Name: Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 11 s
Description: Impara a preparare i gangli di Aplysia californica per registrare le proprietà elettrofisiologiche di singoli neuroni identificati e analizzare l'espressione genica mediante PCR quantitativa.

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Ringraziamo sinceramente la Whitehall Foundation per il supporto finanziario e i fondi di avvio dello Scripps Research Institute per aver svolto questo lavoro.

1. Preparazione di gangli addominali, misurazioni elettrofisiopatiche e isolamento di singoli neuroni identificati dal ganglio addominale di Alisia californica
<ol><li>Mantenere Aplysia nell'acquario di laboratorio con acqua di mare artificiale circolante (ASW) a 16 °C in condizioni di luce:buio 12:12.</li>
	<li>Isolamento del ganglio addominale.<ol>
<li>Anestetizzare gli animali iniettando soluzione mgcl2 da 380 mM per 5-10 minuti (equivalente al 30-35% del peso corporeo dell'animale).</li>
		<li>Identificare il ganglio addominale in base alla sua posizione nel sistema nervosocentrale 24,28.</li>
		<li>Rimuovere i gangli mediante intervento chirurgico e conservare immediatamente in acqua di mare artificiale composta da NaCl da 450 mM, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattamento proteasi.<ol>
<li>Incubare il ganglio addominale per 30 minuti a 34 °C±0,5 in una piastra di Petri con proteasi dello 0,1% (dispasi) diluita nell'ASW sopra descritta. NOTA: La quantità di proteasi utilizzata deve essere standardizzata con l'età e il peso degli animali. In generale, gli animali più vecchi e più grandi richiederebbero più proteasi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimozione della cannalia ganglia.<ol>
<li>Dopo il trattamento enzimatico, fissare i gangli alla base di Silicone di Sylgard di una camera cellulare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e per infusione con ASW (portata: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2 ). NOTA: Al fine di aumentare la visibilità dei neuroni identificati, posizionare il ganglio sulla parte superiore di un cilindro di vetro in policarbonato (Figura 1) (diametro Ø = camera cellulare modificata da 2 mm) che può essere facilmente illuminato dal basso utilizzando uno stereomicroscopio binoculare con ingrandimento 20X e 40X.</li>
		<li>Rimuovere con cura la toraia dal ganglio usando forcep e microscissori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registrazione elettrofisiologia simultanea da due neuroni.<ol>
<li>Identificare il neurone di interesse.</li>
		<li>Impalare il neurone con un singolo microelettrodo acuto intracellulare con resistenza 10-15 MΩ riempita con soluzione di 3 M KCl.</li>
		<li>Registra l'attività neuronale (passaggio a banda 10 kHz) usando un sistema di registrazione intracellulare.</li>
		<li>Elaborare i dati di registrazione utilizzando software di elettrofisiologia come Axograph. NOTA: Si può facilmente effettuare la registrazione da più neuroni. I neuroni L7, L11 o R15 e R2 sono facilmente identificabili in base alla loro posizione. Per la registrazione simultanea da due neuroni L7 e R15 (Figura 2) sono necessari due amplificatori e due micromanipolatori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicazione di farmaci.<ol>
<li>Applicare il farmaco di scelta nella camera cellulare con pipettazione delicata o iniettare direttamente nei neuroni.</li>
		<li>Effettuare misurazioni elettrofisiopatiche. NOTA: A seconda dell'obiettivo sperimentale, si potrebbero misurare diversi parametri elettrofisiologici dei neuroni come i cambiamenti nel potenziale di membrana (MP) o nel potenziale di azione (AP) prima, durante e dopo l'applicazione del farmaco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento di singoli neuroni.<ol>
<li>Al termine degli esperimenti elettrofisiologici, interrompere la perfusione di ASW e lavare il ganglio con etanolo al 100%.  L'esposizione all'etanolo pietrifica i neuroni e, usando forcep fini, rende facile rimuovere i singoli neuroni senza danneggiare altri neuroni dal ganglio.</li>
