Name: Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-06-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Impara i metodi di migrazione cellulare in vitro con il saggio di chiusura della ferita e il transwell per studiare la motilità e l'invasione. Queste tecniche accessibili facilitano la ricerca in biologia cellulare e oncologia.

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Gli autori ringraziano Mike Myles, Sam Saunders e C.W. Elton dell'ECU Multimedia & Technology Services per aver fornito assistenza nella produzione video. Ringraziamo il sostegno finanziario del North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association e ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (LVY e M.J.R.).

1. Cella Cultura ferita Chiusura Assay <ol><li> Staccare le cellule dalla piastra di coltura tissutale con 0,25% di soluzione di tripsina-EDTA. Cellule pellet in un tubo da 15 ml di centrifugazione, aspirare il surnatante e risospendere le cellule in coltura. Piatto il numero appropriato di cellule in una piastra da 6 pozzetti per il 100% di confluenza in 24 ore. Nota: Le prove possono essere necessari per determinare il tempo e il numero di cellule per raggiungere il 100% di confluenza causa del tipo di cellula e la dimensione del pozzo utilizzato (ad esempio, 1 x 10 6 cellule di melanoma B16F10 vengono seminate in un pozzetto di una 6 pozzetti 24 ore prima generazione ferita). In alternativa, possono essere utilizzate piastre da 12 pozzetti o 24 pozzetti. Nota: Se disponibile, le cellule possono essere seminate in una cultura-Insert (da LLC Ibidi) su un tessuto piastra di coltura trattata rendendo la ferita pre-colato. Una cultura-inserto può proteggere la superficie della piastra di coltura tissutale da danni dalla punta della pipetta. Se una Cultura-Insert viene utilizzato passo omettere1.2. </li><li> In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza) utilizzano una punta di pipetta 200 microlitri per premere saldamente contro la sommità della piastra di coltura tissutale e rapidamente fare una ferita verticale verso il basso attraverso il monostrato cellulare. Un puntale di dimensioni diverse può essere utilizzato per ridurre le dimensioni della ferita che è desiderato. Non usare una forza eccessiva contro la piastra di coltura tissutale con la punta della pipetta in quanto potrebbe danneggiare la superficie. Se la ferita è pre-fuso, questo passaggio può essere omesso. </li><li> Con attenzione aspirare i media e detriti cellulari. Aggiungere lentamente abbastanza terreni di coltura contro la parete bene a coprire il fondo del pozzo e provocare distacchi celle aggiuntive. Dopo la generazione e l&#39;ispezione della ferita una prima immagine dovrebbe essere presa. Posizionare la piastra di coltura tissutale in un incubatore a temperatura appropriata e concentrazione di CO 2 (tipicamente 37 ° C e 5% CO 2). </li><li> In diversi punti del tempo, ad esempio ogni 3 ore, rimuovere la piastra dal incubato e posizionarlo sotto un microscopio invertito per scattare una foto snapshot e per controllare la chiusura della ferita. Se microscopia time-lapse è disponibile, scattare una foto ogni tot numero di minuti (generalmente a partire con ogni 5 minuti) per qualsiasi durata di tempo in temperatura e CO 2 camera controllata. A seconda del tipo di cellula, tempo di chiusura della ferita può variare. </li><li> Per analizzare i risultati di immagini istantanee, misurare la distanza di un lato della ferita all&#39;altro utilizzando una barra di scala. Analizzare e chiaramente presente la chiusura della ferita nel tempo utilizzando un diagramma a dispersione o grafico a barre, ad esempio, la figura 1. </li><li> Per analizzare le immagini time-lapse, di importare le immagini nel software ImageJ (liberamente disponibile a http://rsb.info.nih.gov/ij/) per fare un video. Per fare questo ImageJ aperta, fare clic su File, Importa, e Sequenza d&#39;immagini. Trovare il file con le immagini; fare clic sulla prima foto nel file. Salvare video selezionando File, Salva con nome, e AVI. Cellule che migrano singoli possono essere osservati a characterize movimento direzionale. Inoltre, le caratteristiche morfologiche quali la formazione lamellipodia e bordo di uscita svincolo possono essere studiati come bene (Figura 2 e il video supplementare). </li></ol> 2. Transwell migrazione cellulare e Invasion test <ol><li> In un ambiente sterile (tipicamente una cappa di biosicurezza) staccare le cellule dalla piastra di coltura utilizzando un buffer non enzimatica dissociazione cellulare o 0,25% di soluzione di tripsina-EDTA, cellule pellet per centrifugazione, e aspirare il supporto esistente lasciando le cellule pellet. Risospendere le cellule nel siero mezzi di coltura cellulare gratuito contenente 0,1% di BSA (albumina sierica bovina). Nota: A seconda della linea cellulare indagato 0,25% tripsina-EDTA può influenzare la migrazione cellulare e dell&#39;invasione causa della scissione di vari recettori sulla superficie cellulare 