Name: Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-08T14:15:00.000+00:00
Duration: 10 min 33 s
Description: Impara a isolare proteine chimeriche con Fc umano utilizzando adsorbenti di membrana a proteina A. Questo metodo semplificato riduce i tempi di elaborazione e aumenta la resa proteica rispetto alla cromatografia tradizionale.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Gli autori desiderano ringraziare il Sig. Luis F. Delgadillo (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University), il Sig. Matthew H. Williams (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare, Ohio University) e il Dr. Filiberto Cedeno-Laurent (Brigham and Women's Hospital e Harvard Medical School) per l'assistenza tecnica di esperti. Gli autori desiderano inoltre ringraziare gli studenti dell'inverno 2011 CHE 404/BME 504 e dell'autunno 2012 CHE 4830/BME 5830 (Dipartimento di Ingegneria Chimica e Biomolecolare e Ingegneria Biomedica, Ohio University) per la consulenza tecnica e la discussione. Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione per la strumentazione di ricerca principale della National Science Foundation (NSF) CBET-1039869 (MMB), NSF CBET-1106118 (MMB), Dermatology Foundation Research Grant A050422 (SRB), National Institutes of Health (NIH) NSC grant 1R15CA161 830-01 (MMB), NIH Kirschstein-NRSA Postdoctoral Fellowship F32CA144219-01A1 (SRB), NIH/NCI R01CA173610 (CJD) e NIH NCCAM grant R01AT004628 (CJD).