		<li>Rimuovere singoli neuroni sotto uno stereomicroscopio e trasferirli in un piccolo tubo Eppendorf contenente reagente di estrazione dell'RNA ghiacciato da 500 μl. Singoli neuroni isolati possono essere conservati nel reagente di estrazione dell'RNA a -80 °C per analisi future.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento dell'RNA dai singoli neuroni e analisi dell'espressione genica da parte della PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)
<ol><li>Precauzioni per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA: Le ribonucleasi (RNasi) degradano l'RNA e sono enzimi molto stabili e attivi. Durante la gestione degli RNA, a seguire le procedure seguenti.<ol>
<li>Pulire l'area di lavoro e gli strumenti con agenti disattivanti RNasi.</li>
		<li>Indossare i guanti in ogni momento durante la manipolazione dell'RNA e cambiare spesso i guanti.</li>
		<li>Utilizzare solo plastica priva di RNasi per gestire gli RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolare l'RNA totale da singoli neuroni:<ol>
<li>Il protocollo Trizol standard per l'isolamento dell'RNA può essere utilizzato per isolare gli RNA da singoli neuroni. Aggiungere brevemente il 20% v/v di cloroformio al Trizolo, mescolare bene con un breve vortice.</li>
		<li>Posizionare i tubi sul rotatore per 10 min a 4 °C. Ruotare la miscela Trizolo-Cloroformio a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere la fase acquosa e trasferirlo in un tubo fresco.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di acetato di sodio (pH 5.5) ad una concentrazione finale di 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue e 2,5 volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA.</li>
		<li>Mescolare bene i campioni e incubare a -80 °C durante la notte.</li>
		<li>Ruotare i campioni a 12.000 x g per 20 min a 4 °C e un piccolo pellet blu sarà visibile nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e lavare il pellet con 850 μl di etanolo ghiacciato al 75% a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante con cura e asciugare all'aria il pellet di RNA per 7-10 minuti, massimo. NOTA: Assicurarsi che l'RNA non sia lasciato a lungo asciutto come oltre - asciugareil pellet di RNA rende la solubilizzazione molto difficile.
</li>
		<li>Una volta essiccato, rimescolare il pellet di RNA in 10 μl di acqua libera di RNAse e determinare la concentrazione di RNA. NOTA: Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. Quando non si utilizza subito, conservare l'RNA a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>sintesi dell'aRNA da singoli neuroni:<ol>
<li>Amplificare l'RNA (uno o due turni a seconda dell'obiettivo sperimentale) utilizzando il sistema di amplificazione dell'RNA lineare disponibile in commercio. NOTA: L'RNA totale dei singoli neuroni variava da ~10-60 ng. La resa prevista del primo ciclo di amplificazione è di ~100-300 ng e il secondo ciclo di amplificazione è ~0,8-1,5 μg di RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Trascrizione inversa dell'RNA:<ol>
<li>Per generare cDNA dall'aRNA, utilizzare 1,0 μg di aRNA in 20 μl di una reazione di trascrizione inversa. Diversi kit sono disponibili in commercio per questo scopo. NOTA: cDNA è stato sintetizzato secondo il protocollo del produttore utilizzando le seguenti impostazioni sul ciclore termico. 5 min a 25 °C 30 min a 42 °C 5 min a 85 °C Tenere premuto a 4 °C</li>
		<li>Dopo la fase di trascrizione inversa, conservare il cDNA a -20 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettazione e standardizzazione primer: Sono disponibili diversi eccellenti programmi software, gratuiti, per la progettazione di primer per amplificazioni in tempo reale.<ol>
