E TPGS P-glycoprotein inhibition mechanism: influence on conformational flexibility, intracellular ATP levels, and role of time and site of access.</a> Mol. Pharm. 7, 642-651 (2010).</li>
<li>Dintaman, J. M., Silverman, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+P-glycoprotein+by+D-alpha-tocopheryl+polyethylene+glycol+1000+succinate+%28TPGS%29%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Inhibition of P-glycoprotein by D-alpha-tocopheryl polyethylene glycol 1000 succinate (TPGS).</a> Pharm. Res. 16, 1550-1556 (1999).</li>
<li>Zhou, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly-penetrative%2C+drug-loaded+nanocarriers+improve+treatment+of+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A.%22%5BJournal%5D)">Highly-penetrative, drug-loaded nanocarriers improve treatment of glioblastoma.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.. , (2013).</li>
<li>Cartiera, M. S., Johnson, K. M., Rajendran, V., Caplan, M. J., Saltzman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+uptake+and+intracellular+fate+of+PLGA+nanoparticles+in+epithelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The uptake and intracellular fate of PLGA nanoparticles in epithelial cells.</a> Biomaterials. 30, 2790-2798 (2009).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Nohara, M., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biodegradable+submicron+carriers+for+peptide+drugs%3A+Preparation+of+dl-lactide%2Fglycolide+copolymer+%28PLGA%29+nanospheres+with+nafarelin+acetate+by+a+novel+emulsion-phase+separation+method+in+an+oil+system%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Biodegradable submicron carriers for peptide drugs: Preparation of dl-lactide/glycolide copolymer (PLGA) nanospheres with nafarelin acetate by a novel emulsion-phase separation method in an oil system.</a> Int. J. Pharm. 121, 45-54 (1995).</li>
<li>Ameller, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polyester-poly%28ethylene+glycol%29+nanoparticles+loaded+with+the+pure+antiestrogen+RU+58668%3A+physicochemical+and+opsonization+properties%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Polyester-poly(ethylene glycol) nanoparticles loaded with the pure antiestrogen RU 58668: physicochemical and opsonization properties.</a> Pharm. Res. 20, 1063-1070 (2003).</li>
<li>Wischke, C., Schwendeman, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Principles+of+encapsulating+hydrophobic+drugs+in+PLA%2FPLGA+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Principles of encapsulating hydrophobic drugs in PLA/PLGA microparticles.</a> Int. J. Pharm. 364, 298-327 (2008).</li>
<li>Batycky, R. P., Hanes, J., Langer, R., Edwards, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+theoretical+model+of+erosion+and+macromolecular+drug+release+from+biodegrading+microspheres%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Pharm.+Sci%22%5BJournal%5D)">A theoretical model of erosion and macromolecular drug release from biodegrading microspheres.</a> J. Pharm. Sci. 86, 1464-1477 (1997).</li>
<li>Panyam, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymer+degradation+and+in+vitro+release+of+a+model+protein+from+poly%28D%2CL-lactide-co-glycolide%29+nano-+and+microparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Polymer degradation and in vitro release of a model protein from poly(D,L-lactide-co-glycolide) nano- and microparticles.</a> J. Control. Rel. 92, 173-187 (2003).</li>
<li>Siepmann, J., Faisant, N., Akiki, J., Richard, J., Benoit, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+the+size+of+biodegradable+microparticles+on+drug+release%3A+Experiment+and+theory%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Controlled+Release%22%5BJournal%5D)">Effect of the size of biodegradable microparticles on drug release: Experiment and theory.</a> Journal of Controlled Release. 96, 123-134 (2004).</li>
<li>Desai, M. P., Labhasetwar, V., Walter, E., Levy, R. J., Amidon, G. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+mechanism+of+uptake+of+biodegradable+microparticles+in+Caco-2+cells+is+size+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">The mechanism of uptake of biodegradable microparticles in Caco-2 cells is size dependent.</a> Pharm. Res. 14, 1568-1573 (1997).</li>
<li>Alexis, F., Pridgen, E., Molnar, L. K., Farokhzad, O. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+clearance+and+biodistribution+of+polymeric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the clearance and biodistribution of polymeric nanoparticles.</a> Mol. Pharm. 5, 505-515 (2008).</li>
<li>Barichello, J. M., Morishita, M., Takayama, K., Nagai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Encapsulation+of+hydrophilic+and+lipophilic+drugs+in+PLGA+nanoparticles+by+the+nanoprecipitation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Dev.+Ind.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Encapsulation of hydrophilic and lipophilic drugs in PLGA nanoparticles by the nanoprecipitation method.</a> Drug Dev. Ind. Pharm. 25, 471-476 (1999).</li>
<li>Mundargi, R. C., Babu, V. R., Rangaswamy, V., Patel, P., Aminabhavi, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano%2Fmicro+technologies+for+delivering+macromolecular+therapeutics+using+poly%28d%2Cl-lactide-co-glycolide%29+and+its+derivatives%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Nano/micro technologies for delivering macromolecular therapeutics using poly(d,l-lactide-co-glycolide) and its derivatives.</a> J. Control. Rel. 125, 193-209 (2008).</li>
<li>Niwa, T., Takeuchi, H., Hino, T., Kunou, N., Kawashima, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparations+of+biodegradable+nanospheres+of+water-soluble+and+insoluble+drugs+with+D%2CL-lactide%2Fglycolide+copolymer+by+a+novel+spontaneous+emulsification+solvent+diffusion+method%2C+and+the+drug+release+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Preparations of biodegradable nanospheres of water-soluble and insoluble drugs with D,L-lactide/glycolide copolymer by a novel spontaneous emulsification solvent diffusion method, and the drug release behavior.</a> J. Control. Rel. 25, 89-98 (1993).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chia, H. H., Chung, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+preparation+temperature+on+the+characteristics+and+release+profiles+of+PLGA+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Control.+Rel%22%5BJournal%5D)">Effect of preparation temperature on the characteristics and release profiles of PLGA microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> J. Control. Rel. 69, 81-96 (2000).</li>
<li>Yang, Y. Y., Chung, T. S., Ping Ng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Morphology%2C+drug+distribution%2C+and+in+vitro+release+profiles+of+biodegradable+polymeric+microspheres+containing+protein+fabricated+by+double-emulsion+solvent+extraction%2Fevaporation+method%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Morphology, drug distribution, and in vitro release profiles of biodegradable polymeric microspheres containing protein fabricated by double-emulsion solvent extraction/evaporation method.</a> Biomaterials. 22, 231-241 (2001).</li>
<li>Zhang, Z., Feng, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+drug+encapsulation+efficiency%2C+in+vitro+drug+release%2C+cellular+uptake+and+cytotoxicity+of+paclitaxel-loaded+poly%28lactide%29-tocopheryl+polyethylene+glycol+succinate+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The drug encapsulation efficiency, in vitro drug release, cellular uptake and cytotoxicity of paclitaxel-loaded poly(lactide)-tocopheryl polyethylene glycol succinate nanoparticles.</a> Biomaterials. 27, 4025-4033 (2006).</li>
<li>Astete, C. E., Sabliov, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+characterization+of+PLGA+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biomater.+Sci.+Polym.+Ed%22%5BJournal%5D)">Synthesis and characterization of PLGA nanoparticles.</a> J. Biomater. Sci. Polym. Ed. 17, 247-289 (2006).</li>