1. Verificare l'affinità per le proteine A
<ol><li>Verificare che la proteina che esprime fc (proteina di fusione ricombinante o anticorpo IgG, finora denominata "proteina") abbia un'affinità accettabile per la proteina A14-17 prima di utilizzare l'adsorbente della membrana A della proteina E e verificare la presenza della proteina nella soluzione stock(ad esempio, supernatante di coltura cellulare chiarificato dalla centrifugazione a 1.000 x g per 5 minuti a cellule sospese a pellet). Utilizzare citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. per rilevare la funzione proteica e/o la presenza di Fc, in base alle preferenze di laboratorio. Idealmente, quantificare la proteina nel supernatante di coltura cellulare (fase 6) per evitare di superare la capacità di adsorbente della membrana A della proteina. Procedere se viene rilevata una proteina.</li>
</ol>2. Preparare proteine A membrana adsorbente e coltura cellulare supernatante
<ol><li>Seguire le istruzioni del produttore per preparare l'adsorbente a membrana. Non lasciare mai che l'aria entri nell'adsorbente della membrana. Tutte le soluzioni perfuse attraverso l'adsorbente a membrana devono essere a temperatura ambiente e prefiltrate utilizzando un filtro da 0,22 μm. Riempire una siringa da 10 ml con la salina tamponata al fosfato (DPBS) filtrata da Dulbecco filtrata da 0,22 μm o tampone di scelta e scarico delle bolle d'aria. Perfondere DPBS per rimuovere la soluzione di archiviazione e equilibrare l'adsorbente a membrana immediatamente prima dell'uso.</li>
	<li>Filtrare il supernatante di coltura cellulare immediatamente prima della perfusione attraverso l'adsorbente a membrana, utilizzando un'unità di filtrazione sterile aspirata da 0,22 μm.</li>
</ol>3. Caricare la proteina A Membrane Adsorber
<ol><li>Aspirare il supernatante di coltura cellulare in una siringa Luer Lock (30 ml o più) e scaricare eventuali bolle d'aria.</li>
	<li>Assemblate materiali e attrezzature, come illustrato nella figura 1. Collegare la siringa all'ingresso dell'adsorbente della membrana. Collegare tubi flessibili all'uscita dell'adsorbente a membrana. Se lo si desidera, posizionare un filtro siringa da 0,22 μm tra la siringa e l'adsorbente a membrana. Utilizzare un pallone o una bottiglia per catturare il flusso attraverso (noto anche come filtrato), dall'adsorbente.</li>
	<li>Impostare la pompa della siringa sulla portata volumetrica desiderata, ma non superare la portata raccomandata dalproduttore (ad esempio 10 ml/min). Perfondere il supernatante della coltura cellulare attraverso l'adsorbente a membrana, raccogliendo il flusso attraverso un becher o un altro contenitore. Ricaricare la siringa con i supernatanti necessari.</li>
	<li>Se lo si desidera, testare il flusso attraverso per la presenza di proteine utilizzando citometria di flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio. In genere non è necessario riperperperare il flusso attraverso.</li>
</ol>4. Proteina Elute dall'adsorbente di membrana
<ol><li>Lavare l'adsorbente a membrana con 10 ml di DPBS per rimuovere eventuali proteine non abbollate.</li>
	<li>Elute proteina dall'adsorbente di membrana alla portata desiderata(ad esempio 1 ml/min) utilizzando 10-15 ml di tampone di eluizione(ad esempio tampone di eluizione a base di ammina (pH 2,8)). Catturare l'eluato in un tubo contenentetampone neutralizzante (ad esempio 1 M Tris (pH 9,4)) al 10% del volume di eluizione (1,0-1,5 ml).</li>
	<li>In alternativa, la proteina eluta in un ml si trasforma in tubi contenenti 100 μl di tampone di neutralizzazione, utilizzando un volume totale di tampone di eluizione da 10-15 ml. Utilizzare il metodo di caratterizzazione preferito per testare ogni frazione per la presenza di proteine.</li>
