Isolamento e caratterizzazione delle proteine chimeriche che esprimono fc umano utilizzando proteine A adsorbenti di membrana e un flusso di lavoro semplificato

L'obiettivo generale di questa procedura è isolare e caratterizzare in modo efficiente ed efficace proteine chimeriche espresse con FC umano utilizzando proteina A, assorbenti a membrana e un flusso di lavoro semplificato. Questo risultato si ottiene innanzitutto chiarendo il supernatante della coltura cellulare mediante un filtro da 0,22 micron. Il secondo passaggio consiste nell'assemblare il sistema di flusso e avviare la perfusione del supernatante della coltura cellulare attraverso l'assorbente a membrana con proteina A.

Successivamente, la proteina esprimente FC umana viene eluita dal supporto a membrana, concentrandola mediante ultrafiltrazione, seguita da uno scambio di tampone tramite dialisi. I passaggi finali consistono nell'utilizzare la citometria a flusso e il western blotting per determinare la qualità e la quantità della proteina concentrata. In definitiva, i supporti a membrana di proteina A, insieme a un flusso di lavoro semplificato, mostrano una riduzione del tempo di lavorazione e un potenziale aumento del rendimento proteico rispetto alla cromatografia di affinità tradizionale con colonne impacchettate di proteina A aro speed.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come la cromatografia di affinità su colonna, è che l'assorbitore a membrana consente rese potenzialmente maggiori della proteina con un tempo di lavorazione ridotto. La scelta di metodi di caratterizzazione appropriati può inoltre ridurre il tempo di lavorazione. Preparare l'assorbitore a membrana seguendo le istruzioni del produttore, assicurandosi che tutte le soluzioni perfuse siano a temperatura ambiente e prefiltrate attraverso un filtro da 0,22 micron. Per iniziare, riempire una siringa da 10 millilitri con soluzione salina tamponata al fosfato di KO o DPBS filtrata a 0,22 micron ed eliminare eventuali bolle d'aria.

Per evitare che l'aria entri mai nel modulo di assorbimento, perfondere DPBS per rimuovere la soluzione di conservazione ed equilibrare immediatamente il modulo di assorbimento prima dell'uso. Filtrare immediatamente il supernatante del coltura cellulare prima di farlo passare attraverso il modulo di assorbimento mediante un'unità di filtrazione sterile da 0,22 micron azionata a vuoto per caricare il modulo di assorbimento con proteina A, aspirare il supernatante del coltura cellulare in una siringa con connessione a baionetta e rimuovere eventuali bolle d'aria per assemblare i materiali e l'attrezzatura. In primo luogo, collegare la siringa all'ingresso del modulo di assorbimento.

Se lo si desidera, collegare un tubo flessibile all'uscita del dispositivo assorbitore a membrana. Posizionare un filtro per siringa da 0,22 micron tra la siringa e il dispositivo assorbitore a membrana. Utilizzare un matraccio o una bottiglia per raccogliere il liquido in uscita dall'assorbitore.

Impostare la pompa per siringa sul flusso volumetrico desiderato, senza superare il flusso raccomandato dal produttore. Perfuere il supernatante della coltura cellulare attraverso l'assorbitore a membrana raccogliendo il flusso in uscita. Ricaricare la siringa con supernatante secondo necessità.

Se lo si desidera, verificare la presenza di proteine nel flusso in uscita mediante citometria a flusso, western blotting o eisa in base alle preferenze del laboratorio; in genere non è necessario ripassare il flusso in uscita per eluire la proteina dall'assorbitore a membrana. In primo luogo, lavare l'assorbitore a membrana con 10 millilitri di DPBS per rimuovere qualsiasi proteina non legata. Eluire la proteina dall'assorbitore a membrana al flusso desiderato.

Utilizzando da 10 a 15 millilitri di tampone di eluizione. Raccogliere l'EIT in una provetta contenente tampone neutralizzante pari al 10% del volume di eluizione. Dopo aver eluito la proteina, rigenerare l'assorbitore a membrana seguendo le istruzioni del produttore.

Riempire l'assorbitore della membrana con etanolo al 20% in DPBS per la conservazione a lungo termine a quattro gradi Celsius. Depositare tutto l'EIT in un'unità filtrante centrifuga con cutoff di peso molecolare di 10 kilodalton.

Seguire le istruzioni del produttore per la dialisi mediante centrifugazione. Il retentato in un'unità di dialisi a piccolo volume con cutoff di peso molecolare di 10 chilodalton potrebbe richiedere l'aggiunta di tampone al materiale dializzato.