<li>Gaumet, M., Gurny, R., Delie, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fluorescent+biodegradable+PLGA+particles+with+narrow+size+distributions%3A+Preparation+by+means+of+selective+centrifugation%5BTitle%5D)+AND+%22Int.+J.+Pharm%22%5BJournal%5D)">Fluorescent biodegradable PLGA particles with narrow size distributions: Preparation by means of selective centrifugation.</a> Int. J. Pharm. 342, 222-230 (2007).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Le particelle di PLGA sono comunemente preparate mediante emulsione singola o doppia, un metodo che offre la possibilità di personalizzare le caratteristiche delle particelle come dimensioni, incapsulante e proprietà superficiali7. Queste e altre proprietà dipendono da molte variabili, tra cui il tipo di solvente, i rapporti di alimentazione, il metodo di emulsione e il tipo di emulsionante. Tuttavia, nella nostra esperienza, è possibile per un singolo sperimentatore produrre particelle con proprietà coerenti. Utilizzando lo stesso protocollo, uno sperimentatore ben addestrato ha prodotto sette lotti separati di nanoparticelle con i seguenti diametri medi: 317 nm±99, 342 nm±112, 298 nm±104, 361 nm±110, 339 nm±115, 360 nm±123 e 364 nm±110. La media dei lotti dello sperimentatore ben addestrato produce un diametro medio di 340 nm±25 e una deviazione standard media all'interno del lotto di 110 nm±8. Un secondo sperimentatore, addestrato dal primo, ha utilizzato lo stesso protocollo per produrre nanoparticelle con un diametro medio di 328 nm±138. Tuttavia, un terzo sperimentatore, che aveva prodotto nanoparticelle in modo indipendente per diversi mesi, ha seguito lo stesso protocollo per produrre nanoparticelle con un diametro medio di 220 nm±70. Pertanto, è possibile creare particelle con una gamma prevista di diametri, ma ciò dipende dall'esatta replicazione della tecnica sperimentale sottile. Il raggruppamento dei lotti può consentire la produzione di grandi quantità di nanoparticelle con proprietà aggregate identiche. Ad esempio, quando modifichiamo la superficie delle nanoparticelle per lo studio in vitro o in vivo , più lotti (fino a 6) da 200 mg vengono preparati, lavati, raccolti, miscelati in un'unica provetta e quindi divisi per la modifica della superficie. Ciò garantisce che le dimensioni delle nanoparticelle, il carico del farmaco, la carica e la frazione dei siti di superficie disponibili per la modifica saranno comparabili tra i due gruppi di trattamento. In un altro esempio, se la variabile di interesse è l'efficacia dei farmaci con agenti diversi caricati in diversi lotti di nanoparticelle, è importante misurare e controllare la variabilità nel carico dei farmaci. È fondamentale misurare le proprietà delle particelle per ogni lotto di particelle prodotte e progettare e replicare gli esperimenti per controllare la variabilità da lotto a lotto.
L'emulsione completa delle fasi organica e acquosa è fondamentale per la formazione di piccole particelle. Il poli(alcol vinilico) (PVA) è forse l'emulsionante più comunemente usato. Noi e altri abbiamo utilizzato una varietà di agenti emulsionanti e stabilizzanti, tra cui la vitamina E-TPGS9, PVA14, spans15 e polossameri16 (per una discussione approfondita dell'ampia gamma di agenti utilizzati per la produzione di particelle PLGA, vedere la recensione di Wischke et al.17). Il polimero correttamente emulsionato apparirà come una soluzione omogenea, bianco latte/opaca. Un'emulsione povera (o "rotta") mostrerà eterogeneità o granularità macroscopica e potrebbe persino separarsi in due strati visivamente distinti nel tubo. Questo generalmente indica un fallimento nella formazione di nanoparticelle. L'emulsione può rompersi dopo il passaggio 1.9 se non viene trasferita immediatamente all'ultrasuonatore. In tal caso, agitare nuovamente fino a ottenere un composto omogeneo e procedere immediatamente al sonicatore. La separazione non deve avvenire dopo la fase di sonicazione (1.10). Una volta che le particelle sono state disperse in un volume acquoso più grande (passaggio 1.11), la soluzione deve essere uniformemente opaca o leggermente traslucida. La qualità traslucida aumenterà al diminuire delle dimensioni delle particelle e si può osservare una tonalità blu per nanoparticelle molto piccole. Questa tonalità potrebbe non essere osservata se le particelle incapsulano un farmaco. Se l'emulsione non riesce a disperdersi uniformemente nel grande volume acquoso o appare granulare, l'esperimento non deve procedere. È normale osservare alcune variazioni nell'aspetto del pellet di particelle, così come nella sua coesione. Alcuni pellet possono riuscire a risospendere dopo un leggero vortice, mentre altri possono richiedere diversi minuti di sonicazione a bagno d'acqua. La risospensione non dovrebbe durare più di 5 minuti. Le particelle liofilizzate possono assumere una varietà di trame, da quelle cotonose a quelle a flusso libero.
Uno dei numerosi vantaggi del PLGA come materiale a nanoparticelle è la capacità di ottimizzare il processo di fabbricazione per creare la dimensione desiderata della particella per l'applicazione prevista. Le nanoparticelle più grandi incapsulano una frazione più elevata di farmaco idrofobico (rispetto al peso del polimero) rispetto alle nanoparticelle piccole, tuttavia, anche la cinetica di rilascio del farmaco può essere influenzata18-20. La dimensione delle nanoparticelle ha un effetto diretto sui meccanismi di internalizzazione delle particelle da parte delle cellule, così come la loro distribuzione nei tessuti, che può portare a differenze drammatiche nell'efficacia della consegna. Ad esempio, il sistema dei fagociti mononucleati etichetterà e rimuoverà gli agenti nella circolazione sistemica che sono più grandi di 1 μm. Piccole nanoparticelle possono essere interessanti per l'infusione diretta nel cervello, dove le nanoparticelle più grandi sarebbero intrappolate nella stretta matrice extracellulare; La somministrazione di piccole nanoparticelle potrebbe anche facilitare il targeting passivo dei tumori attraverso l'effetto di permeazione e ritenzione potenziato. L'efficienza di incapsulamento del farmaco varia notevolmente, a seconda delle proprietà del farmaco specifico, delle dimensioni della particella e dell'emulsionante (cioè la sua solubilità in acqua rispetto al solvente). L'emulsione singola contro doppia influenzerà anche il carico del farmaco e la dimensione delle nanoparticelle. L'incapsulamento di agenti idrofobici tramite singola emulsione può aiutare nella produzione di nanoparticelle ultra-piccole, rispetto al metodo della doppia emulsione. Indirizziamo il lettore ad altre risorse per un'ampia discussione su questo argomento23-28. Infine, sono disponibili metodi di emulsione alternativi, tra cui l'omogeneizzazione ad alta velocità, e questi altri approcci possono fornire vantaggi per tipi specifici di farmaci o applicazioni di somministrazione di farmaci29.
Il metodo a emulsione singola presenta l'opportunità di variare un'ampia gamma di variabili di formulazione, ognuna delle quali è in grado di alterare le proprietà delle nanoparticelle. Ad esempio, l'utilizzo del diclorometano (DCM) come solvente produrrà generalmente nanoparticelle più grandi con una distribuzione dimensionale più ampia. Poiché l'acetato di etile (EtAc) è miscibile in acqua, la tensione superficiale della gocciolina di polimero nell'emulsione primaria è diminuita, producendo nanoparticelle più piccole. Il DCM può essere sostituito con lo stesso volume di EtAc. Solventi alternativi o miscele di solventi possono essere utilizzati per ottimizzare l'incapsulamento del farmaco e le proprietà delle particelle. Anche altri parametri di formulazione sono in grado di alterare la dimensione delle particelle: ad esempio, l'aumento del volume del solvente, del rapporto solvente/polimero, dell'intensità della sonicazione o della velocità/durata della centrifugazione si tradurrà in una diminuzione delle dimensioni delle particelle raccolte. È possibile dimensionare le particelle frazionate eseguendo la centrifugazione sequenziale (ad esempio una centrifugazione rapida a bassa velocità per rimuovere prima le particelle più grandi, seguita da una centrifuga più lunga per raccogliere le particelle ultra-piccole) o filtrando.
Qui, descriviamo i parametri di formulazione che consentono la preparazione di particelle di PLGA con diametri medi compresi tra 220 nm e 1,98 μm. Questi metodi per la produzione di particelle composte da PLGA possono essere utilizzati per ottimizzare la progettazione delle particelle (dimensioni, incapsulante e proprietà di superficie) per future applicazioni di somministrazione di farmaci in vitro o in vivo.