	<li>Rigenerare l'adsorbente a membrana secondo le istruzioni del produttore. Perfondere 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm o tampone di scelta, quindi 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm in 50 mM naoh in 1 N NaCl e infine 10 ml di DPBS filtrato da 0,22 μm. Riempire l'adsorbente a membrana con il 20% di etanolo in DPBS per la conservazione a lungo termine a 4 ºC.</li>
</ol>5. Concentrare e dializzare la proteina
<ol><li>Depositare tutti gli eluati (o frazioni di eluizione contenenti proteine come determinato nella fase 4.3) in un'unità filtrante centrifuga cut-off a peso molecolare da 10 kDa. Seguire le istruzioni del produttore per la centrifugazione.</li>
	<li>Dializzare il ritensionato in un'unità di dialisi a piccolo volume (taglio del peso molecolare di 10 kDa) contro il tampone preferito, seguendo le istruzioni del produttore. Potrebbe essere necessario aggiungere un tampone al materiale dializzato se la precipitazione proteica è un problema. Se lo si desidera, il materiale dializzato può essere refrigerato fino a quando non è possibile eseguire il passaggio 6, ma non è consigliabile conservare a lungo termine senza conservanti.</li>
</ol>6. Quantificare e caratterizzare il prodotto purificato in una procedura di blotting occidentale accelerata
<ol><li>Risolvere gli standard di proteina purificata e Fc sul gel di scelta da parte di SDS-PAGE, in condizioni di riduzione o non riduzione comedesiderato 18-20. Utilizzare un mini gel anziché un gel midi per ridurre al minimo i tempi di esecuzione.<ol>
<li>Se non è già noto, determinare l'intervallo di standard Fc su quale segnale a banda varia linearmente rispetto alla quantità di carico(ad esempio 0,1-1 mg). Usa lo stesso gel, le condizioni di esecuzione, le condizioni di trasferimento e i reagenti che verranno utilizzati per quantificare e caratterizzare le proteine purificate.</li>
			<li>Caricare più quantità di campioni di proteine purificate, inclusi campioni diluiti con DPBS, per garantire che i segnali di banda proteica purificata si trovano all'interno dell'intervallo di segnale lineare degli standard Fc nell'analisi delle immagini.</li>
		</ol>
</li>
	<li>Trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di polivinilidene (PVDF) in un sistema tampone discontinuo utilizzando un blotter semidry13, seguendo le istruzioni del produttore di blotter. Il tempo di trasferimento è in genere di 5-10 minuti. Se lo si desidera, Coomassie macchia il gel dopo il trasferimento per verificare l'efficienza deltrasferimento 21.</li>
	<li>Eseguire l'immunoblotting con anti-Fc o anti-IgG coniugato alla fosfatasi alcalina (AP) o alla perossidasi del ravanello del cavallo (HRP), in base alle preferenze di laboratorio, utilizzando un sistema di rilevamento delle proteine assistito dal vuoto. Il tempo di immunoblotting è in genere inferiore a 1 ora.</li>
	<li>Sviluppare immunoblot utilizzando il substrato e il metodo di scelta(ad esempio substrato AP e chemiluminescenza migliorata).</li>
	<li>Quantificare le proteine purificate mediante analisi delle immagini. Eseguire una regressione lineare sui segnali di banda dagli standard Fc. Se R2>0,90, utilizzare l'equazione per la linea per calcolare la quantità proteica dai suoi segnali di banda. Tenere conto della diluizione del campione, se necessario. Poiché la quantificazione della proteina viene eseguita sulla base di Fc, regolare il valore delle differenze di peso molecolare tra la proteina e Fc. Se R2<0,90, ripetere il passaggio 6 nella sua interezza.</li>
	<li>Convalidare proteine utilizzando saggi o metodi funzionali per rilevare Fc tramite citometria a flusso, western blotting, ELISA, ecc. in base alle preferenze di laboratorio.</li>
	<li>Diluire le proteine alla concentrazione desiderata e/o aggiungere eventuali conservanti o stabilizzanti desiderati alla soluzione proteica purificata prima di aliquota per la conservazione a lungo termine, congelata o meno.</li>
</ol>