Se la precipitazione delle proteine è un problema, risolvere la proteina purificata e gli standard FC sul gel desiderato mediante elettroforesi SDS-PAGE in condizioni riducenti o non riducenti a seconda delle esigenze. Utilizzare un mini gel invece di un mini gel per ridurre al minimo il tempo di corsa; caricare quantità multiple del campione di proteina purificata, inclusi campioni diluiti con DPBS, per assicurare che i segnali delle bande della proteina purificata rientrino nell'intervallo lineare del segnale degli standard FC. Nell'analisi dell'immagine dopo la separazione sul gel, trasferire le proteine dal gel a una membrana di fluoruro di poliolefina in un sistema discontinuo di tampone mediante un apparato di trasferimento semisecco seguendo le istruzioni del produttore; il tempo di trasferimento è tipicamente compreso tra cinque e dieci minuti.

Colorare il gel con il metodo di Kumasi dopo il trasferimento per verificare l'efficienza del trasferimento. Eseguire il blot immuno con anti-FC o anti-IgG coniugati con fosfatasi alcalina o perossidasi di rafano usando un sistema di rilevamento proteico assistito da vuoto. Il tempo per il blot immuno è tipicamente inferiore a un'ora.

Sviluppare il blot immunoistochimico utilizzando il substrato e il metodo scelti. Quantificare la proteina purificata mediante analisi dell'immagine. Eseguire una regressione lineare sui segnali delle bande provenienti dagli standard di FC.

Se il valore di R quadro è superiore a 0,90, utilizzare l'equazione della retta per calcolare la quantità di proteina a partire dal segnale della banda, tenendo conto del diluizione del campione se necessario. Poiché la quantificazione della proteina viene effettuata in base all'fc, correggere il valore per tenere conto delle differenze di peso molecolare tra la proteina e l'fc. Se il valore di R quadro è inferiore a 0,90, ripetere la procedura di western blotting accelerata.

Infine, convalidare la proteina utilizzando saggi funzionali o metodi per rilevare il FC mediante citometria a flusso. È stata utilizzata la western blotting o la citometria a flusso EISA per verificare la presenza di GAL one HFC funzionale nel surnatante della coltura cellulare iniziale, indicata dall'istogramma blu; il mezzo fresco di coltura cellulare, mostrato qui in rosso, è servito come controllo negativo. Sovrapposto a questo istogramma in verde è il flusso in uscita, che indica come l'assorbitore della membrana abbia catturato e trattenuto in modo efficiente GAL one HFC. GAL one HFC è stata eluita dall'assorbitore della membrana a incrementi di un millilitro al minuto, utilizzando un tampone acido a base di ammine, e le frazioni di eluizione neutralizzate sono state successivamente testate per la presenza di GG one HFC funzionale mediante citometria a flusso. Il segnale di GL one HFC è aumentato progressivamente dall'eluato uno, approssimativamente uguale al controllo negativo, fino a un massimo all'EEU tre, per poi diminuire fino a un livello quasi costante agli eluati nove e dieci.

L'EEU finale 10 non ha raggiunto l'equivalenza rispetto al segnale del controllo negativo a causa di una certa ritenzione dell'assorbente per ads del GL one HFC; la quantificazione e caratterizzazione del GL one HFC purificato è stata effettuata mediante un procedimento di western blotting accelerato da trasferimento semisecco e immunoblotting assistito da vuoto. Confrontando il segnale del GA one HFC con gli standard di quantificazione dell'HFC, sono state determinate sia la quantità che la qualità del materiale purificato.

I segnali di GAL one HFC e di GAL one HFC degradato rientravano nell'intervallo degli standard. Le intensità dei segnali delle bande standard di HFC erano linearmente correlate alla quantità di HFC presente. La concentrazione di GAL one HFC purificato, calcolata in base all'HFC, è stata determinata essere di 450 microgrammi per millilitro mediante elaborazione dell'immagine.

Correzione per il peso molecolare di G one HFC. La concentrazione del materiale purificato era di 720 microgrammi per millilitro. Al contrario, troppa quantità di GAL one HFC purificata è stata caricata nelle corsie sei e sette del western blot mostrato qui, generando segnali che hanno saturato o superato l'intervallo degli standard HFC, impedendo così la quantificazione.

In alternativa alla western blotting, la colorazione del gel Kumasi può fungere da controllo di qualità rapido e/o metodo di quantificazione. Si noti la presenza di una banda a circa 10 chilodalton, oltre a bande a circa 25 chilodalton e 40 chilodalton, nel campione degradato di GAL one HFC. Questa banda corrisponde a GAL one HFC degradato che non ha reagito con l'anticorpo di rilevamento utilizzato negli immunoblot.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare proteine chimeriche umane che esprimono FC utilizzando assorbitori a membrana e di come caratterizzare tali proteine in appena quattro ore.