I polimeri sono diventati veicoli di somministrazione di farmaci sempre più popolari negli ultimi decenni per applicazioni che vanno dalla terapia mirata dei tumori1 alla modulazione del sistema immunitario2. I farmaci incapsulati o coniugati con polimero sono spesso più efficaci delle loro controparti liberamente, poiché il farmaco associato al polimero è protetto dalla degradazione. Questa protezione si traduce in un'emivita biologica più lunga e in un'efficacia potenzialmente migliorata con effetti collaterali sistemici ridotti3-5.
L'acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) mostra molte delle proprietà ideali di un sistema di somministrazione su scala nanometrica, fornendo il rilascio a lungo termine dell'agente incapsulato e degradandosi nei prodotti biocompatibili dell'acido lattico e glicolico. Piccole molecole, proteine e acidi nucleici incapsulati nel PLGA hanno dimostrato una maggiore attività in una varietà di applicazioni di malattie8. È importante sottolineare che la piattaforma dei materiali facilita la personalizzazione di funzioni come le dimensioni, la carica e la visualizzazione della superficie dei ligandi per indirizzare le particelle a tessuti specifici o per scopi di imaging. Poiché il PLGA è già utilizzato nell'uomo sotto forma di suture biodegradabili (ad es. Purasorb, Purac Biomaterials e Vicryl, Ethicon Inc.), il potenziale per la traduzione clinica è elevato.
L'emulsione olio-acqua (singola) o acqua-olio-acqua (doppia) è un metodo con cui il PLGA può essere utilizzato per incapsulare farmaci idrofobici e idrofili in forma micro o nanometrica. In breve, il PLGA viene disciolto in una fase organica (olio) che viene emulsionata con un tensioattivo o stabilizzante (acqua). I farmaci idrofobici vengono aggiunti direttamente alla fase oleosa, mentre i farmaci idrofili (acqua) possono essere prima emulsionati con la soluzione polimerica prima della formazione di particelle. Le raffiche di sonicazione ad alta intensità facilitano la formazione di piccole goccioline di polimero. L'emulsione risultante viene aggiunta a una fase acquosa più grande e agitata per diverse ore, il che consente al solvente di evaporare. Le nanoparticelle indurite vengono raccolte e lavate mediante centrifugazione (Figura 1).
Qui, descriviamo una tecnica per produrre nanoparticelle di PLGA utilizzando un'emulsione singola e doppia, con acetato di etile (EtAc) come solvente e vitamina E-D-α-Tocoferolo polietilenglicole succinato (TPGS) come agente emulsionante. L'uso della vitamina E-TPGS offre diversi possibili vantaggi rispetto ad altri tipi di agenti stabilizzanti (ad es. poli(alcol vinilico), PVA), tra cui una migliore efficienza di emulsione e incapsulamento. Altri gruppi hanno riportato vantaggi della vitamina E-TPGS, tra cui l'inibizione della P-gp, una proteina di efflusso transmembrana, che è comunemente sovraespressa sulle cellule tumorali e nota per contribuire alla resistenza ai farmaci trasportando i farmaci fuori dalle cellule bersaglio. Inoltre, dimostriamo come caratterizzare e dimensionare le particelle utilizzando la microscopia elettronica a scansione (SEM) e forniamo ulteriori indicazioni sulla modifica delle dimensioni tramite l'alterazione del protocollo.