<ol><li>Gagnon, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Technology+trends+in+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Technology trends in antibody purification.</a> J. Chromatogr. A. 1221, 57-70 (2012).</li>
<li>Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bioseparation+in+antibody+manufacturing%3A+The+good%2C+the+bad+and+the+ugly%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Bioseparation in antibody manufacturing: The good, the bad and the ugly.</a> Biotechnol. Prog. 24, 496-503 (2008).</li>
<li>Liu, H. F., Ma, J., Winter, C., Bayer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recovery+and+purification+process+development+for+monoclonal+antibody+production%5BTitle%5D)+AND+%22MAbs%22%5BJournal%5D)">Recovery and purification process development for monoclonal antibody production.</a> MAbs. 2, 480-499 (2010).</li>
<li>Low, D., O'Leary, R., Pujar, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Future+of+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Future of antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, 48-63 (2007).</li>
<li>Boi, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+adsorbers+as+purification+tools+for+monoclonal+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Anal.+Technol.+Biomed.+Life.+Sci%22%5BJournal%5D)">Membrane adsorbers as purification tools for monoclonal antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Anal. Technol. Biomed. Life. Sci. 848, (1016).</li>
<li>Cuatrecasas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+purification+by+affinity+chromatography.+Derivatizations+of+agarose+and+polyacrylamide+beads%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Protein purification by affinity chromatography. Derivatizations of agarose and polyacrylamide beads.</a> J. Biol. Chem. 245, 3059-3065 (1970).</li>
<li>Shukla, A. A., Gottschalk, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-use+disposable+technologies+for+biopharmaceutical+manufacturing%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Single-use disposable technologies for biopharmaceutical manufacturing.</a> Trends Biotechnol. 31, 147-154 (2013).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Performance+of+a+new+protein+a+affinity+membrane+for+the+primary+recovery+of+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol+Prog%22%5BJournal%5D)">Performance of a new protein a affinity membrane for the primary recovery of antibodies.</a> Biotechnol Prog. 24, 640-647 (2008).</li>
<li>Dancette, O. P., Taboureau, J., Tournier, E., Charcosset, C., Blond, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+immunoglobulins+g+by+protein+a%2Fg+afinity+membrane+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B%22%5BJournal%5D)">Purification of immunoglobulins g by protein a/g afinity membrane chromatography.</a> J. Chromatogr. B. 723, 61-68 (1999).</li>
<li>Thommes, J., Etzel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternatives+to+chromatographic+separations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnol.+Prog%22%5BJournal%5D)">Alternatives to chromatographic separations.</a> Biotechnol. Prog. 23, 42-45 (2007).</li>
<li>Boi, C., Dimartino, S., Sarti, G. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+and+simulation+of+affinity+membrane+adsorption%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+A%22%5BJournal%5D)">Modelling and simulation of affinity membrane adsorption.</a> J. Chromatogr. A. 1162, 24-33 (2007).</li>
<li>van Beijeren, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer-aided+process+design+of+affinity+membrane+adsorbers%3A+A+case+study+on+antibodies+capturing%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Pap%22%5BJournal%5D)">Computer-aided process design of affinity membrane adsorbers: A case study on antibodies capturing.</a> Chem. Pap. 62, 458-463 (2008).</li>
<li>Lauriere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+semidry+electroblotting+system+efficiently+transfers+both+high-+and+low-molecular-weight+proteins+separated+by+sds-page%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A semidry electroblotting system efficiently transfers both high- and low-molecular-weight proteins separated by sds-page.</a> Anal. Biochem. 212, 206-211 (1993).</li>
<li>Darcy, E., Leonard, P., Fitzgerald, J., Danaher, M., O'Kennedy, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+antibodies+using+affinity+chromatography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Purification of antibodies using affinity chromatography.</a> Methods Mol. Biol. 681, 369-382 (2011).</li>
<li>Hjelm, H., Hjelm, K., Sjoquist, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+from+staphylococcus+aureus.+Its+isolation+by+affinity+chromatography+and+its+use+as+an+immunosorbent+for+isolation+of+immunoglobulins%5BTitle%5D)+AND+%22FEBS+Lett%22%5BJournal%5D)">Protein a from staphylococcus aureus. Its isolation by affinity chromatography and its use as an immunosorbent for isolation of immunoglobulins.</a> FEBS Lett. 28, 73-76 (1972).</li>
<li>Hober, S., Nord, K., Linhult, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+a+chromatography+for+antibody+purification%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Chromatogr.+B+Analyt.+Technol.+Biomed.+Life+Sci%22%5BJournal%5D)">Protein a chromatography for antibody purification.</a> J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 848, 40-47 (2007).</li>
<li>Kronvall, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+surface+component+in+group+a%2C+c%2C+and+g+streptococci+with+non-immune+reactivity+for+immunoglobulin+g%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">A surface component in group a, c, and g streptococci with non-immune reactivity for immunoglobulin g.</a> J. Immunol. 111, 1401-1406 (1973).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+nascent+galectin-1+chimeric+molecule+for+studying+the+role+of+leukocyte+galectin-1+ligands+and+immune+disease+modulation%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Development of a nascent galectin-1 chimeric molecule for studying the role of leukocyte galectin-1 ligands and immune disease modulation.</a> J. Immunol. 185, 4659-4672 (2010).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+t4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage t4.</a> Nature. 227, 680-685 (1970).</li>
<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets%3A+Procedure+and+some+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: Procedure and some applications.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 76, 4350-4354 (1979).</li>
<li>Reisner, A. H., Nemes, P., Bucholtz, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+use+of+Coomassie+brilliant+blue+g250+perchloric+acid+solution+for+staining+in+electrophoresis+and+isoelectric+focusing+on+polyacrylamide+gels%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">The use of Coomassie brilliant blue g250 perchloric acid solution for staining in electrophoresis and isoelectric focusing on polyacrylamide gels.</a> Anal. Biochem. 64, 509-516 (1975).</li>
<li>Cedeno-Laurent, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolic+inhibition+of+galectin-1-binding+carbohydrates+accentuates+antitumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Invest.+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Metabolic inhibition of galectin-1-binding carbohydrates accentuates antitumor immunity.</a> J. Invest. Dermatol. 132, 410-420 (2012).</li>
<li>Bradford, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+and+sensitive+method+for+the+quantitation+of+microgram+quantities+of+protein+utilizing+the+principle+of+protein-dye+binding%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.</a> Anal. Biochem. 72, 248-254 (1976).</li>
<li>Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microvolume+Protein+Concentration+Determination+using+the+NanoDrop+2000c+Spectrophotometer%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer.</a> J. Vis. Exp. (33), (2009).</li>
<li>Ernst, O., Zor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linearization+of+the+Bradford+Protein+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Linearization of the Bradford Protein Assay.</a> J. Vis. Exp. (38), (2010).</li>
<li>Simonian, M. H., Smith, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectrophotometric+and+colorimetric+determination+of+protein+concentration%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Protoc.+Mol.+Biol.+Chapter%22%5BJournal%5D)">Spectrophotometric and colorimetric determination of protein concentration.</a> Curr. Protoc. Mol. Biol. Chapter. 10, 10-1002 (2006).</li>
<li>Smith, P. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+protein+using+bicinchoninic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Biochem%22%5BJournal%5D)">Measurement of protein using bicinchoninic acid.</a> Anal. Biochem. 150, 76-85 (1985).</li>
<li>Gravel, C., Li, C., Wang, J., Hashem, A. M., Jaentschke, B., Van Domselaar, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+Analyses+of+all+Influenza+Type+A+Viral+Hemagglutinins+and+Neuraminidases+using+Universal+Antibodies+in+Simple+Slot+Blot+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Vis.+Exp%22%5BJournal%5D)">Quantitative Analyses of all Influenza Type A Viral Hemagglutinins and Neuraminidases using Universal Antibodies in Simple Slot Blot Assays.</a> J. Vis. Exp. (50), (2011).</li>
</ol>