<li>Selezionare oligonucleotidi da 18-24 anni che producono ampliconi da 70-110 bp e sintetizzare i primer utilizzando fonti commerciali. NOTA: Due o tre coppie di primer devono essere progettate per ogni gene di interesse. Ogni set di primer deve essere standardizzato da qPCR. Le coppie primer avanti e indietro utilizzate per il gene CREB1 (Figura 4) sono le seguenti: Primer set 1 Attaccante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3' Retromarcia: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Primer set 2 Attaccante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Rovescio: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Per selezionare il primer migliore da utilizzare per le analisi a valle, monitorare il valore Ct e la forma della curva di amplificazione in qPCR. NOTA: I primer che danno valori Ct (Cycle threshold) tra 10-35 nell'amplificazione rotonda 40 e curve lisce durante la fase esponenziale della PCR seguita da un plateau liscio sono ottimali per le analisi dell'espressione genica.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR quantitativo in tempo reale (qPCR): Nota: utilizzare tubi o piastre appropriati compatibili con la macchina qPCR.<ol>
<li>Diluire cDNA a 5x con acqua priva di nucleasi.</li>
		<li>A 2 μl di cDNA diluito, aggiungere 8 μl di una miscela master qPCR contenente 2 μl di H2O, 5 μl di 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl di 10 μM (ciascuno) primer avanti e indietro.</li>
		<li>Chiudere i tubi e sigillare la piastra dopo pipettazione cDNA e master mix. Mescolare il contenuto toccando delicatamente e girando verso il basso a 1.500 giri/min per 30 secondi.</li>
		<li>Procedere alla configurazione della macchina qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Il neurone R15 è coinvolto nella regolazione dei sistemi cardiovascolare, digestivo, respiratorio e riproduttivo30. Un'attività di bursting regolarmente ritmica dell'AP è una caratteristica di R15. Come mostrato nella sezione dei risultati, la registrazione accoppiata di R15 e L7 mostra che la preparazione dei gangli ha preservato l'attività dei neuroni R15. I neuroni R15 e L7 hanno risposto in modo appropriato ad Ach. Questa preparazione dei gangli potrebbe essere mantenuta fino a 8-10 ore e l'attività elettr...

Il cervello umano è straordinariamente complesso con quasi 100 miliardi di neuroni e trilioni di connessioni sinaptiche. Ci sono quasi un numero uguale di cellule nonneuronali che interagiscono con i neuroni e regolano la loro funzione nel cervello. I neuroni sono organizzati in circuiti che regolano comportamenti specifici. Nonostante i progressi nella nostra comprensione delle funzioni cerebrali e dei circuiti neurali, poco si sa dell'identità dei componenti circuitali che controllano un comportamento specifico. La conoscenza delle identità di vari componenti di un circuito faciliterà notevolmente la nostra comprensione delle basi cellulari e molecolari del comportamento e aiuterà nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i disturbi neuropsichiatrici.
La lumaca marina Aplysia californica è stata un cavallo di battaglia per determinare i circuiti neuronali alla base di comportamentispecifici 1-14. Il sistema nervoso dell'Alisia contiene circa 20.000 neuroni organizzati in 9 diversi gangli. I neuroni dell'Aplysia sono grandi e possono essere facilmente identificati in base alle loro dimensioni, proprietà elettriche e posizione nei gangli. Aplysia ha un ricco repertorio di comportamenti che possono essere studiati. Uno dei comportamenti ben studiati è il riflesso di astinenza branchiale (GWR). I componenti centrali di questo riflesso sono situati in gangli addominali. I componenti dei circuiti GWR sono stati mappati e sono stati determinati contributi di vari componenti. È importante sottolineare che i circuiti GWR subiscono l'apprendimento associativo e nonassociativo 5,6,15-19. Decenni di studio su questo riflesso hanno anche identificato diversi percorsi di segnalazione che hanno un ruolo chiave nell'apprendimento e nellamemoria 20-24.