<table><tbody><tr><td>Acido polilattico-co-glicolico (PLGA)&amp;nbsp;</td><td><a href="http://www.absorbables.com" target="_blank"><img src="/img/new_window.png"> Lactel</a></td><td>B6010-2P</td><td>Viscosità intrinseca: 0,55-0,75 dl/g</td></tr><tr><td>Acetato di etile (EtAc)</td><td>Sigma</td><td>270989</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di metilene (DCM)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vitamina E TPGS</td><td>Sigma</td><td>57668</td><td></td></tr><tr><td>Alcool polivinilico</td><td></td><td></td><td>Idrolizzato all'87-89%, 30.000-70.000 Da</td></tr><tr><td>Attrezzatura</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dismembratore sonico</td><td>Fisher Scientific</td><td>Modello 705</td><td>700 W (Ultrasonificatore)</td></tr><tr><td>Punta dell'ultrasonico</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td>1/8 in</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR</td><td>58816-121</td><td></td></tr><tr><td>Agitatore multiposizione</td><td>Corning</td><td>MP5I</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga</td><td>Beckman-Coulter</td><td>L8-80M</td><td></td></tr><tr><td>Rotore ad angolo fisso</td><td>Beckman-Coulter</td><td>50.2TI</td><td></td></tr><tr><td>Bagnomaria ad ultrasuoni</td><td>Fisher Scientific</td><td>FS30</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Millrock</td><td>BT85</td><td></td></tr></tbody></table>