Non c'è nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è stato sviluppato per isolare e caratterizzare rapidamente una proteina di fusione chimerica che esprime fc umano (Gal-1hFc), senza compromettere significativamente il recupero del prodotto o il costo di gonfiaggio. I componenti chiave del flusso di lavoro semplificato sono un adsorbente a membrana A proteico per l'isolamento e il trasferimento semidry e l'immunoblotting sottovuoto per la caratterizzazione da parte dell'assorbente occidentale.
La drastica diminuzio...

L'isolamento di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti di immunoglobulina G (IgG) Fc dai supernatanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari diluite può essere realizzato utilizzando la cromatografia di affinità proteinA A. Nei laboratori e nell'industria scientifica e ingegneristica di base, le colonne piene di proteina porosa A agarosio, vetro o perline polimeriche sono più comunemente utilizzate per la cromatografia di affinità, nonostante gli elevati costi finanziari e i lunghi tempi dilavorazione 1-3. È molto apprezzato che la cromatografia di affinità rappresenti il più grande collo di bottiglia di spesa e lavorazione sia in laboratorio che in ambienteindustriale 2,4. Di conseguenza, sono stati sviluppati numerosi miglioramenti per ridurre i costi e i tempi di elaborazione senza sacrificare il recupero complessivo delprodotto dal treno di processo 1,2,5-7. Particolarmente promettente per l'isolamento di anticorpi e altre proteine che esprimono Fc è la cromatografia di affinità utilizzando una proteina A membrane adsorber2,5,7-10. Mentre la cattura fc nella cromatografia a colonna è limitata dalladiffusione (cioè la proteina che esprime fc deve diffondersi nei pori interni e attraverso di esso per raggiungere la maggior parte della proteina A) con caduta di alta pressione attraverso la colonna, il trasporto di massa negli adsorbenti a membrana è guidato dalla convezione alla rinfusa, con conseguente evitare limitazioni didiffusione 8,9,11,12. Inoltre, la caduta di pressione attraverso l'adsorbente a membrana è bassa, consentendo così portate di perfusione più elevate rispetto alle colonne imballate perline8,9,11,12. Pertanto, per l'isolamento su scala di laboratorio, si prevede che la cromatografia a membrana riduca i tempi di isolamento di diverse ore e aumenti la cattura del prodotto rispetto alla cromatografia a colonna. Inoltre, sono stati proposti modelli matematici per l'adsorbimento IgG negli adsorbenti a membrana8,9,11,12, consentendo così agli utenti finali di prevedere le prestazioni in laboratorio.
Un altro collo di bottiglia nei laboratori di scienze e ingegneria di base è la caratterizzazione della proteina che esprime fc. Tuttavia, la selezione di metodi appropriati per completare i test di caratterizzazione, come le macchie occidentali, può ridurre notevolmente il tempo dedicato ai test dei prodotti. Ad esempio, il trasferimento semidry in un sistema tampone discontinuo può realizzare il trasferimento elettroforetico di proteine da un gel SDS-PAGE a una membrana di polivinile difluoridina (PVDF) in pochi minuti, rispetto a 1-2 ore di trasferimento di serbatoio (bagnato) in un sistema tampone continuo13.
Un protocollo rapido, economico ed efficace per isolare e caratterizzare una proteina di fusione chimerica che esprime un frammento Fc di IgG umano è descritto nel presente documento. La maggior parte delle apparecchiature è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche di base, biologia, chimica e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Sebbene siano stati generati risultati rappresentativi dall'isolamento e dalla caratterizzazione di una proteina di fusione chimerica Fc murina-1/umana (Gal-1hFc), il protocollo semplificato può essere applicato all'isolamento di altre molecole che possiedono un frammento Fc, come anticorpi, frammenti Fc stessi o altre proteine di fusione Fc. I nostri miglioramenti hanno ridotto drasticamente i tempi di elaborazione (fino a 4 ore ma più in genere ~ 9 ore, rispetto a oltre 20 ore lavorative) ottenendo al contempo un recupero del prodotto simile o migliorato rispetto ai metodi standard.

