Un metodo per studiare l'impatto delle chimicamente indotta da insufficienza ovarica sulla capacità di esercizio e adattamento cardiaca nei topi

L'obiettivo generale di questa procedura è accelerare il processo naturale di atresia follicolare nelle ovaie, provocando così un'insufficienza ovarica, una riduzione degli estrogeni e una femmina non ciclica, una condizione che simula da vicino la menopausa. Questo risultato si ottiene somministrando per primi da 15 a 20 giorni consecutivi il prodotto chimico industriale ossido di vinilciclina o VCD, che si è dimostrato in grado di colpire specificamente e distruggere i follicoli ovarici primari e primitivi di piccole dimensioni accelerando il loro processo naturale di atresia. Il secondo passaggio consiste nel determinare il ciclo estrale e la ciclicità ovarica mediante citologia vaginale a partire da circa sei settimane dopo l'inizio delle iniezioni di VCD.

Devono essere osservati da 15 a 20 giorni di persistente dste o assenza di ciclicità mediante citologia vaginale per confermare la perdita della ciclicità e il fallimento ovarico. L'ultimo passaggio consiste nell'attuare un intervento che potrebbe essere influenzato dalla menopausa o dalla transizione verso la menopausa, come l'esercizio volontario sulla ruota della gabbia o l'adattamento cardiaco. In definitiva, l'attività volontaria sulla ruota della gabbia e l'adattamento cardiaco vengono utilizzati per verificare se la menopausa riduce l'attività sulla ruota della gabbia.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti, come l'ectomia, è che l'ectomia è una procedura chirurgica che determina un'esaurimento improvviso degli estrogeni, diversamente dalla perdita progressiva naturale di estrogeni che si verifica durante la transizione dalla fase pre- a quella postmenopausale. Le implicazioni di questa tecnica riguardano la terapia delle malattie metaboliche e cardiovascolari nelle donne postmenopausali, poiché queste ultime sono particolarmente più suscettibili al sindrome metabolica e alle comorbidità associate, tra cui le malattie cardiovascolari, rispetto alle donne premenopausali. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale poiché i passaggi della citologia vaginale sono difficili da apprendere, in quanto è necessario prestare attenzione all'esecuzione della corretta tecnica di striscio e all'identificazione del ciclo EST.

Quattro, il biossido di vinilciclina o VCD viene conservato a meno 20 gradi Celsius. Per preparare il VCD per il protocollo di iniezione, aggiungere 0,587 millilitri di VCD in un flacone dosatore pulito e portare il volume finale a 10 millilitri con olio di sesamo, coprire e sigillare con parafilm e mescolare capovolgendo delicatamente. Conservare a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni.

Per iniziare il protocollo di iniezione di VCD, pesare due topi di due mesi di età per 20 giorni consecutivi, somministrando iniezioni intraperitoneali giornaliere di VCD a temperatura ambiente alla dose di 160 milligrammi per chilogrammo, utilizzando un ago da 27 gauge durante il periodo di iniezione. È consigliabile alternare i siti di iniezione per ridurre le probabilità di infezione locale in modo analogo. Iniettare nei topi di controllo la soluzione veicolare olio di sesamo a un volume di 2,5 millilitri per chilogrammo al termine del periodo di iniezione.

Monitorare quotidianamente il ciclo estrale ottenendo strisci vaginali. Uno dei fattori fondamentali per il successo di questo studio è ottenere strisci vaginali di alta qualità per la determinazione citologica. Trattenere i topi utilizzando il metodo di afferratura del dorso del collo.

Inserire un contagocce con 0,2 millilitri di soluzione salina sterile nell'orifizio vaginale fino a una profondità di 0,5 centimetri. Mescolare tre volte la soluzione salina iniettata con il contagocce, quindi depositare una goccia su un vetrino vuoto. Valutare immediatamente ogni campione al microscopio utilizzando un microscopio ottico standard a un ingrandimento di 100 x per confermare l'insufficienza ovarica.

Successivamente, i topi menopausali indotti da VCD vengono utilizzati per gli esperimenti sull'esercizio fisico. L'apparato della ruota della gabbia è costituito da una ruota di 11,5 centimetri di diametro con una superficie di corsa larga cinque centimetri, dotata di un contatore magnetico digitale che si attiva con la rotazione della ruota. Prima di ogni test di corsa sulla ruota, calibrare la ruota della gabbia secondo le indicazioni del produttore.