plga nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con vitamina e-tpgs

PLGA Nanoparticles Formed by Single- or Double-emulsion with Vitamin E-TPGS

L'acido poli(lattico-co-glicolico) (PLGA) è un membro biocompatibile della famiglia dei polimeri biodegradabili in poliestere alifatico. Il PLGA è stato a lungo una scelta popolare per le applicazioni di somministrazione di farmaci, in particolare perché è già approvato dalla FDA per l'uso nell'uomo sotto forma di suture riassorbibili. I farmaci idrofobici e idrofili sono incapsulati in particelle di PLGA tramite singola o doppia emulsione. In breve, il farmaco viene sciolto con polimero o emulsionato con polimero in una fase organica che viene poi emulsionata con la fase acquosa. Dopo che il solvente è evaporato, le particelle vengono lavate e raccolte tramite centrifugazione per la liofilizzazione e la conservazione a lungo termine. Il PLGA si degrada lentamente attraverso l'idrolisi in ambienti acquosi e gli agenti incapsulati vengono rilasciati in un periodo che va da settimane a mesi. Sebbene il PLGA sia un materiale che possiede molti vantaggi per la somministrazione di farmaci, la formazione riproducibile di nanoparticelle può essere impegnativa; La notevole variabilità è introdotta dall'uso di diverse apparecchiature, lotti di reagenti e un metodo preciso di emulsione. Qui, descriviamo in dettaglio la formazione e la caratterizzazione di microparticelle e nanoparticelle formate da emulsione singola o doppia utilizzando l'agente emulsionante vitamina E-TPGS. La morfologia e le dimensioni delle particelle sono determinate con la microscopia elettronica a scansione (SEM). Forniamo immagini SEM rappresentative per nanoparticelle prodotte con concentrazioni variabili di emulsionante, nonché esempi di artefatti di imaging ed emulsioni fallite. Questo protocollo può essere facilmente adattato per utilizzare emulsionanti alternativi (ad es. poli(alcol vinilico), PVA) o solventi (ad es. diclorometano, DCM).

