L’interferenza dell’RNA (RNAi) è una tecnica ampiamente utilizzata in cui l’RNA a doppio filamento viene introdotto esogenamente in un organismo, causando l’abbattimento di un gene bersaglio. Nel nematode, C. elegans, l’RNAi è particolarmente facile ed efficace perché può essere erogato semplicemente alimentando i batteri vermi che esprimono RNA a doppio filamento (dsRNA) che è complementare a un gene di interesse. In primo luogo, questo video introdurrà il concetto di interferenza dell’RNA e spiegherà come provoca l’abbattimento mirato del gene. Quindi, dimostreremo un protocollo per l’uso di RNAi in C. elegans, che include la preparazione dei batteri e delle piastre di vermi RNAi, la coltura dei vermi e come valutare gli effetti dell’RNAi sui vermi. L’RNAi viene spesso utilizzato per eseguire screening genetici inversi al fine di rivelare quali geni sono importanti per svolgere specifici processi biologici. Inoltre, gli screening genetici inversi automatizzati consentono l’abbattimento e l’analisi efficienti di una vasta collezione di geni. Infine, RNAi è spesso usato per studiare lo sviluppo di C. elegans. Dalla sua scoperta, gli scienziati hanno usato l’RNAi per fare enormi progressi nella comprensione di molti fenomeni biologici.
L’interferenza dell’RNA, o RNAi, è una tecnica ampiamente utilizzata in cui l’RNA a doppio filamento viene introdotto in un organismo, con conseguente silenziamento genico mirato. La scoperta vincitrice del Nobel dell’interferenza dell’RNA ha permesso ai ricercatori di silenziare qualsiasi gene C. elegans per determinarne la funzione. Possiamo indurre RNAi in C. elegans preparando prima piastre con E. coli che esprimono il gene bersaglio dsRNA, che i vermi mangeranno. Quindi, i vermi del 4 ° stadio larvale vengono trasferiti alle piastre RNAi e autorizzati a depostare le uova. Nella fase desiderata di sviluppo la progenie viene raccolta e valutata per fenotipi.
La tecnologia RNAi è spesso utilizzata in C. elegans per condurre screening genetici inversi, schermi automatizzati ad alto rendimento e come strumento per studiare i processi di sviluppo. In questo video, spiegheremo il concetto di interferenza dell’RNA, dimostreremo come utilizzare la tecnica RNAi in C. elegans e discuteremo di come gli scienziati stanno usando l’RNAi come strumento per comprendere meglio i processi biologici diffusi.
Iniziamo mostrandoti prima come funziona l’interferenza dell’RNA. Nel caso di C. elegans, i vermi sono nutriti con batteri, che sono stati trasformati con plasmidi che codificano per RNA a doppio filamento complementare al gene che si desidera silenziare. Come accennato in precedenza, C. elegans si nutrirà dei batteri trasformati. Attraverso un meccanismo attualmente sconosciuto, il dsRNA entra nel tessuto C. elegans una volta ingerito.
Una volta all’interno della cellula, l’enzima Dicer scinde l’RNA a doppio filamento in RNA interferente corto, o siRNA, che è lungo tra 21 e 23 nucleotidi. Successivamente, il siRNA si associa al complesso di silenziamento indotto dall’RNA, noto anche come “RISC”, e viene srotolato. Quindi, il complesso siRNA/RISC lega l’mRNA bersaglio tramite accoppiamento di basi complementari. Questo porta alla degradazione dell’mRNA, abbattendo così quel gene.
Prima di iniziare la procedura, i batteri che esprimono l’RNA a doppio filamento di interesse devono essere preparati. Librerie di batteri che contengono plasmidi codificanti dsRNA per migliaia di geni sono disponibili in commercio. Altrimenti, la sequenza del gene bersaglio deve essere clonata in un plasmide utilizzando tecniche di clonazione standard. Il plasmide contiene un gene per la resistenza all’antibiotico ampicillina, che può essere utilizzato per selezionare le colonie batteriche che contengono il plasmide.