17. Nota: Il numero di cellule per ml dipende dalla dimensione delle celle. Ulteriori test possono essere necessari per trovare una densità di semina che pronisce i migliori risultati. Tipicamente 1 x 10 6 cellule / ml è un buon punto di partenza per la maggior parte dei tipi di cellule quando si utilizza il 24 e Transwell inserire. Esiste una gamma di transwell dimensioni inserto e il numero di cellule aggiunte deve essere regolata per conseguenza. </li><li> Piastra 100 ml di soluzione di cellule sulla parte superiore della membrana filtrante in un inserto transwell e incubare per 10 minuti a 37 ° C e 5% di CO 2 per permettere alle cellule di stabilirsi. Nota: La particolare dimensione dei pori della membrana transwell utilizzato dipende dalla dimensione individuale delle cellule nel campione. Ad esempio, se le cellule sono troppo piccole possono passare attraverso i pori senza la necessità di facilitare la migrazione o se sono troppo grandi non possono essere introdotte attraverso i pori. Ci sono diversi inserti transwell con dimensioni dei pori che variano da 3 micron, 5 micron, e 8 micron per saggi di migrazione cellulare. Gli inserti transwell sono disponibili in commercio da aziende come Corning. Nota: Il transwell msaggio igration può essere facilmente modificato per eseguire il saggio di invasione cellulare. A tale scopo, aggiungere matrice extracellulare (ECM) materiali sopra della membrana transwell e poi aggiungere celle sopra l&#39;ECM. Ad esempio, Matrigel è stato scongelato e liquefatto in ghiaccio, e poi 30-50 ml di Matrigel viene aggiunto a un 24-ben transwell inserire e solidificato in un incubatore a 37 ° C per 15-30 minuti per formare uno strato sottile di gel. Soluzione di cellule viene aggiunto sulla parte superiore del rivestimento Matrigel per simulare invasione attraverso la matrice extracellulare. Nota: Ci sono chiare differenze tra la migrazione delle cellule transwell ed i saggi di invasione delle cellule transwell. Il saggio migrazione cellulare transwell misura la capacità chemiotattica delle cellule verso una chemio-attrattivo. Il saggio di invasione cellulare transwell, invece, misura sia la chemiotassi delle cellule e l&#39;invasione delle cellule attraverso matrice extracellulare, un processo che si trova comunemente in metastasi del cancro o sviluppo embrionale. </li><li> Usando una pipetta, molto carefully aggiungere 600 microlitri della chemio-attractant desiderato nella parte inferiore della camera inferiore in una piastra da 24 pozzetti. Aggiungere la chemio-attrattivo senza spostare l&#39;inserto transwell ed evitare la generazione di bolle. Assicurarsi che il liquido chemio-attractant nel ben inferiore a contatto con la membrana nel pozzo superiore per formare un gradiente chemiotattico. Il tempo di incubazione dipende dal tipo di cellula e la chemio-attrattore utilizzato. Nota: Ulteriori test possono essere necessari per determinare il periodo di incubazione. Nota: Per cellule aderenti, le cellule migrate legheranno verso l&#39;altro lato della membrana 1,8. La quantificazione delle cellule migrate può essere eseguita seguendo i punti 2.4 2.8 (passi 2,4-2,8 non hanno bisogno di essere eseguita in un ambiente sterile). Per le cellule non aderenti, le cellule migrate cadranno in media nella camera inferiore. Il numero di cellule migrate può essere contato utilizzando emocitometro o citofluorimetro 5. </li><li> Rimuovere l&#39;inserto transwell dalla piastra. Utilizzare un applicatore con punta di cotone come numero di volte necessario per rimuovere delicatamente il supporto e le cellule rimanenti che non sono migrati dalla parte superiore della membrana senza danneggiarlo. </li><li> Aggiungere 600-1,000 ml di etanolo al 70% in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. Posizionare l&#39;inserto transwell nel etanolo al 70% per 10 minuti per consentire la fissazione delle cellule. Rimuovere transwell inserto dalla piastra a 24 pozzetti e utilizzare un applicatore con punta di cotone per rimuovere l&#39;etanolo residuo dalla parte superiore della membrana. Lasciare la membrana transwell asciugare (in genere 10-15 minuti). </li><li> Aggiungere 600-1,000 ml di 0,2% cristal violetto in un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti e posizionare la membrana in esso per la colorazione. Incubare a temperatura ambiente per 5-10 minuti. </li><li> Rimuovere delicatamente il violetto cristallo dalla parte superiore della membrana con un puntale o cotone applicatore capovolto. Con molta attenzione, per evitare di lavare le cellule fisse, immergere la membrana in acqua distillata tante volte quanto necessario per rimuovere l&#39;eccesso di viole cristallot. Lasciare la membrana transwell ad asciugare. </li><li> Vista sotto un microscopio invertito e contare il numero di cellule in diverse condizioni di visibilità per ottenere una somma media di cellule che sono migrate attraverso la membrana verso la chemio-attrattiva e attaccati sul lato inferiore della membrana (Figura 3). </li></ol>