In Figure 2a e 2b sono mostrate immagini rappresentative al microscopio elettronico a scansione (SEM) di microparticelle e nanoparticelle di PLGA preparate utilizzando questo protocollo. Le particelle appariranno come sfere singole e non fuse, con una morfologia superficiale liscia e una vasta gamma di dimensioni distribuita in tutto il campione.
Per determinare il diametro medio di ogni lotto, vengono effettuate misurazioni direttamente sulle immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) utilizzando la funzione "measure" di ImageJ. Dovrebbero essere eseguite almeno 150 misurazioni del diametro di particelle selezionate casualmente dal campo visivo per ottenere una distribuzione dimensionale rappresentativa. La dimensione media di un lotto di particelle dipende dai parametri di formulazione. Ad esempio, in Figura 2a, sono state ottenute microparticelle (diametro medio di 730 nm±370) con 1 ml di solvente e 100 mg di PLGA, utilizzando lo 0,05% di Vitamina E-TPGS nella fase emulsionante, mentre in Figura 2b sono state ottenute nanoparticelle (diametro medio di 340 nm±70) con 4 ml di solvente e 200 mg di PLGA, incapsulando il farmaco idrofobico camptotecina e utilizzando lo 0,3% di Vitamina E-TPGS nella fase emulsionante (i parametri completi di formulazione sono descritti nella didascalia della figura). In generale, una concentrazione maggiore di emulsionante produce particelle più piccole, con diametri medi compresi tra 220 e 2.000 nm ottenibili variando la concentrazione dell'emulsionante dallo 0,3% allo 0,01% (Figura 3).
I nostri rendimenti variano dal 74% al 98% (22 lotti di nanoparticelle con diversi solventi, emulsionanti e condizioni di emulsionamento, preparati da un singolo sperimentatore). Rendimenti migliori possono essere osservati per lotti più grandi (&gt;150 nm), poiché le nanoparticelle di piccole dimensioni vanno facilmente perse durante la centrifugazione e il lavaggio, in particolare quando il soprannatante viene versato via dal pellet. Un'accurata pipettaggio del liquido può aiutare a evitare questo problema. Velocità più elevate e/o tempi di centrifugazione più lunghi possono inoltre migliorare il rendimento sia migliorando il recupero della frazione ultrafine di nanoparticelle sia comprimendo meglio il pellet in modo che se ne perda meno durante il lavaggio. Il protocollo descritto qui è incentrato sulla produzione di particelle con TPGS come agente emulsionante ed EtAc come solvente; tuttavia, sono possibili solventi e/o agenti emulsionanti alternativi. In generale, osserviamo che l'EtAc produce nanoparticelle più piccole e di dimensioni più uniformi rispetto al DCM (ad es. diametri di 540 nm±190 contro 2.160 nm±1.530 per EtAc e DCM, rispettivamente, con 100 mg/ml di PLGA nel solvente, emulsionato in 2 ml di TPGS 0,1%), presumibilmente perché l'EtAc è miscibile con l'acqua, mentre il DCM non lo è. Il PVA è un agente emulsionante molto utilizzato, ampiamente impiegato sia dal nostro gruppo che da altri. Abbiamo osservato variabilità nelle nanoparticelle preparate da diversi lotti di PVA disponibili in commercio. È quindi consigliabile, quando possibile, utilizzare lo stesso stock di PVA per migliorare la riproducibilità. Secondo le nostre osservazioni, il PVA si rivela un emulsionante più efficace rispetto al TPGS a concentrazioni molto più elevate (ad es. diametro di 140 nm±48, con 100 mg/ml di PLGA in DCM, emulsionato in 2 ml di PVA al 5%).
La caratterizzazione di nanoparticelle mediante SEM può risultare difficoltosa a causa delle differenze tra apparecchiature e processi di imaging. È quindi fondamentale distinguere le caratteristiche morfologiche che indicano problemi nella formazione delle particelle dagli artefatti introdotti involontariamente durante l’acquisizione delle immagini. La fusione (Figure 4a e 4b), la formazione di ammaccature (Figura 4c) o la fratturazione (Figura 4f) delle particelle talvolta osservate nelle immagini al SEM possono indicare particelle mal formate (ad es. in Figura 4a, la concentrazione dell'emulsionante era troppo elevata per formare particelle distinte), ma potrebbero anche derivare da artefatti introdotti dal metodo di caratterizzazione (ad es. in Figura 4b, il campione si è riscaldato durante la sputterizzazione, e in Figura 4c, il riscaldamento locale provocato dal fascio del SEM ha alterato la morfologia superficiale delle particelle durante l’acquisizione). Per evitare artefatti di imaging, il tempo di sputterizzazione deve essere ridotto al minimo e la potenza del fascio mantenuta bassa. Morfologie più lisce si osservano con tempi di sputterizzazione più lunghi; tuttavia, ciò può indurre la fusione delle particelle. Tempi di sputterizzazione troppo brevi possono rendere difficoltosa l’acquisizione delle immagini, poiché le particelle si caricheranno elettricamente e si sposteranno durante la cattura dell’immagine. Acquisire le immagini rapidamente aiuta a evitare un’esposizione prolungata al fascio e la distorsione delle immagini (Figure 4d e 4e). Un’elevata esposizione al fascio può inoltre causare espansione e fratturazione della superficie delle nanoparticelle (Figura 4f). Se gli artefatti morfologici non possono essere ridotti modificando i parametri di caratterizzazione, è possibile che riflettano problemi reali legati alle nanoparticelle stesse. Durante il processo di fabbricazione, la fusione può derivare da un surriscaldamento dovuto a un’elevata potenza di ultrasonificazione, all’evaporazione incompleta del solvente, alla risospensione incompleta durante la fase di lavaggio o a un’errata liofilizzazione.
<img alt="Processo di separazione olio e acqua; sonificazione, evaporazione, raccolta; diagramma della liofilizzazione." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig1.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 1"> 
Figura 1. Schema della fabbricazione delle nanoparticelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig1highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Struttura delle nanoparticelle (SEM) e distribuzione dimensionale (μm, nm), grafico di analisi comparativa." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig2.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 2"> 
Figura 2. Immagini al microscopio elettronico a scansione (SEM) e distribuzioni dimensionali corrispondenti di microparticelle e nanoparticelle di PLGA prodotte con il metodo dell'emulsione semplice. In (A), le particelle sono state formate emulsionando 100 mg di PLGA disciolti in 1 ml di acetato di etile in 2 ml di Vitamin E-TPGS allo 0,05%, e indurite in 45 ml di Vitamin E-TPGS allo 0,01%. La corrispondente distribuzione dimensionale è mostrata in (C). In (B), le particelle sono state formate emulsionando 200 mg di PLGA e 40 mg di camptotecina disciolti in 4 ml di acetato di etile in 4 ml di Vitamin E-TPGS allo 0,3%, e indurite in 90 ml di Vitamin E-TPGS allo 0,3%. La corrispondente distribuzione dimensionale è mostrata in (D). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig2highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Analisi della dimensione delle particelle; il grafico a barre e le immagini al SEM mostrano l'effetto della percentuale di TPGS sulla dimensione dei microsfere." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig3.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 3"> 
Figura 3. La dimensione delle particelle dipende dalla concentrazione dell'emulsionante. L'aumento della concentrazione di Vitamin E-TPGS ha prodotto nanoparticelle più piccole. Sono mostrati i diametri medi e le corrispondenti immagini al SEM di particelle preparate emulsionando 100 mg di PLGA disciolti in 1 ml di acetato di etile in una soluzione di Vitamin E-TPGS al (A) 0,01%, (B) 0,05%, (C) 0,1% o (D) 0,3%, quindi indurite in 45 ml di Vitamin E-TPGS allo 0,3%. Le barre di errore rappresentano la deviazione standard di 200 misurazioni del diametro effettuate su 2 immagini provenienti da un singolo lotto. La barra della scala corrisponde a 5 μm (A-C) e 200 nm (D).<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig3highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.
<img alt="Micrografia al SEM che mostra la morfologia delle particelle e l'aggregazione. Analisi della microstruttura della polvere." fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51015/51015fig4.jpg" data-altupdatedat="1787630408000" data-alt="Figure 4"> 
Figura 4. Artifatti della morfologia superficiale osservati con SEM. In (A), si osserva una forte fusione e strutture simili a lamine presenti in tutta la campione. La concentrazione di Vitamina E-TPGS era troppo elevata (1%) per formare particelle distinte. In (B), alcune regioni del campione erano fuse, tuttavia esistevano ampie zone con nanoparticelle discrete, in particolare dove erano presenti interruzioni nel rivestimento ottenuto per sputtering. Riteniamo che questi artifatti di fusione siano dovuti al riscaldamento durante il processo di sputtering. In (C), le particelle inizialmente apparivano lisce, ma un'esposizione prolungata del campione al fascio di SEM ha causato la formazione di fossette e rugosità. (D) mostra un'immagine a bassa risoluzione acquisita con esposizione minima del campione al fascio di SEM; le particelle appaiono lisce con una morfologia rotondeggiante. In (E), lo stesso campione è esposto per un periodo più lungo, e si osserva una evidente distorsione della morfologia originale. In (F), un'esposizione prolungata al fascio con un'alta tensione (12 kV) ha provocato riscaldamento e fratture delle particelle. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51015/51015fig4highres.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare l'immagine ingrandita</a>.