Misurare il diametro interno della ruota girevole. Calcolare la circonferenza e inserire questo valore nel contatore digitale come dimensione della ruota per montare la ruota sulla gabbia, quindi far scorrere la ruota. Passare attraverso la rete superiore della gabbia per animali.

Fissare il supporto della ruota ai fili della gabbia utilizzando clip per documenti. Le clip devono trovarsi sulla parte superiore dei fili, lontano dall'animale. Far passare la parte del computer e qualsiasi cavo aggiuntivo attraverso i fili della gabbia.

Posizionare il computer e il cavo in eccesso fuori dalla portata dell'animale. Questo può essere ottenuto posizionando una capsula di plastica di dimensioni medie sopra i cavi del recinto per tenere il computer e il cavo in eccesso. Successivamente, fissare la parte del computer del contatore magnetico digitale al supporto della ruota.

Utilizzando nastro adesivo, fissare il magnete libero del contatore magnetico digitale alla barra centrale sullo stesso lato del cavo del magnete che va al computer. Ancora una volta, applicare il nastro in modo sufficiente a proteggere il magnete dai danni causati dal morso. Il magnete deve essere posizionato in modo che ogni rotazione della ruota venga registrata dal computer senza alcun ostacolo o resistenza al completo giro della ruota.

Collegare la ruota girevole alla ruota. Fissare il supporto della ruota inserendo i perni del supporto nelle aperture di montaggio sulle barre centrali della ruota. Assicurarsi che la ruota possa ruotare liberamente.

L'impostazione deve essere controllata quotidianamente per eventuali danni da rosicchiamento e riparata secondo necessità durante l'esperimento. Topi femmine di ceppo consanguineo di sette mesi, C 57, black six e B six C3 F1, provenienti da una stessa nidiata, vengono assegnati casualmente al regime di esercizio fisico o al gruppo di controllo sedentario. Gli animali sperimentali vengono alloggiati singolarmente in gabbie di dimensioni 47 × 26 × 14,5 centimetri, con libero accesso a una ruota per gabbia per 28 giorni, mentre gli animali di controllo vengono alloggiati insieme in una gabbia priva di ruota.

Fornire a tutti gli animali acqua e mangime standard per roditori. Aggiungere lido e registrare manualmente ogni giorno i valori della distanza percorsa e del tempo totale trascorso a correre, forniti dal contatore magnetico; registrare i valori di distanza e tempo entro lo stesso arco di un'ora ogni giorno, per ottenere valori accurati e coerenti durante l'intero periodo di esercizio della durata di 28 giorni. Dopo la registrazione di ogni giorno, azzerare il contatore magnetico per garantire letture accurate il giorno successivo.

Al termine del periodo specifico di esercizio, i pesi corporei degli animali sacrificati vengono registrati prima del prelievo dei tessuti. Per esporre il cuore, effettuare un'incisione mediana sul lato ventrale, aprire il diaframma e visualizzare rapidamente il cuore. Escindere il cuore alla base e immergerlo in soluzione salina tamponata al fosfato fredda per eliminare adeguatamente il sangue residuo nei ventricoli. Rimuovere dal cuore i tessuti in eccesso, pesare l'intero cuore e, se necessario, congelarlo rapidamente in azoto liquido.

Prelevare ulteriori tessuti di escissione, lavarli con una soluzione modificata di soluzione salina tamponata al fosfato fredda con ghiaccio e congelarli rapidamente in isopentano raffreddato con azoto liquido. In questo studio, l'insufficienza ovarica è stata indotta dal trattamento con VCD e confermata mediante esame microscopico dei tamponi vaginali. La fase del ciclo estrale è determinata dalla proporzione di cellule epiteliali, dalle cellule epiteliali quantificate e dai leucociti nelle cellule epiteliali nucleate PROEs, che predominano.

Qui le frecce indicano cellule nucleate durante il periodo estrale, mentre le cellule squamose epiteliali quantificate sono prevalentemente anucleate. Il maestro è caratterizzato da una miscela di tipi cellulari con predominanza di leucociti. Il diestro è dominato da leucociti.

Il ciclo estrale nei topi dura tipicamente quattro giorni prima dell'iniezione di VCD. Gli animali sono stati considerati aciclici dopo 15 giorni di diestro persistente. Questa figura mostra la durata media in giorni del ciclo estrale extra nei gruppi trattati con veicolo e con VCD.