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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

La migrazione cellulare è un aspetto importante studiare nella ricerca sul cancro e può anche essere applicato a studi guarigione sviluppo, immunologici e ferita. La coltura cellulare ferita saggio di chiusura e la migrazione delle cellule transwell e invasione saggi di rivelare le informazioni dettagliate dei comportamenti migratori delle cellule e può essere utilizzato per studiare i meccanismi molecolari della migrazione cellulare 1,2,10,14. Il nostro studio ha utilizzato questi saggi di motilità cellulare...

La motilità è una caratteristica essenziale di cellule vive. La migrazione cellulare è coinvolto nella concezione della vita, lo sviluppo embrionale, la risposta immunitaria, e molti processi patologici quali metastasi del cancro e l&#39;infiammazione 1-9. Pertanto, i metodi per lo studio delle cellule comportamento migratorio sono strumenti di ricerca molto utili per una vasta gamma di discipline nelle scienze biomediche, biologia, bioingegneria, e campi correlati. Lo studio della migrazione cellulare nella ricerca sul cancro è di particolare interesse come la principale causa di morte nei pazienti affetti da cancro è correlata alla progressione metastatica. Affinché cancro di diffondersi e diffondere in tutto il corpo, le cellule tumorali devono migrare ed invadere attraverso matrice extracellulare (ECM), intravasate in circolazione sanguigna, collegare a un sito distante, e infine estravasare per formare lontano foci 1,10-12. Vari metodi biologici possono essere utilizzati per studiare questi eventi in dettaglio. La coltura cellulare ferita alla chiusura und la migrazione transwell e invasione saggi sono ampiamente utilizzati nella comunità scientifica 1,10. Questi test possono fornire i dati necessari che possono consentire una comprensione di come un particolare tipo di cellula può migrare spontaneamente o rispondere ad una chemio-attrattiva e direzionalmente migrare verso di essa. Sono stati descritti diversi fenotipi migratori. Cellule possono migrare in forma singola cella come visto in mesenchimali o movimento ameboide simile o dal movimento multicellulare etichettato migrazione collettivo o cella in streaming 13. Il metodo di trasporto utilizzato nel cellule mobili può essere facilmente osservato utilizzando la coltura cellulare saggio chiusura della ferita. Tra i numerosi modi per studiare la migrazione delle cellule, il saggio chiusura della ferita cellulare è uno dei più semplici. Questo metodo è utile per determinare la capacità di migrazione di masse di cellule intere. Quando compiuto un ulteriore passo può essere utilizzato per osservare le caratteristiche morfologiche delle cellule dell&#39;individuo durante la migrazione 14. In seguito all&#39;analisi della chiusura della ferita molti fenotipi possono essere rivelati. Misurazione della distanza chiuso nel tempo, quando si confrontano su un controllo può rivelare cambiamenti di migrazione specifica o un fenotipo migratorio alterata che era sconosciuto in precedenza. Inoltre, la formazione lamellipodium singola cella, coda di svincolo e movimento direzionale possono dare indizi su quello che potrebbe essere compromessa o rafforzata in cellule di interesse 14. La migrazione transwell e analisi d&#39;invasione possono essere usati per analizzare la capacità delle singole cellule di rispondere direzionalmente a vari chemo-attrattivi se sono chemochine, fattori di crescita, lipidi, o nucleotidi 4,5,8,15,16. Può anche valutare la capacità migratoria differenziale a causa della sovra-espressione di un recettore 1,14. Questi saggi possono anche essere utilizzati per identificare e caratterizzare i regolatori chiave della migrazione cellulare come la famiglia delle piccole GTPasi Rho 2. Dopo questi brevi e facilmente accestest sibili, la modalità di migrazione cellulare e la capacità di una cellula di invadere in una matrice 3-D possono anche essere determinate.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modificato Eagle medium (DMEM)</td><td>Gibco</td><td>11995-073</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Gemini</td><td>100106</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4503-50G</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina EDTA 0,25%</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' soluzione salina tamponata con fosfato (DPBS)</td><td>Gibco</td><td>14190-250</td><td></td></tr><tr><td>Crystal violet</td><td>Sigma</td><td>C0775-100G</td><td>Disciolto in acqua allo 0,2%</td></tr><tr><td>Tampone di dissociazione cellulare</td><td>Gibco</td><td>13151-014</td><td></td></tr><tr><td>Incubatore per colture cellulari</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Model # 3145</td></tr><tr><td>Cappa di biosicurezza SterilGARD</td><td>The Baker Company, Inc.</td><td></td><td>Modello # VBM-600</td></tr><tr><td>EVOS Fl microscopio invertito</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>Modello # AMF-4302-US</td></tr><tr><td>Piastra per coltura tissutale</td><td>Becton Dickinson</td><td>353046</td><td>Il numero di catalogo varia a seconda del tipo di piastra di coltura</td></tr><tr><td>Inserto Corning Transwell</td><td>Fisher</td><td>07-200-150</td><td>Il numero di catalogo varia a seconda della dimensione dei pori della membrana</td></tr></tbody></table>