Descriviamo la produzione e la caratterizzazione di nanoparticelle e microparticelle composte da acido poli(lattico-co-glicolico) utilizzando la vitamina E-TPGS come emulsionante. Variando i parametri di formulazione come la concentrazione dell'emulsionante, è possibile produrre nanoparticelle con diametri medi che vanno da 220 nm a 1,98 μm.

PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS

Poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) is a biocompatible member of the aliphatic polyester family of biodegradable polymers. PLGA has long been a popular ...

L'obiettivo generale di questa procedura è formare nanoparticelle polimeriche di dimensioni regolabili. Questo risultato si ottiene sciogliendo innanzitutto un polimero in un solvente organico e aggiungendo un farmaco o un agente incapsulante fluorescente. Il secondo passaggio consiste nell'emulsionare il polimero con una fase acquosa contenente l'agente emulsionante, per poi permettere alle particelle di indurirsi in un volume acquoso più grande man mano che il solvente evapora.Successivamente, le particelle vengono lavate, raccolte mediante centrifugazione e liofilizzate per un immagazzinamento a lungo termine. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare le dimensioni delle nanoparticelle e la morfologia superficiale mediante microscopia elettronica a scansione o imaging al SEM. In definitiva, il SEM viene utilizzato per dimostrare che le dimensioni delle nanoparticelle possono essere controllate variando la concentrazione dell'emulsionante.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse malattie umane, poiché le particelle possono essere personalizzate per incapsulare e rilasciare una vasta gamma di agenti terapeutici con azione prolungata. Nel tessuto bersaglio. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale.Le fasi di emulsionamento sono difficili da apprendere perché aspetti sottili della formazione dell'emulsione possono avere un impatto significativo sulle proprietà delle particelle. Per iniziare la preparazione delle nanoparticelle, mettere circa 100 milligrammi di acido polilattico-co-glicolico, noto anche come PLGA, in un tubo da 13 per 100 millimetri. Successivamente, utilizzando una pipetta sierologica di vetro, trasferire un millilitro di acetato di etile nel campione, coprire l'apertura del tubo con della carta d'alluminio e quindi sigillare accuratamente la carta con del para film.Assicurarsi di avvolgere bene il parafilm lungo il bordo superiore della provetta e il bordo inferiore della stagnola per evitare l'evaporazione del solvente. Segnare il livello del solvente sul tubo da saggio e lasciare sciogliere il polimero per tutta la notte. Il giorno successivo, aggiungere ulteriore solvente se si verifica dell'evaporazione.Preparare le seguenti attrezzature e materiali in una cappa chimica vicina all'ultrasuoni. Vortexare due piccole pipette di Pasteur in vetro con bulbi di gomma e una piastra magnetica di agitazione. Inoltre, posizionare un grande becher pieno di acqua ghiacciata su un supporto al di sotto dell'ultrasuoni.Successivamente, aggiungere 45 millilitri di vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% peso/volume in un becher di vetro da 200 millilitri, quindi impostare la velocità di agitazione a 360 giri al minuto. Aggiungere quindi 2 millilitri della vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% peso/volume in un tubo di prova di vetro da 13 × 100 millimetri. Per incorporare agenti idrofobici, aggiungere l'incapsulante direttamente alla soluzione polimerica, avendo cura di evitare le pareti del tubo e vorticare il tubo fino a quando l'incapsulante non risulti omogeneamente disperso.Per agenti idrofili, emulsionare l'incapsulante con la soluzione polimerica. Aggiungere fino a 50 microlitri di farmaco in tampone sulla superficie della soluzione polimerica. Sottoporre la miscela a ultrasuoni su ghiaccio per circa 10 secondi o fino a quando la soluzione diventa opaca e omogenea.Successivamente, agitare il tubo da provetta contenente vitamina E-T-P-G-S a velocità elevata mantenendo il tubo in posizione verticale. Tenere la pipetta di vetro ad una distanza di uno-due centimetri sopra l'estremità superiore del tubo in vortice e aggiungere lentamente la soluzione polimerica goccia a goccia sulla superficie del vortice. Prestare attenzione affinché la pipetta non tocchi le pareti del tubo dopo che l'intera soluzione polimerica è stata aggiunta.Continuare a vorticare la soluzione. Formare ora un'emulsione per 15 secondi. Trasferire immediatamente il polimero emulsionato all'ultrasuonatore.Mantenere il tubo da provetta immerso in acqua ghiacciata e sottoporre l'emulsione a sonificazione in tre impulsi di dieci secondi ciascuno. Muovere l'emulsione su e giù lungo la sonda per garantire una sonificazione uniforme ed evitare di far toccare la sonda alle pareti o al fondo del tubo da provetta. Fare una pausa di cinque-dieci secondi tra ogni sonificazione di dieci secondi per permettere alla soluzione di raffreddarsi prima di procedere.Quindi aggiungere uno o due millilitri di vitamina E-T-P-G-S allo 0,3% dalla soluzione in agitazione all'emulsione. Questo ridurrà la viscosità del polimero emulsionato, rendendolo più facile da versare; svuotare l'emulsione nella soluzione in agitazione. Lavare eventuali residui rimasti nel tubo di prova all'interno della soluzione in agitazione.Lasciare indurire le nanoparticelle mescolando per tre ore. Se l'incapsulante è sensibile alla luce, avvolgere il becher in un foglio di alluminio e lasciare il recipiente aperto per favorire l'evaporazione del solvente. Per raccogliere le nanoparticelle, iniziare suddividendo il contenuto in due provette per centrifuga Oak Ridge da 30 millilitri di volume nominale, bilanciate tra loro entro 0,1 grammi. Centrifugare quindi le nanoparticelle in un rotore ad angolo fisso per 15 minuti a 17.000 ×g.RC f. Tempi di centrifugazione più lunghi porteranno alla raccolta di una frazione maggiore di nanoparticelle più piccole. Eliminare il soprannatante avendo cura di non disturbare il pellet di nanoparticelle.Aggiungere cinque millilitri di acqua distillata e utilizzare un bagno a ultrasuoni, un agitatore e un vortice per sospendere completamente le nanoparticelle. Unire il contenuto dei due tubi da centrifuga in uno solo e aggiungere 20 millilitri di acqua distillata per un volume totale di 30 millilitri. Ripetere quindi i passaggi di centrifugazione e lavaggio altre due volte, per un totale di tre lavaggi.Il volume del fluido dell'ultima sospensione del pellet deve essere di quattro-cinque millilitri. Congelare un'aliquote piccola di nanoparticelle prive di telo per l'immagine al microscopio elettronico a scansione rispetto al resto. Aggiungere un rapporto ponderale da uno a due di TLO al polimero come crioprotettante per una sospensione di risospensione uniforme e completa di nanoparticelle PLGA.Questo impedirà la formazione di cristalli di ghiaccio che potrebbero danneggiare la superficie delle particelle e indurre aggregazione. Trasferire le nanoparticelle in un tubo da centrifuga da cinque millilitri pre-pesato, quindi congelare a meno 80 gradi Celsius per almeno 30 minuti. Successivamente, togliere il tappo dal tubo e coprire l'apertura fissando un fazzoletto da laboratorio sulla sommità con un elastico.Spostarsi rapidamente in modo che il contenuto non si sciolga, nel caso si verifichi uno scioglimento. Rigelare prima di posizionare nel liofilizzatore, quindi sottoporre a liofilizzazione il campione di cinque millilitri per 72 ore. Successivamente, sostituire il tappo e avvolgere il tubo per conservare le particelle liofilizzate a meno 80 gradi Celsius.Nel giorno dell'acquisizione delle immagini, posizionare una striscia di nastro adesivo in carbonio bifacciale su un supporto per SEM. Etichettare la parte metallica del supporto con un pennarello indelebile per riferimenti successivi. Utilizzare una spatola metallica per raccogliere una piccola quantità di nanoparticelle liofilizzate e distribuirle delicatamente sulla superficie del nastro.Spazzolare la superficie del supporto con un fazzoletto da laboratorio o utilizzare aria compressa per rimuovere le nanoparticelle libere. Visualizzare le particelle utilizzando una distanza di lavoro di cinque a 15 millimetri del fascio, un'intensità di cinque a 12 chilovolt e una dimensione del punto da uno a tre; intensità del fascio più elevate possono provocare un riscaldamento locale del campione, il che altererà la morfologia superficiale delle particelle. I microparticelle vengono osservate a un ingrandimento di 100 volte e le nanoparticelle saranno distinguibili a 3000 volte.Ingrandire la parte superiore di una sfera per individuare le particelle facilmente visualizzabili al microscopio elettronico a scansione (SEM); acquisire almeno tre immagini per ogni lotto al fine di ottenere un campione rappresentativo della dimensione e della morfologia delle particelle. Utilizzando questo metodo, le particelle possono formarsi mediante un'unica emulsione, apparendo come sfere singole non fuse con una superficie liscia e un'ampia distribuzione di dimensioni nell'intero campione. Le microparticelle mostrate in questo caso hanno un diametro medio di 730 nanometri.Qui sono mostrate nanoparticelle create da un singolo emulsionante che incapsulano il farmaco idrofobico campin. Queste particelle si sono rivelate ancora più piccole, con un diametro medio di 340 nanometri. Concentrazioni più elevate di emulsionante hanno prodotto particelle più piccole, con diametri medi che diminuiscono da 2000 a 200 nanometri.Man mano che la concentrazione dell'emulsionante aumentava da 0,01 a 0,3%, come mostrato dalle immagini SEM riportate qui. Tuttavia, quando la concentrazione di vitamina E-T-P-G-S era troppo elevata, non si formavano particelle discrete: utilizzando l'1% di vitamina E-T-P-G-S, si osservavano fusioni intense e strutture simili a lamine presenti in tutta la struttura. È vero. Una volta appreso come fabbricare nanoparticelle di PLG mediante emulsionificazione, è possibile eseguire altri metodi, come la modifica della superficie, per progettare nanoparticelle in grado di interagire con specifici tipi cellulari o regioni del corpo.Dopo aver visionato questo Video, dovresti avere una buona comprensione di come formare particelle con dimensioni riproducibili e regolabili mediante emulsionificazione.

plga-nanoparticles-formed-single-or-double-emulsion-with-vitamin-e

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

Insonazione di microbolle è una strategia promettente per l'ablazione del tumore al ridotto potere acustico medie nel tempo, così come per la somministrazione mirata di terapie. Lo scopo del presente studio è quello di sviluppare strategie di ultrasuoni a bassa dovere ciclo pulsante e nanovettori per massimizzare non ablazione termica microvascolare e la consegna a carico sottocutaneo C6 gliomi.