<table><tbody><tr><td>Proteina A adsorbitore di membrana (Sartobind Protein A 2 ml)&nbsp;</td><td>Sartorius-Stedim</td><td>93PRAP06HB-12--A</td><td></td></tr><tr><td>Filtro centrifugo Amicon Ultra, 10 kDa, 4 ml</td><td>Millipore</td><td>UFC801008</td><td>Utilizzare un volume di 15 ml se necessario</td></tr><tr><td>Unità filtrante sottovuoto sterile, 0,22 &; m, 500 ml</td><td>Millipore</td><td>SCGPU05RE</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe da 10 ml con punte Luer Lock</td><td>301604</td><td></td><td>BD</td></tr><tr><td>Siringhe da 30 ml con punte Luer Lock</td><td>BD</td><td>309650</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da laboratorio Tygon (1/16 pollici x 1/8 pollici x 50 piedi)</td><td>Cole Parmer</td><td>WU-95903-16</td><td></td></tr><tr><td>Slide-A-Lyzer MINI Dispositivi per dialisi (10K MWCO)</td><td>Thermo Scientific</td><td>69576</td><td></td></tr><tr><td>Vassoio di raccolta anticorpi Snap i.d.</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDABTR</td><td></td></tr><tr><td>Snap i.d. supporto per blot a pozzetto singolo</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBH01</td><td></td></tr><tr><td>tampone di eluizione</td><td>Thermo Scientific</td><td>21004</td><td></td></tr><tr><td>Tris, ultra puro</td><td>Fisher Scientific</td><td>819623</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-100</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Thermo Scientific</td><td>SH30028.02</td><td></td></tr><tr><td>DPBS con Ca2+/Mg2+</td><td>Life Technologies</td><td>14080-055</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Human Fc</td><td>Bethyl Research Laboratories</td><td>P80-104</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano Fc-APC</td><td>Jackson Immunoresearch</td><td>109136170</td><td></td></tr><tr><td>Anti-umano Fc-AP</td><td>Bio-Rad</td><td>170-5018</td><td></td></tr><tr><td>Substrato di fosfatasi alcalina</td><td>Promega</td><td>S3841</td><td></td></tr><tr><td>Provette per citometria a flusso (5 ml di polistirene o polipropilene)</td><td>BD</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>Pompa a siringa</td><td>Apparecchio di Harvard</td><td>55-2226</td><td>È accettabile anche una pompa peristaltica</td></tr><tr><td>Gel proteico sistema di elettroforesi</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>552BR094876</td><td>Qualsiasi sistema di elettroforesi su gel è accettabile, ma i sistemi mini gel funzionano più velocemente</td></tr><tr><td>Semidry blotter</td><td>Bio-Rad Laboratories</td><td>690BR006163</td><td>Qualsiasi sistema di trasferimento è accettabile, ma i sistemi di trasferimento discontinuo eseguono il trasferimento elettroforetico più velocemente</td></tr><tr><td>SNAP i.d. sistema di rilevamento di proteine assistito da vuoto</td><td>EMD Millipore</td><td>WBAVDBASE</td><td>Un modello aggiornato ha sostituito questo strumento specifico, ma entrambi dovrebbero funzionare altrettanto bene</td></tr></tbody></table>

isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine a adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

Isolation and Characterization Of Chimeric Human Fc-expressing Proteins Using Protein A Membrane Adsorbers And A Streamlined Workflow