Diversi preparativi di Aplysia furono usati per studiare le basi cellulari e molecolari della memorizzazione della memoria. Questi includono l'animaleintatto 2,3,la preparazione semi-intatta1,7,13,14,16 e la ricostituzione dei principali componenti dei circuiti neurali25-29. Qui viene descritta una preparazione ridotta per esplorare i gangli di Alisia per le analisi elettrofisiotiche e molecolari dei circuiti neuronali identificati. Sono stati studiati i seguenti quattro neuroni identificati. R15, un neurone che esplode, L7 e L11, due diversi motoneuroni e R2, un neurone colinergico. R2 è il più grande neurone descritto nel sistema nervoso invertebrato. In breve, questa metodologia prevede il trattamento proteasiale dei gangli, misurazioni elettrofisiologiche prima e dopo i trattamenti farmacologici e isolamento di singoli neuroni per l'analisi quantitativa dell'espressione genica. Questa metodologia ci consente di combinare le analisi molecolari con la registrazione simultanea da più neuroni. Questa metodologia è stata utilizzata con successo per studiare le risposte dei neuroni R15 e L7 all'acetilcolina (Ach) accoppiando registrazioni intracellulari. A seguito di misurazioni elettrofisiopatiche R15 e L7 e altri neuroni identificati come L11 e R2 sono stati isolati per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) dell'espressione di CREB1, un fattore di trascrizione importante per la memorizzazione della memoria.

<table><tbody><tr><td>Aplysia</td><td>National Aplysia Resource Facility, Università di Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2&bull; 2H2O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2&bull; 6H2O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO4</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Proteasi</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100% Etanolo</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5,5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Acqua priva di nucleasi</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II Kit di amplificazione dell'aRNA</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Potenza SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Pinze</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Perni in acciaio inossidabile per minuzie&nbsp;</td><td>Strumenti di Fine Science</td><td>26002-10 o</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>5430R Centrifuga</td><td>Eppendorf</td><td>5430R Centrifuga</td><td></td></tr><tr><td>7900HT PCR in tempo reale veloce</td><td>Biosystems</td><td>applicata 7900HT Amplificatore PCR</td><td></td>in tempo reale veloce</tr><tr><td></td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Elettronica</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Converter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Micro Manipolatore</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

alisia preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Una grande sfida in neurobiologia è comprendere le basi molecolari dei circuiti neurali che governano un comportamento specifico. Una volta identificati i meccanismi molecolari specifici, è possibile sviluppare nuove strategie terapeutiche per trattare le anomalie in comportamenti specifici causati da malattie degenerative o invecchiamento del sistema nervoso. La lumaca marina Aplysia californica è adatta per le indagini sulle basi cellulari e molecolari del comportamento perché i circuiti neurali alla base di un comportamento specifico potrebbero essere facilmente determinati e le singole componenti dei circuiti potrebbero essere facilmente manipolate. Questi vantaggi dell'Aplysia hanno portato a diverse scoperte fondamentali della neurobiologia dell'apprendimento e della memoria. Qui descriviamo una preparazione del sistema nervoso di Alysia per le analisi elettrofisiofisioiche e molecolari dei singoli neuroni. In breve, il ganglio sezionato dal sistema nervoso è esposto alla proteasi per rimuovere la tona del ganglio in modo tale che i neuroni siano esposti ma mantengano l'attività neuronale come nell'animale intatto. Questa preparazione viene utilizzata per effettuare misurazioni elettrofisiopatiche di singoli o multipli neuroni. È importante sottolineare che, seguendo la registrazione utilizzando una semplice metodologia, i neuroni potrebbero essere isolati direttamente dai gangli per l'analisi dell'espressione genica. Questi protocolli sono stati utilizzati per effettuare registrazioni elettrofisiofisioiche simultanee dai neuroni L7 e R15, studiare la loro risposta all'acetilcolina e all'espressione quantitante del gene CREB1 in singoli neuroni isolati L7, L11, R15 e R2 di Aplysia.

I pesi degli animali utilizzati in questo studio variavano da 100-200 g. Seguendo i protocolli descritti, abbiamo condotto misurazioni elettrofisiotiche e analisi molecolari di neuroni di gangli addominali isolati da animali che vanno da 2-5 g a 200-300 g.