nella migrazione delle cellule in vitro e saggi invasion

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

La migrazione è una proprietà chiave delle cellule vive ed è fondamentale per il normale sviluppo, la risposta immunitaria e i processi patologici come le metastasi del cancro e l'infiammazione. I metodi per esaminare la migrazione cellulare sono molto utili e importanti per un'ampia gamma di ricerche biomediche come la biologia del cancro, l'immunologia, la biologia vascolare, la biologia cellulare e la biologia dello sviluppo. Qui usiamo la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali come esempio e descriviamo due saggi correlati per illustrare i metodi comunemente usati e facilmente accessibili per misurare questi processi. Il primo metodo è il saggio di chiusura della ferita per coltura cellulare in cui viene generato un graffio su un monostrato cellulare confluente. La velocità di chiusura della ferita e la migrazione cellulare possono essere quantificate scattando foto istantanee con un normale microscopio invertito a diversi intervalli di tempo. Il comportamento migratorio cellulare più dettagliato può essere documentato utilizzando il sistema di microscopia time-lapse. Il secondo metodo descritto in questo articolo è il saggio di migrazione e invasione cellulare transwell che misura la capacità della motilità e dell'invasività cellulare verso un gradiente chemio-attrattivo. Il nostro obiettivo è quello di descrivere questi metodi in modo altamente accessibile, in modo che le procedure possano essere eseguite con successo nei laboratori di ricerca, anche solo con una configurazione di base della biologia cellulare.

La chiusura dosaggio ferita e il saggio migrazione delle cellule transwell qui presentata sono stati eseguiti utilizzando cellule di topo B16F10 melanoma come sistema modello. Nel saggio chiusura della ferita, B16F10 cellule sono state seminate in una piastra di coltura tissutale da 6 pozzetti e coltivate al 100% di confluenza in 24 ore. Una ferita di circa 700 micron di larghezza è stata generata utilizzando un puntale e la chiusura della ferita (la migrazione cellulare) è stato registrato utilizzando la microscopia ti...

Comunemente utilizzati, sono descritti metodi altamente accessibili per l&#39;esame migrazione cellulare e l&#39;invasione in vitro. Il primo metodo è il saggio chiusura della ferita cella che misura la motilità cellulare. Il secondo metodo è il transwell migrazione e invasione test che valuta la chemiotassi e la capacità invasiva delle cellule.