La purificazione su scala industriale su scala industriale delle biomolecole dai supernanti di coltura cellulare e dalle soluzioni cellulari liscivie può essere effettuata utilizzando la cromatografia di affinità. Mentre la cromatografia di affinità che utilizza proteine porose A agarose perline imballate in colonne è probabilmente il metodo più comune di isolamento in scala di laboratorio di anticorpi e proteine ricombinanti che esprimono frammenti fc di IgG, può essere un processo dispendioso in termini di tempo e costoso. I vincoli di tempo e finanziari sono particolarmente scoraggianti nei piccoli laboratori scientifici di base che devono recuperare centinaia di microgrammi a quantità di proteine milligrammi da soluzioni diluite, ma non hanno accesso a sistemi di erogazione di liquidi ad alta pressione e / o personale con esperienza in bioseparazioni. Inoltre, la quantificazione e la caratterizzazione dei prodotti possono anche allungare eccessivamente il tempo di lavorazione per diversi giorni lavorativi e gonfiare le spese (materiali di consumo, salari, ecc.). Pertanto, è necessario un protocollo veloce, economico ma efficace per l'isolamento su scala di laboratorio e la caratterizzazione di anticorpi e altre proteine in possesso di un frammento Fc. A tal fine, abbiamo ideato un protocollo che può essere completato da personale tecnico a esperienza limitata in meno di 9 ore (circa un giorno lavorativo) e fino a 4 ore, rispetto ai metodi tradizionali che richiedono oltre 20 ore lavorative. La maggior parte delle attrezzature richieste è prontamente disponibile nei laboratori standard di scienze biomediche, biochimiche e (bio)ingegneria chimica, e tutti i reagenti sono disponibili in commercio. Per dimostrare questo protocollo, vengono presentati risultati rappresentativi in cui la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dal supernatante di coltura cellulare è stata isolata usando una proteina A adsorbente di membrana. Il Gal-1hFc purificato è stato quantificato utilizzando una procedura accelerata di analisi western blotting e caratterizzato utilizzando citometria a flusso. Il flusso di lavoro semplificato può essere modificato per altre proteine che esprimono Fc, come gli anticorpi, e /o alterato per incorporare metodi alternativi di quantificazione e caratterizzazione.

Il protocollo semplificato per l'isolamento e la caratterizzazione delle proteine che esprimono fc viene regolarmente utilizzato per elaborare la galettanina murina chimerica-1 fusa all'Fc umano (Gal-1hFc) dai supernanti di coltura cellulare diluita. Il diagramma di flusso nella figura 2 illustra il flusso di lavoro e l'ora di ogni passaggio del protocollo. Per un lotto tipico di 300 ml di supernatante, il tempo totale di lavorazione è di circa 9 ore quando viene eseguita la prova citometrica del flusso ...

Rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale che utilizza colonne piene di perline di agarosio A, gli adsorbenti a membrana A proteici possono accelerare significativamente l'isolamento su scala di laboratorio degli anticorpi e di altre proteine che esprimono frammenti Fc. Metodi di analisi e quantificazione appropriati possono accelerare ulteriormente l'elaborazione delle proteine, consentendo di completare l'isolamento / caratterizzazione in un giorno lavorativo, anziché oltre 20 ore lavorative.

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

Laboratory scale to industrial scale purification of biomolecules from cell culture supernatants and lysed cell solutions can be accomplished using ...

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e caratterizzare in modo efficiente ed efficace proteine chimeriche espresse con FC umano utilizzando proteina A, assorbenti a membrana e un flusso di lavoro semplificato. Questo risultato si ottiene innanzitutto chiarendo il supernatante della coltura cellulare mediante un filtro da 0,22 micron. Il secondo passaggio consiste nell'assemblare il sistema di flusso e avviare la perfusione del supernatante della coltura cellulare attraverso l'assorbente a membrana con proteina A.Successivamente, la proteina esprimente FC umana viene eluita dal supporto a membrana, concentrandola mediante ultrafiltrazione, seguita da uno scambio di tampone tramite dialisi. I passaggi finali consistono nell'utilizzare la citometria a flusso e il western blotting per determinare la qualità e la quantità della proteina concentrata. In definitiva, i supporti a membrana di proteina A, insieme a un flusso di lavoro semplificato, mostrano una riduzione del tempo di lavorazione e un potenziale aumento del rendimento proteico rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale con colonne impacchettate di proteina A aro speed.Il principale vantaggio di questa t

isolation-characterization-chimeric-human-fc-expressing-proteins

Research

Ricerca

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingegneria

La cellula permeabile reticolante DSP [dithiobis-(succinimidile propionato)] stabilizza le interazioni transienti e...

Isolamento di Labile Multi-proteina complessi da In vivo Controllato Cellular Cross-Linking e Immuno-magnetica Cromatografia di affinità

Un romanzo e altamente efficiente in due fasi cromatografia di affinità protocollo è stato sviluppato ed è descritto in dettaglio. Il metodo si basa su un tag purificazione con due affinità intrinseca ed è applicabile ad una vasta gamma di proteine ​​bersaglio con proprietà diverse.