La standardizzazione del trattamento proteasi è importante per misurazioni elettrofisioniche di successo dei neuroni nei gangli. Inizialmente, sono state utilizzate concentrazioni e durate multiple di proteasi (Dispasi) e sono stati registra...

La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

L'obiettivo generale di questa procedura è studiare l'espressione genica e i cambiamenti elettrofisiologici nei singoli neuroni identificati. Questo viene ottenuto innanzitutto identificando con attenzione i neuroni di interesse dal ganglio di plegia, a seguito del trattamento con proteasi e della rimozione della guaina per esporre i neuroni. Il secondo passaggio consiste nel registrare le proprietà elettrofisiologiche dei neuroni identificati.Successivamente, isolare singoli neuroni dopo le misurazioni elettrofisiologiche ed estrarre l'RNA da questi neuroni per l'amplificazione lineare. L'ultimo passaggio consiste nel caratterizzare l'espressione genica mediante PCR quantitativa. Infine, analizzare i dati elettrofisiologici e quelli relativi all'espressione genica provenienti dai trattamenti e dai controlli per identificare modifiche specifiche.Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'analisi di organi, tessuti o gangli, è che consente un'analisi a livello di singolo neurone. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle neuroscienze cognitive, ad esempio in che modo l'espressione genica cambia nei singoli neuroni durante l'invecchiamento o in risposta a diversi agenti farmacologici. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo quando desideravamo studiare come l'invecchiamento influisca sul funzionamento di neuroni e circuiti individuali. Per isolare i gangli addominali.Per prima cosa, anestetizzare l'animale iniettando una soluzione di cloruro di magnesio 380 millimolare e attendere da cinque a dieci minuti. Successivamente, identificare i gangli addominali in base alla loro posizione nel sistema nervoso centrale. Quindi, rimuovere i gangli mediante intervento chirurgico e conservarli immediatamente nell'acqua marina artificiale per il trattamento con proteasi.Incubare i gangli addominali in una piastra di Petri con proteasi 0,1% diluita in SW a 34 gradi Celsius per 30 minuti. Si noti che la quantità di proteasi utilizzata deve essere standardizzata in base all'età e al peso degli animali per rimuovere la guaina del ganglio. Dopo il trattamento enzimatico, fissare il ganglio su una base di silicone a forma di sigaro posizionata sulla sommità di un cilindro di vetro in policarbonato e perfondere con SW a 150 microlitri al minuto a 18 gradi Celsius.Per aumentare la visibilità dei neuroni identificati, il cilindro di vetro in policarbonato può essere facilmente illuminato dal basso utilizzando un microscopio stereoscopico binoculare con ingrandimenti 20 x e 40 x. Successivamente, rimuovere con attenzione la guaina dal ganglio utilizzando pinzette e microforbici in questa procedura. Innanzitutto, identificare il neurone di interesse.Successivamente, impalare il neurone con un singolo microelettrodo affilato intracellulare riempito con soluzione di cloruro di potassio tre molare. Applicare il farmaco scelto nella camera del campione, pipettandolo delicatamente o iniettandolo direttamente nei neuroni. Quindi registrare l'attività neuronale utilizzando un sistema di registrazione intracellulare.I dati di registrazione vengono elaborati con un software di elettrofisiologia come Axo graph per isolare i singoli neuroni. Al termine degli esperimenti elettrofisiologici, interrompere la perfusione di A SW. Successivamente lavare il ganglio con etanolo al 100% al fine di pietrificare i neuroni.Quindi rimuovere i singoli neuroni con una coppia di pinzette fini e trasferirli in una piccola provetta eppendorf contenente 500 microlitri di reagente per l'estrazione di RNA freddo su ghiaccio. I singoli neuroni isolati possono essere conservati nel reagente per l'estrazione di RNA a meno 80 gradi Celsius per analisi future, al fine di isolare gli RNA da singoli neuroni utilizzando il protocollo standard TRIOL per l'isolamento di RNA.Aggiungere brevemente