Nella migrazione delle cellule in vitro e saggi Invasion

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

La migrazione cellulare è un processo altamente dinamico. È importante per diverse funzioni fisiologiche, come lo sviluppo embrionale normale, la risposta immunitaria e anche i processi patologici. Ad esempio, la metastasi tumorale e l'infiammazione.Lo studio della migrazione cellulare è importante per un'ampia gamma di scienze biomediche, come la biologia del cancro, l'immunologia, la biologia cellulare e la biologia dello sviluppo. La migrazione cellulare può essere suddivisa in quattro passaggi meccanicamente distinti: estensione, formazione di nuove adesioni, contrazione del corpo cellulare e, infine, distacco della coda. Di seguito descriveremo due semplici metodi per studiare con attenzione la natura dinamica della migrazione cellulare in vitro.Il primo metodo è un saggio di coltura cellulare di tipo "enclosure". Questo saggio è comunemente utilizzato ed è altamente accessibile anche per laboratori dotati delle attrezzature più basilari. Il saggio di coltura cellulare di tipo "enclosure" è un metodo in cui, mediante l'uso di una punta di pipetta, vengono prodotti dei graffi su un monolayer cellulare confluenziale, che nel tempo richiuderà la ferita precedentemente creata.La dinamica della migrazione cellulare può essere studiata in dettaglio utilizzando la fotografia a intervalli di tempo o acquisendo immagini singole. È possibile misurare la distanza percorsa e calcolare, nel tempo, la velocità con cui le cellule si sono spostate. Un secondo metodo correlato, il saggio di migrazione e invasione cellulare con camera a transwell, è altrettanto accessibile e viene comunemente impiegato dopo il seeding delle cellule su una membrana transwell.Comunemente noto anche come camera di Boyden. Le loro capacità migratorie verso un gradiente di chemiotattici possono essere misurate. Entrambe queste procedure sperimentali estremamente accessibili sono di grande valore in molteplici settori della ricerca.Capitolo due, contenimento delle colture cellulari, saggio. Salve, mi chiamo Calvin Justice. Sono uno studente laureato nel laboratorio del dottor Yang del Dipartimento di Oncologia della Brody School of Medicine presso l'East Carolina University.Oggi dimostrerò due procedure che misurano le capacità di migrazione e invasione delle cellule in vitro. Iniziamo ora l'allestimento della coltura cellulare. Saggio sulle cellule utilizzate nell'allestimento della coltura cellulare.Il saggio può essere eseguito in piastre per coltura tissutale utilizzando tecniche convenzionali di coltura cellulare. Per iniziare, aspirare il mezzo di crescita utilizzato per coltivare le cellule, lavare una volta con PBS, quindi aggiungere due millilitri di tripsina 0,25% EDTA alla piastra e inserirla nell'incubatore per tre minuti. Rimuovere la piastra dall'incubatore e aggiungere tre millilitri di DMM integrato con 10% FBS.Rimuovere il mezzo dalla piastra e trasferirlo in un tubo conico da 15 millilitri. Centrifugare per cinque minuti a 1500 giri al minuto. Dopo la centrifugazione, risospendere le cellule in due millilitri di DMM integrato con il 10% di FBS.Quindi contare le cellule utilizzando un emocitometro. Al termine del conteggio, seminare un numero di cellule che raggiungerà la confluenza entro 24 ore. Inserire la piastra nell'incubatrice per 24 ore per consentire l'adesione e la distensione delle cellule.Rimuovere la piastra dall'incubatore e osservarla al microscopio per assicurarsi che sia confluenza al 100%. Successivamente, all'interno della cappa a sicurezza biologica, utilizzare la punta della pipetta con attenzione, senza danneggiare la piastra per colture cellulari, per creare una ferita dalla parte superiore del pozzetto fino al fondo. Dopo aver creato la ferita con la punta della pipetta, aspirare il mezzo e lavare delicatamente con due millilitri di mezzo di crescita.In questo caso, utilizzare DMEM integrato con il 10% di FCS per eliminare eventuali detriti residui; quindi, aspirare nuovamente il mezzo. Infine, aggiungere due millilitri di mezzo di crescita e, se disponibile, inserire la preparazione in una camera controllata per temperatura e CO2 posizionata al di sotto del microscopio. Prevedere la possibilità di acquisizione mediante fotografia a intervalli