Purificazione delle proteine ​​ortogonali Facilitato da una piastrina Affinity Bispecific

Nel periodo post-genomica umana, la disponibilità di proteine ​​ricombinanti in conformazione nativa è cruciale per la ricerca strutturali, funzionali e terapeutico e lo sviluppo. Qui viene descritto un test e larga scala sistema di espressione proteica in cellule renali embrionali umane 293T che possono essere utilizzati per produrre una varietà di proteine ​​ricombinanti.

Una piattaforma espressione conveniente e generale per la produzione di proteine ​​secrete da cellule umane

Questo video mostra un test per la purificazione degli anticorpi monoclonali dal fluido di coltura cellulare raccolto da cellule ovariche di criceto cinese. Impiega una resina di vetro porosa con proteina A immobilizzata, che si lega alla regione Fc degli anticorpi nel campione, separandoli efficacemente dai contaminanti. L'uso di un tampone di eluizione a basso pH indebolisce l'interazione, facilitando il recupero degli anticorpi purificati.

Una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali prodotti dalle cellule ovariche di criceto cinese

Questo video mostra una tecnica per purificare gli anticorpi monoclonali dal surnatante di coltura ottenuto da una coltura cellulare produttrice di anticorpi. Il processo prevede l'utilizzo di una matrice di perle di agarosio reticolate con proteina A coniugata, che immobilizza gli anticorpi nel surnatante sulle perle, consentendo un'efficace separazione dai contaminanti. Applicando un tampone di eluizione a basso pH, l'interazione proteina A-anticorpo viene allentata, facilitando la raccolta...

Una tecnica di cromatografia di affinità per la purificazione di anticorpi monoclonali

Proteine strutturalmente correlate spesso esercitano funzioni biologiche distinte. Lo scambio di equivalenti regioni di queste proteine al fine di creare proteine chimeriche costituisce un approccio innovativo per identificare le aree critiche della proteina che sono responsabili della loro divergenza funzionale.

Identificazione delle regioni di proteina funzionale attraverso la proteina chimerica costruzione

È stato descritto un protocollo dettagliato per la purificazione e la successiva analisi di un anticorpo monoclonale proveniente da fluido di coltura cellulare raccolto (HCCF) di microbiorici automatizzati. Viene inoltre presentato l'uso di analisi per determinare gli attributi di qualità critica (CQA) e massimizzare il volume di campione limitato per estrarre informazioni vitali.

Purificazione e analisi di un anticorpo monoclonale da cellule ovaio Cesster cinese utilizzando un sistema microbioreante automatizzato

Il metodo BSelex per identificare e recuperare singoli anticorpi specifici dell'antigene dalle cellule mononucleari del sangue periferico umano combina citometria di flusso con PCR a cella singola e clonazione.

Metodo di screening a singola cellula per la selezione e il recupero di anticorpi con specifiche desiderate da popolazioni di cellule di memoria umana b arricchite

In questa procedura, un ligando epitope a base di DsRed viene immobilizzato per produrre una resina di affinità altamente selettiva per la cattura di anticorpi monoclonali da estratti vegetali grezzi o supernatanti della coltura cellulare, in alternativa alla Proteina A.

Agarose cross-linked attivata per lo sviluppo rapido delle resine di maromtagrafia di affinità - Cattura anticorpale come caso di studio

Lo sviluppo di un coniugato dual-funzionale di peptidi antigenici e mimetici Fc-III (DCAF) è nuovo per l'eliminazione di anticorpi nocivi. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la sintesi della molecola DCAF1, che può bloccare selettivamente l'anticorpo 4G2 per eliminare l'effetto di miglioramento dipendente dagli anticorpi durante l'infezione da virus Dengue.

Blocco mirato degli anticorpi da parte di un coniugato dual-funzionale di Peptide antigenico e mimetica Fc-III (DCAF)

Impara a isolare proteine chimeriche con Fc umano utilizzando adsorbenti di membrana a proteina A. Questo metodo semplificato riduce i tempi di elaborazione e aumenta la resa proteica rispetto alla cromatografia tradizionale.

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato (Video) | JoVE Journal

Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

Esplora altri video