Successivamente, utilizzare tecniche standard per trasformare il plasmide che codifica il dsRNA di interesse nel ceppo (DE3) di batteri E. coli che esprimeranno l’RNA a doppio filamento. Inoltre, trasformare i batteri con un plasmide vuoto come controllo. È importante sottolineare che il ceppo di E. coli utilizzato in questi esperimenti manca di RNA polimerasi III, che altrimenti digerirebbe l’RNA a doppio filamento. Questo batterio contiene anche un gene inducibile IPTG per la DNA polimerasi T7, che trascrive il dsRNA nel plasmide. Infine, i batteri (DE3) sono resistenti sia alla tetraciclina che alla carbenicillina, per mantenere l’espressione della RNA polimerasi III e prevenire la crescita batterica indesiderata.
Distribuire i batteri trasformati HT115 (DE3) su piastre di agar LB contenenti tetraciclina da 12,5 μg / ml e 25 μg / ml di carbenicillina. Incubare durante la notte a 37 °C e la mattina successiva saranno presenti colonie batteriche sulle piastre. Quindi, selezionare una singola colonia di batteri e aggiungerla a 1 ml di brodo LB contenente 100 μg / ml di ampicillina per selezionare i batteri contenenti il plasmide. Incubare durante la notte a 37 °C con agitazione. Dopo l’incubazione notturna, aggiungere 5 ml di brodo LB contenente 100 μg/ml di ampicillina alla coltura e incubare per altre 4-6 ore a 37 °C.
Una volta che i batteri sono pronti, le piastre dei vermi RNAi devono essere preparate per l’alimentazione. Le piastre di vermi RNAi contengono: agar, acqua, carbenicillina, miscela media di vermi e IPTG per indurre la DNA polimerasi T7 nei batteri che trascrivono il dsRNA nel plasmide. Aggiungere 0,5 ml di coltura batterica alle piastre di vermi RNAi e incubare durante la notte a 37 °C, creando un prato batterico.
Prima di aggiungere vermi alle placche RNAi, è importante sincronizzare lo stadio di sviluppo del verme, in modo che eventuali differenze osservate nel fenotipo non siano un artefatto dello stadio di sviluppo. Al fine di sincronizzare le fasi di sviluppo, prima sterilizzare a fiamma un plettro di filo di platino.
Utilizzare il worm pick per aggiungere vermi L4 a ciascuna piastra RNAi e incubare durante la notte a 20 ° C, consentendo loro di diventare giovani adulti che depongono le uova. Quindi, trasferire i giovani adulti nella nuova piastra RNAi e incubare per 6-8 ore a 20 ° C, durante le quali vengono deposte le uova. Una volta rimossi tutti gli adulti, queste uova saranno sincronizzate in modo dello sviluppo. Infine, consentire ai vermi di crescere su piastre RNAi fino a quando non hanno raggiunto la fase di sviluppo di interesse per l’analisi.
Per visualizzare i vermi, è necessario preparare una diapositiva con un tampone di agar al 4%. In primo luogo, nastro 2 vetrini con nastro adesivo, creando distanziali che garantiscono uno spessore uniforme del tampone di agar. Posizionare una slitta di vetro pulita tra i due distanziali e un pipetto di circa 150 μl di agar fuso al 4% sul vetrino. Coprire rapidamente l’agar fuso con un ulteriore vetrino perpendicolare ai distanziali. Separare delicatamente le diapositive e il tampone di agar sarà aderito a una delle diapositive.
Quindi, aggiungere 10 μl di un anestetico come l’azide di sodio al tampone di agar per immobilizzare gli animali. Utilizzando un plettro in filo di platino, trasferire i vermi al tampone di agar con anestetico e aggiungere uno slip di copertura. Infine, osserva i vermi al microscopio. Confronta i vermi che hanno avuto l’abbattimento del gene RNAi con i controlli e nota le differenze di dimensioni, stadio di sviluppo, morfologia, modelli di localizzazione di proteine marcate fluorescentemente e altri potenziali fenotipi.
Una delle applicazioni più preziose dell’interferenza dell’RNA è la capacità di eseguire facilmente screening genetici inversi. Uno screening genetico inverso è un approccio per scoprire la funzione genica abbattendo una raccolta nota di geni e valutando il risultato fenotipico. Ad esempio, i ricercatori possono utilizzare una libreria di batteri che esprimono dsRNA per quasi tutti i geni nel genoma di C. elegans. Questi batteri vengono coltivati su piastre multi-pozzo e alimentati ai vermi. Quindi, gli effetti fenotipici dell’abbattimento dell’RNAi di molti geni possono essere valutati, fornendo informazioni sulle normali funzioni geniche in vivo.