nel caso in esame.La funzione di ripresa con time-lapse non è disponibile. Scattare un'immagine iniziale della posizione del segno e della pozzetta, quindi inserire la piastra nell'incubatrice. Se è disponibile la fotografia con time-lapse, impostare le relative funzionalità sul microscopio.Imposteremo l'intervallo temporale su 16 ore. Dopo 16 ore, con un'immagine acquisita ogni cinque minuti, la piastra può essere rimossa dalla camera e le immagini ottenute durante l'intera durata dell'esperimento possono essere salvate su una chiavetta USB. Inserire l'USB nel computer e aprire il programma Image J.Fare clic sul file. Importare una sequenza di immagini. Individuare le immagini acquisite durante l'esperimento.Fare clic sul primo file e poi su apri. Verranno visualizzate le opzioni per la sequenza successiva. Selezionare la prima immagine nell'elenco delle foto e inserire gli incrementi necessari per il video.Ora verranno visualizzate le opzioni del lettore VI. Scegliere l'opzione più adatta, fare delle prove e fare clic su OK. Il programma Image J creerà ora un video; salvare il video, fare clic su File, quindi su Salva come VI o su qualsiasi altra opzione che possa essere adatta al proprio esperimento.Il video può quindi essere analizzato nello studio della cellula per individuare caratteristiche relative alla migrazione che potrebbero risultare di interesse. Tra le caratteristiche possibili da studiare vi sono l'estensione podale, la contrazione del corpo cellulare e il distacco della coda. In assenza di fotografia con perdita di tempo, la piastra che era stata posta nell'incubatrice per 12-16 ore dopo l'immagine iniziale può essere rimossa.L'area che è stata inizialmente fotografata deve essere fotografata nuovamente e deve essere aggiunta una barra di scala per ulteriori misurazioni. Dopo aver misurato la larghezza iniziale della ferita presente nella prima foto, la larghezza misurata in pixel deve essere convertita in micrometri utilizzando una barra di scala. Successivamente, la larghezza della ferita nelle immagini finali deve essere misurata in pixel nella stessa area di prima e, ancora una volta, deve essere convertita in micrometri utilizzando la barra di scala.L'ultimo passaggio consiste nel sottrarre la larghezza finale da quella iniziale per ottenere la larghezza totale di chiusura della ferita nel periodo di tempo stabilito. La distanza finale di migrazione misurata deve essere divisa per il tempo assegnato, al fine di calcolare la velocità di chiusura in micrometri all'ora. Il metodo dello scatto può essere ripetuto in numerose pozzette di dimensioni diverse per un'analisi più quantitativa della migrazione cellulare, capitolo tre, saggio di migrazione cellulare trans-pozzetta e innovazione.Per iniziare, è necessario coltivare innanzitutto le cellule di interesse in una piastra per colture cellulari per la procedura. Successivamente, lavare una volta con PBS e staccare le cellule di interesse dalla piastra per colture cellulari utilizzando un buffer di dissociazione cellulare o tripsina. Inoltre, si consiglia di consultare la letteratura riguardo agli effetti della tripsina sulle cellule in studio, poiché il suo utilizzo potrebbe influenzare i risultati.Dopo la centrifugazione a 1500 giri al minuto per cinque minuti, rimuovere e aspirare il mezzo presente, quindi risospendere le cellule in BSA allo 0,1%. Aprire la confezione dell'inserzione Transwell e posizionarla nel pozzetto della dimensione corrispondente. Se si sta eseguendo prima il saggio di invasione Transwell, aggiungere il matrigel sulla parte superiore dell'inserzione e incubare per 30 minuti prima di passare al passaggio successivo.Piastrare 100 microlitri di soluzione cellulare sulla membrana del transwell. Incubare per 10 minuti per consentire alle cellule di depositarsi. Il numero di cellule piastrate dipende dal tipo cellulare e potrebbero essere necessari esperimenti successivi.Per determinare questo valore, utilizzare una pipetta per aggiungere con attenzione l'attrattante chimico desiderato sotto l'inserto fino al fondo della pozzetta. Evitare di rimuovere l'inserto. Il tempo di incubazione dipende dal tipo cellulare.Rimuovere l'inserzione transwell dopo l'incubazione e utilizzare un applicatore con punta di cotone tante volte quante necessarie per rimuovere delicatamente l'eccesso