Un ciclo viene misurato dal primo giorno dell'estro al primo giorno del ciclo successivo. Nell'estro, la citologia vaginale è iniziata circa sei settimane dopo l'inizio delle iniezioni. Si è osservato che i cicli estrali degli animali trattati con VCD diventavano irregolari rispetto a quelli degli animali trattati con il veicolo; dopo 12 cicli estrali, la citologia di tutti gli animali trattati con VCD non indicava più alcun ciclo alla fine del protocollo di iniezione di VCD. La colorazione ematossilina ed eosina (H e E) di sezioni trasversali del tessuto ovarico ha rivelato un'atrofia significativa nei tessuti ovarici trattati con VCD rispetto ai controlli.

Quando osservato a un ingrandimento di 20x a 200 ingrandimenti, è stata riscontrata una completa deplezione dei follicoli primari e primordiali nel tessuto trattato con VCD. A differenza del tessuto trattato con il veicolo, l'effetto dell'insufficienza ovarica indotta da VCD sulle prestazioni nell'esercizio fisico è stato valutato in topi trattati con VCD e con veicolo di sette mesi di età, appartenenti a due ceppi; i valori giornalieri dell'esercizio su ruota nella gabbia sono stati registrati per durata e distanza percorsa per ciascun animale esercitato per un periodo di quattro settimane. Questa figura mostra le medie settimanali dei valori giornalieri di corsa per distanza, tempo e velocità.

Per i topi C57, black six trattati con veicolo o VCD, non sono state osservate differenze significative nelle prestazioni motorie misurate dalla distanza media giornaliera percorsa e dal tempo trascorso sulla ruota tra i gruppi trattati con VCD e quelli trattati con veicolo, né nei ceppi C57, black six né in quelli B6C3F1. Ciò indica che l'impatto del fallimento ovarico indotto da VCD sull'esercizio volontario nella ruota della gabbia si estende almeno a due ceppi murini dopo la durata del protocollo di esercizio volontario nella gabbia. Sono stati registrati i parametri morfometrici corporei e i cuori sono stati rapidamente escissi e pesati, in accordo con osservazioni precedenti.

È stata osservata ipertrofia cardiaca in risposta all'esercizio su ruota nella gabbia, misurata in base al peso cardiaco assoluto e al peso cardiaco normalizzato rispetto alla lunghezza della tibia. Sebbene la massa cardiaca assoluta e il rapporto tra peso cardiaco e lunghezza della tibia fossero significativamente maggiori nei topi trattati con veicolo e VCD rispetto ai controlli sedentari, non sono state riscontrate differenze misurabili nell'ipertrofia cardiaca tra il gruppo di controllo e quello con insufficienza ovarica indotta da VCD. Infine, i topi sottoposti all'esercizio volontario su ruota nella gabbia, nonché quelli trattati con VCD e veicolo, sono stati sottoposti a corsa forzata su tapis roulant per determinare la capacità di esercizio sia ad alta che a bassa intensità.

Nel protocollo ad alta intensità, la velocità media del nastro è stata aumentata progressivamente ogni 10 minuti fino a quando i topi hanno mostrato segni di esaurimento. In media, la velocità massima dei topi trattati con veicolo era di 26,7 ± 0,95 metri al minuto, e la velocità massima dei topi trattati con VCD era di 28 ± 1,4 metri al minuto prima dell'esaurimento. Una corsa a intensità inferiore, a 20 metri al minuto, è stata utilizzata per valutare la capacità di resistenza.

In media, il tempo massimo dei topi trattati con il veicolo è stato di 28,3 più o meno 1,3 minuti, e il tempo massimo dei topi trattati con VCD è stato di 29,7 più o meno 1,4 minuti prima dell'esaurimento. Non sono state riscontrate differenze significative nella capacità di esercizio ad alta o bassa intensità tra i gruppi trattati con veicolo e quelli trattati con VCD, indicando che l'insufficienza ovarica indotta da VCD non ha avuto effetto sulla capacità di esercizio dei topi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nei campi delle scienze cellulari, molecolari e fisiologiche per esplorare il ruolo della menopausa nei roditori.

Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire correttamente le iniezioni di VCD, effettuare la citologia vaginale e attuare un intervento fisiologico.