Gli screening genetici automatizzati sono un tipo di schermo genetico inverso che ha un rendimento estremamente elevato. Negli screening genetici automatizzati, l’intero genoma di C. elegans può essere abbattuto molto facilmente utilizzando la gestione robotica delle migliaia di cloni batterici e utilizzando strumenti specializzati per l’analisi quantitativa.
Ad esempio, i vermi che esprimono un reporter fluorescente transgenico per il gene peptidico antimicrobico nlp 29, sono soggetti all’abbattimento RNAi di migliaia di geni tramite alimentazione batterica. Allo stesso tempo, i vermi vengono introdotti nelle spore fungine. Quindi, è possibile valutare la risposta peptidica antimicrobica al fungo.
Lo sviluppo di C. elegans è spesso studiato utilizzando RNAi. Gli scienziati possono utilizzare l’interferenza dell’RNA per abbattere qualsiasi gene (o raccolta di geni) di interesse e valutare esattamente come quel gene influisce sui processi durante lo sviluppo e / o i tempi di sviluppo. Ad esempio, l’abbattimento dell’RNAi può rivelare geni che ritardano lo sviluppo quando abbattuti o geni coinvolti nello sviluppo degli organi.
Hai appena visto l’introduzione di JOVE all’interferenza dell’RNA in C. elegans. Abbiamo esaminato come funziona l’interferenza dell’RNA e come utilizzare l’interferenza dell’RNA in C. elegans tramite alimentazione batterica. L’interferenza dell’RNA è uno strumento prezioso per gli schermi genetici inversi, compresi gli schermi automatizzati ad alto rendimento, ed è anche uno strumento utile per studiare lo sviluppo. Grazie per l’attenzione!
RNA interference, or RNAi, is a widely used technique in which double stranded RNA is introduced to an organism, resulting in targeted gene silencing. The Nobel winning discovery of RNA interference allowed researchers to silence any C. elegans gene in order to determine its function. We can induce RNAi in C. elegans by first preparing plates with E. coli that express target gene dsRNA, which the worms will eat. Then, 4th larval stage worms are transferred to the RNAi plates and allowed to lay eggs. At the desired stage of development the progeny are collected and scored for phenotypes.
RNAi technology is frequently used in C. elegans to conduct reverse genetic screens, automated high throughput screens, and as a tool to study developmental processes. In this video, we will explain the concept of RNA interference, demonstrate how to use RNAi technique in C. elegans, and discuss how scientists are using RNAi as a tool to better understand widespread biological processes.
Let’s begin by first showing you how RNA interference works. In the case of C. elegans, the worms are fed bacteria, which have been transformed with plasmids that code for double stranded RNA complementary to the gene you want to silence. As mentioned previously, C. elegans will feed on the transformed bacteria. Through a currently unknown mechanism, dsRNA enters C. elegans tissue once ingested.
Once inside the cell, the enzyme Dicer cleaves the double stranded RNA into short interfering RNA, or siRNA, which is between 21 and 23 nucleotides long. Next, the siRNA associates with the RNA induced silencing complex, also known as “RISC”, and becomes unwound. Then, the siRNA/RISC complex binds the target mRNA via complementary base pairing. This leads to the degradation of the mRNA, thereby knocking down that gene.
Before beginning the procedure, the bacteria expressing the double stranded RNA of interest need to be prepared. Libraries of bacteria that contain dsRNA-encoding plasmids for thousands of genes are commercially available. Otherwise, the target gene sequence needs to be cloned into a plasmid using standard cloning techniques. The plasmid contains a gene for resistance to the antibiotic ampicillin, which can be used to select for bacterial colonies that contain the plasmid.
Next, use standard techniques to transform the plasmid encoding your dsRNA of interest into the (DE3) strain of E. coli bacteria that will express the double-stranded RNA. Also, transform the bacteria with an empty plasmid as a control. Importantly, the strain of E. coli used in these experiments lacks RNA polymerase III, which would otherwise digest double stranded RNA. This bacteria also contains an IPTG inducible gene for T7 DNA polymerase, which transcribes the dsRNA in the plasmid. Lastly, the bacteria (DE3) are both tetracycline and carbenicillin resistant, to maintain RNA polymerase III expression and prevent unwanted bacterial growth.