il 20% in volume di cloroformio rispetto al triolo e mescolare bene, agitando brevemente mediante vortex. Successivamente, posizionare i tubi su un rotatore per 10 minuti a quattro gradi Celsius. Centrifugare la miscela di triolo e cloroformio a 12.000 ×g per 15 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi raccogliere la fase acquosa e trasferirla in un tubo nuovo per precipitare l'RNA. Aggiungere alla fase acquosa una soluzione di acetato di sodio fino a una concentrazione finale di 0,3 molari, 100 nanogrammi per millilitro del co-precipitante GlycoBlue e 2,5 volumi di etanolo al 100%. Successivamente, mescolare accuratamente il campione e incubare a meno 80 gradi Celsius per tutta la notte.Il giorno successivo, centrifugare il campione a 12.000 ×g per 20 minuti. A quattro gradi Celsius, si formerà un piccolo pellet blu visibile sul fondo del tubo. Successivamente, rimuovere il soprannatante e lavare il pellet con 850 microlitri di etanolo al 75% ghiacciato, centrifugando a 12.000 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius.Quindi rimuovere con attenzione il soprannatante e lasciare asciugare all'aria il pellet di RNA per sette-dieci minuti. Assicurarsi che l'RNA non resti a seccare troppo a lungo, poiché l'eccessiva essiccazione rende molto difficile la solubilizzazione del pellet di RNA.Prima di preparare l'analisi di PCR quantitativa in tempo reale, sintetizzare l'RNA A da singoli neuroni e amplificarlo utilizzando un sistema commerciale di amplificazione lineare dell'RNA. Successivamente, generare il CDNA utilizzando un microgrammo di RNA A in 20 microlitri di una reazione di trascrizione inversa. Poi, diluire il CDNA in acqua priva di nucleasi.In seguito, aggiungere otto microlitri del master mix per QPCR contenente due microlitri di H2O, cinque microlitri di master mix 2x cyber green e un microlitro di primer forward e reverse da 10 micromolare a due microlitri di cDNA diluito. Successivamente, pipettare il cDNA e il master mix. Chiudere quindi i tubi e sigillare la piastra.Mescolare il contenuto agitando delicatamente e centrifugando a 1.500 giri/min per 30 secondi prima di impostare la macchina per QPCR. Questo disegno illustra la registrazione simultanea dai neuroni L sette e R 15 dei gangli addominali. E qui di seguito sono riportate le registrazioni intracellulari rappresentative dei neuroni L sette e R 15.Con la freccia che indica il momento dell'applicazione di CH, si potrebbero proseguire queste misurazioni per otto o dieci ore. Questo grafico mostra che un CH ha indotto cambiamenti nel potenziale d'azione delle forme d'onda del potenziale d'azione di R 15, analizzate prima, durante e dopo l'esposizione a CH. Di seguito è riportata l'analisi QPCR dell'espressione di CREB uno nei gangli addominali e nei singoli neuroni identificati.Questo grafico mostra la quantificazione assoluta del trascritto CREB1 nei gangli addominali giovani e adulti di plegia. E questo grafico mostra la quantificazione assoluta del trascritto CEB1 nei singoli neuroni identificati della plegia adulta. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro-sei ore e l'isolamento dell'RNA, l'amplificazione e la QPCR possono essere completati in tre giorni se eseguiti correttamente.Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare di standardizzare il trattamento con proteasi e la rimozione della guaina gangliare in modo da preservare l'attività neuronale. Inoltre, adottare precauzioni quando si lavora con l'RNA, ad esempio indossando guanti in ogni momento. Utilizzare tubi e acqua privi di RNAsi e trattare la zona di lavoro con reagenti che rimuovono le RNAsi.Questa tecnica aiuterà anche i ricercatori nel campo delle neuroscienze a esplorare le basi fisiologiche e molecolari del comportamento in altri organismi modello invertebrati come Triton, heli e limba.

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Impara a preparare i gangli di Aplysia californica per registrare le proprietà elettrofisiologiche di singoli neuroni identificati e analizzare l'espressione genica mediante PCR quantitativa.

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