Mezzo di contrasto ecografico mirato trattamento dei gliomi nei topi tramite Drug-Bearing consegna delle nanoparticelle e ablazione microvascolari

Questo articolo descrive un metodo per sintetizzare nanoprecipitation polimero a base di nanoparticelle utilizzando diblock co-polimeri. Discuteremo la sintesi di copolimeri diblock, la tecnica nanoprecipitation e potenziali applicazioni.

Formulazione di nanoparticelle polimeriche diblock attraverso Tecnica Nanoprecipitation

Fonte: Zhu, J., et. al., Preparazione e caratterizzazione di nuove nanoparticelle che imitano l'HDL per l'incapsulamento del fattore di crescita nervoso. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'assemblaggio graduale di nanoparticelle che imitano l'HDL caricate con NGF utilizzando l'incapsulamento assistito da protamina e l'autoassemblaggio basato sui lipidi per potenziali applicazioni di somministrazione neurotrofica.

Incapsulamento del fattore di crescita nervoso in nanoparticelle che imitano le lipoproteine ad alta densità

L'obiettivo di questo protocollo è descrivere la preparazione e la caratterizzazione di farmaci fisicamente intrappolati e scarsamente solubili in acqua in sistemi di somministrazione di farmaci micellari composti da copolimeri a blocchi anfifilici.

Preparazione e caratterizzazione di individuale e Multi-droga Loaded Fisicamente intrappolate polimerici Micelle

Qui, presentiamo un protocollo per la sintesi del peptide di associazione placentare condroitina solfato A (plCSA-BP)-coniugato del lipido-polimero nanoparticelle via passo singolo sonicazione e bioconjugate tecniche. Queste particelle costituiscono un nuovo strumento per la somministrazione mirata di terapeutica di tumori più umani e trofoblasto placentare per trattare tumori e disturbi placentare.

Sintesi e caratterizzazione di placenta condroitina solfato un (plCSA) - Targeting del lipido - nanoparticelle polimeriche

Flash nanoprecipitazione (FNP) è un approccio scalabile per produrre nanoparticelle core-shell polimeriche. Formulazioni su scala di laboratorio per l'incapsulamento di terapeutica idrofila o idrofoba sono descritti.

Flash nanoprecipitazione per l'incapsulamento di composti idrofobi e idrofili in nanoparticelle polimeriche

Questo articolo viene descritto l'incapsulamento di falcarindiol in nanoparticelle di nm 74 del lipido-rivestite. L'assorbimento cellulare delle nanoparticelle di cellule staminali umane in goccioline del lipido è monitorato da formazione immagine di fluorescenza e confocale. Le nanoparticelle sono fabbricate con il metodo di iniezione rapida di solvente spostando e loro dimensione viene misurata con la tecnica di dispersione della luce dinamica.

Assorbimento di nuove nanoparticelle rivestite con lipidi contenenti Falcarindiol di cellule staminali mesenchimali umane

Questo studio descrive l'idratazione classica usando il metodo della pellicola lipidica sottile per la preparazione dei nanoliposomi seguito dalla caratterizzazione delle nanoparticelle. Una proteina clada e globulare k7 kDa-idrofilo, il tarino, è incapsulata con successo come strategia per migliorare la stabilità, evitare la clearance veloce e promuovere il rilascio controllato. Il metodo può essere adattato all'incapsulamento delle molecole idrofobiche.

Preparazione e caratterizzazione dei nanoliposomi per l'entratura delle proteine globulari bioattive

Le nanoparticelle lipidiche sono sviluppate utilizzando un approccio di piattaforma di miscelazione microfluidica per l'incapsulamento di mRNA e DNA.

Formulazione e caratterizzazione di nanoparticelle lipidiche per la somministrazione genica utilizzando una piattaforma di miscelazione microfluidica

Questo protocollo descrive la sintesi e la formulazione di biomateriali idrogel iniettabili, supramolecolari polimeri-nanoparticella (PNP). Vengono dimostrate le applicazioni di questi materiali per la somministrazione di farmaci, la stabilizzazione biofarmaceutica e l'incapsulamento e la consegna delle cellule.

Idrogel supramolecolari supramolecolari iniettabili per applicazioni di somministrazione di cellule e farmaci

Per progettare razionalmente adiuvanti efficienti, abbiamo sviluppato l'emulsione Pickering stabilizzata con nanoparticelle di acido polilattico e co-glicolico (PNPE). Il PNPE possedeva una morbidezza unica e un'interfaccia idrofobica per un potente contatto cellulare e offriva un carico di antigene ad alto contenuto, migliorando l'affinità cellulare del sistema di consegna alle cellule presentanti l'antigene e inducendo un'internalizzazione efficiente degli antigeni.

Affinità cellulare dell'emulsione stabilizzata dalle particelle per aumentare l'internalizzazione dell'antigene

Impara a produrre nanoparticelle di PLGA con dimensioni controllate da 220 nm a 1,98 µm utilizzando la vitamina E-TPGS come emulsionante. Questo metodo permette di personalizzare i sistemi di rilascio farmaceutico per applicazioni terapeutiche mirate.

PLGA nanoparticelle formate da singola o doppia emulsione con Vitamina E-TPGS

Esplora altri video