Spread the transformed HT115(DE3) bacteria on LB agar plates containing 12.5 μg/ml tetracycline and 25 μg/ml carbenicillin. Incubate overnight at 37 °C and the next morning bacterial colonies will be present on the plates. Then, select a single bacteria colony, and add it to 1 ml of LB broth containing 100 μg/ml of ampicillin to select for bacteria containing the plasmid. Incubate overnight at 37 °C with agitation. After the overnight incubation, add 5 ml of LB broth containing 100 μg/ml of ampicillin to the culture, and incubate for an additional 4-6 hours at 37 °C.
Once the bacteria are ready, RNAi worm plates need to be prepared for feeding. RNAi worm plates contain: agar, water, carbenicillin, Worm medium mix, and IPTG to induce the T7 DNA polymerase in the bacteria that transcribes the dsRNA in the plasmid. Add 0.5 ml of bacteria culture to RNAi worm plates and incubate overnight at 37 °C, creating a bacterial lawn.
Before adding worms to the RNAi plates, it is important to synchronize the developmental stage of the worm, so that any observed differences in phenotype are not an artifact of the developmental stage. In order to synchronize the developmental stages, first flame-sterilize a platinum wire pick.
Use the worm pick to add L4 worms to each RNAi plate, and incubate overnight at 20 °C, allowing them to become young egg laying adults. Next, transfer young adults to new RNAi plate and incubate for 6-8 hours at 20 °C, during which eggs are laid. Once all the adults are removed, these eggs will be developmentally synchronized. Finally, allow worms to grow on RNAi plates until they have reached the developmental stage of interest for analysis.
In order to visualize the worms, a slide must be prepared with a 4% agar pad. First, tape 2 glass slides with labeling tape, creating spacers which ensure uniform thickness of the agar pad. Place a clean glass slide between the two spacers and pipet about 150 μl of 4% molten agar onto the slide. Quickly cover the molten agar with additional slide perpendicular to the spacers. Gently separate the slides and the agar pad will be adhered to one of the slides.
Next, add 10 μl of an anesthetic such as sodium azide to the agar pad to immobilize the animals. Using a platinum wire pick, transfer worms to the agar pad with anesthetic and add a cover slip. Finally, observe worms under a microscope. Compare worms who have had RNAi gene knockdown with controls, and note differences in size, developmental stage, morphology, localization patterns of fluorescently tagged proteins, and other potential phenotypes.
One of the most valuable applications of RNA interference is the ability to easily perform reverse genetic screens. A reverse genetic screen is an approach to discover gene function by knocking down a known collection of genes and assessing the phenotypic result. For example, researchers can use a library of bacteria that express dsRNA for nearly all the genes in the C. elegans genome. These bacteria are cultured on multi-well plates and fed to the worms. Then, the phenotypic effects of the RNAi knockdown of many genes can be assessed, giving insight into the normal in vivo gene functions.
Automated genetic screens are a type of reverse genetic screen that are extremely high throughput. In automated genetic screens, the entire C. elegans genome can be knocked down very easily by using robotic handling of the thousands of bacterial clones, and using specialized instruments for quantitative analysis.
For example, worms expressing a transgenic fluorescent reporter for the anti-microbial peptide gene nlp 29, are subject to RNAi knockdown of thousands of genes via bacterial feeding. At the same time, the worms are introduced to fungal spores. Then, the anti-microbial peptide response to fungus can be assessed.
C. elegans development is frequently studied using RNAi. Scientists can use RNA interference to knock down any gene (or collection of genes) of interest and assess exactly how that gene affects processes during development and/or developmental timing. For example, RNAi knockdown may reveal genes that delay development when knocked down, or genes involved in organ development.
You’ve just watched JOVE’s introduction to RNA interference in C. elegans. We reviewed how RNA interference works and how to use RNA interference in C. elegans via bacterial feeding. RNA interference is a valuable tool for reverse genetic screens, including automated high throughput screens, and is also a useful tool for studying development. Thanks for watching!
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