di mezzo e le cellule che non hanno migrato attraverso la membrana dalla sua superficie superiore. Prestare attenzione a non danneggiare la membrana. Aggiungere da 600 a 1000 microlitri di etanolo al 70% nella camera inferiore di un pozzetto vuoto.Posizionare l'inserto nel pozzetto contenente etanolo al 70% e incubare per 10 minuti per consentire la fissazione delle cellule. Utilizzare nuovamente un applicatore con punta di cotone tante volte quante necessarie per rimuovere l'etanolo residuo dalle cellule che non hanno migrato attraverso la membrana dalla parte superiore della membrana stessa. Aggiungere da 600 a 1000 microlitri di violetto di cristallo allo 0,2% in un pozzetto e posizionarvi l'inserto per la colorazione cellulare.Incubare per 10 minuti. Rimuovere generalmente l'eccesso di colorante violetto di cristallo dalla superficie della membrana. Quindi, con molta attenzione per evitare di lavare via le cellule migrate, immergere la membrana nell'acqua distillata tante volte quante necessarie per rimuovere il violetto di cristallo residuo.Lasciare asciugare la membrana per osservare le cellule al microscopio. La membrana può essere rimossa con cura utilizzando un bisturi e posizionata su un vetrino coprioggetto, oppure è possibile osservare le cellule mantenendo gli inserti all'interno della piastra. Utilizzando un microscopio invertito, è necessario acquisire un'immagine di diversi campi visivi.Per ottenere una rappresentazione accurata del numero di cellule migrate, il numero di cellule può essere contato utilizzando lo strumento di conteggio di Adobe Photoshop. I dati raccolti possono essere inseriti in un grafico a barre per rappresentare al meglio i risultati. Capitolo quattro, risultati rappresentativi.Successivamente, vi illustreremo alcuni risultati rappresentativi ottenuti dall'assay di coltura cellulare in ambiente confinato e dall'assay di migrazione cellulare in transwell. Due metodi correlati per esaminare la motilità cellulare, come descritto in questo video, che inizieremo con l'assay di coltura cellulare in ambiente confinato. Qui mostriamo immagini scattate a 0, 4, 8 e 12 ore.Come si può notare, dopo la creazione della ferita è possibile acquisire immagini e, nel corso del tempo, misurare la distanza di chiusura della ferita. Presentiamo i nostri dati mediante un grafico a dispersione e, utilizzando il metodo precedentemente descritto, determiniamo la velocità di chiusura della ferita nel tempo. Inoltre, la migrazione individuale delle cellule può essere studiata in dettaglio mediante fotografia a intervalli di tempo.In questo caso, si esegue uno zoom su singole cellule durante la chiusura della ferita, se ne segue la migrazione nel tempo e se ne osservano le caratteristiche del movimento, come l'estensione del bordo leader, la retrazione della coda e il movimento generale, che possono essere analizzate in dettaglio. Ora verranno esaminati alcuni risultati del saggio di migrazione cellulare trasversale. Qui mostriamo due immagini acquisite della membrana a seguito del saggio di migrazione cellulare in transwell.La prima immagine mostra i risultati ottenuti in assenza di chemiotattante, in cui si è verificata una migrazione cellulare minima o nulla attraverso la membrana. La seconda immagine mostra i risultati ottenuti in presenza di chemiotattante, in cui si è osservata una maggiore migrazione cellulare verso la membrana. A destra, presentiamo i risultati della quantificazione del nostro esperimento mediante un grafico a barre con barre di errore che rappresentano l'errore standard.Capitolo cinque, conclusione: i dati accumulati in seguito al saggio di chiusura culturale cellulare nel saggio di migrazione o invasione cellulare trasversale rivelano le capacità migratorie delle cellule in un ambiente 2D o in un ambiente 3D. Questi risultati possono essere confrontati con altri risultati per rivelare potenzialmente dati precedentemente sconosciuti e possono inoltre correlare con altri test biochimici. Questi due saggi comunemente utilizzati e strettamente correlati sono preziosi e facilmente accessibili anche nelle più semplici configurazioni di laboratorio di biologia cellulare.Ringraziamo per aver partecipato oggi e le auguriamo buona fortuna nei suoi futuri impegni scientifici.

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