Name: Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-11-15T18:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
Description: Scopri il sistema di screening two-hybrid nel lievito per identificare interazioni tra il recettore nucleare PXR e il farmaco ketoconazolo. Questo metodo ad alto rendimento rivela mutazioni che conferiscono resistenza al farmaco.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concede CA127231 e The Damon Runyon Premio Fondazione Clinical Investigator (CI 1502) (SM). Vorremmo ringraziare il professor Zdenek Dvorak da Palacky Università di Olomouc, Repubblica Ceca per i suoi utili intuizioni che parlano di portabilità di questa tecnica per la loro istituzione e la standardizzazione del protocollo.

1. Costruzione di PXR e SRC-1 Fusioni in vettori di lievito <ol><li> Amplificazione PCR di Human PXR LBD (107-434 amminoacidi) e Human SRC-1 a figura intera (1-1401 amminoacidi). <ol><li> Utilizzare pSG5-hPXR plasmide 8 come modello PXR LBD, utilizzare plasmide pCMX-SRC1 come SRC-1 modelli. </li><li> Thaw PCR SuperMix, i modelli di DNA e primer (vedi Materiali), tenerli su ghiaccio. </li><li> Aggiungere 0,25 mg / template DNA microlitri 1 ml, 10 mM coppie di primer 2 microlitri ciascuno, PCR SuperMix 45 ml e aggiungere H 2 O per portare il volume totale di 50 microlitri. </li><li> Impostare PCR in un ciclo di 94 ° C per 2 min, 20 cicli di 94 ° C per 30 sec, 55 ° C per 30 sec e 72 ° C per 2 min, poi un ciclo di 72 ° C per 10 min per estensione. Controllare prodotti PCR eseguendo il 1% gel di agarosio. </li></ol></li><li> I prodotti di PCR clonazione in vettori Y2H. <ol><li> Purificare prodotti di PCR dal 1% gel di agarosio. Digest PXR, LBD, PCR, e Y2H vettore PSH2-1 conBamHI e Sali; digerire SRC-1 PCR e Y2H vettore pGADNOT con NotΙ e SalΙ. Per fare questo, aggiungere 1 mg di DNA, 3 ml 10x tampone di reazione, 1 ml enzimi di restrizione, e, infine, H 2 O per portare il volume totale di 30 microlitri. </li><li> Mettere i campioni digestione nel 37 ° C a bagnomaria per 1 ora. Controllare digestione eseguendo il 1% gel di agarosio. </li><li> Purificare i campioni di digestione da 1% gel di agarosio, legare digerito prodotti di PCR e vettori Y2H e trasformare le cellule competenti DH5a. </li><li> Scegli le colonie e isolare il DNA plasmide. </li></ol></li><li> Identificare PSH2-1-PXR plasmide DNA BamHI / SalI digestione, identificare pGADNOT-SRC-1 plasmide DNA Notl / SalI digestione. Verificare che tutto il DNA plasmide positivo mediante sequenziamento. </li></ol> 2. Lievito Two-hybrid Saggi <ol><li> Inoculare il ceppo di lievito in 5 ml YPAD e incubare per tutta la notte mediante agitazione costante (220 rpm a 30 ° C). Nota: Il ceppo Saccharomyces cerevisiae era CTY10-5d(Mat A ade2 trp 1-901 LEU2-3, 112 his3-200 ga l4 - gal80 - URA3 :: lexA-lacZ) che contiene un gene integrato GAL1-lacZ con lexA operatore 10. Per ottenere cellule di lievito vitali resistenti al ketoconazolo, ma quelli che non portano alterazioni trasportatore come causa della resistenza azolici 18-20, nuovi ceppi di lievito CTY10-5d sono stati ottenuti dalla prima ERG3 cancellazione (ERG3 Δ) e poi introducendo la cancellazione supplementare ERG11 (ERG3 Δ / erg11 Δ) geni di ricombinazione omologa. I dettagli costruttivi sono stati descritti in un manoscritto precedentemente pubblicato 6. </li><li> Il giorno successivo (al mattino), inoculare lievito (1,20) in 5 ml YAPD e incubare avere un OD 600 ~ 0,2 mediante agitazione costante (220 rpm a 30 ° C). </li><li> Agglomerare le cellule a 2.000 rpm in una microcentrifuga per 2 minuti e scartare il surnatante. Quindi lavare la pellet due volte con acqua autoclave e una volta con 0.1 M LIAC. </li><li> Dopo l&#39;ultimo lavaggio, scartare il surnatante e aggiungere i seguenti reagenti per il pellet cellulare: 240 ml PEG 3500 al 50% w / v, 36 microlitri 1 M LIAC, 50 pl 2 mg / ml bollito ssDNA sperma di salmone, H 2 O 34 microlitri. Vortex per mescolare, aggiungere 1 mg PSH-PXR e 1 mg pGADNOT-SRC-1 DNA e mescolare. </li><li> Trasferire la miscela di polistirene tubo a fondo rotondo, agitare la trasformazione, mescolare (220 rpm a 30 ° C) per 30 min. Spostare il tubo a 42 ° C bagnomaria e incubare per altri 30 min. </li><li> Centrifugare la provetta a 2.000 rpm per 2 minuti e rimuovere il surnatante. Lavare pellet una volta con acqua autoclave. </li><li> Aggiungere 100 ml di acqua sterile nel tubo, risospendere le cellule dalla barretta dolce toccando e pipettaggio, poi piastra su piastre di -His/-Leu Dropout Media (Formulazione per un litro -His/-Leu Dropout medio: 20 g destrosio, 1.7 g YNB, 0.67 g CSM-His/-Leu, 5 g di solfato di ammonio, 1,5% agar) e incUbate a 30 ° C per 3-4 giorni per isolare trasformanti. </li></ol> 3. X-gal Filter Assay <ol><li> Tagliare membrana di nitrocellulosa alla dimensione di una parte di una piastra di Petri. Etichettare la membrana di nitrocellulosa per segnare l&#39;orientamento. </li><li> Posizionare membrana di nitrocellulosa premarcata su colonie di lievito, assicurarsi che la membrana è in contatto con la superficie del terreno piastra. </li><li> Rimuovere la membrana, posizionarlo lato colonia su una carta da filtro a 3 mm, e collocare la membrana e la carta da filtro a -80 ° C per 15 min. </li><li> Preparare la soluzione di X-gal. Aggiungere 50 microlitri 20 mg / ml X-gal e 15 microlitri β-mercaptoetanolo al 5 ml di Z-buffer (tampone 1 L contiene 16,1 g di Na 2 HPO 4 7H 2 O, 5,5 g di NaH 2 PO 4 H 2 O, 0,75 g KCl, 0,25 g MgSO 4 • 7H 2 O). Se Z Buffer fu mantenuta a 4 ° C, portarlo a temperatura ambiente prima di aggiungere questi reagenti. </li><li> Mettere due cerchi di 3 millimetri carta da filtroin una piastra di Petri e ammollo con 5 ml di soluzione X-gal. Scolare il tampone in eccesso dalla piastra di Petri e posizionare la membrana di nitrocellulosa con la colonia verso l&#39;alto. </li><li> Chiudere il coperchio, assicurarsi che la membrana è in contatto completo con la carta da filtro ed è completamente bagnato. Avvolgere la piastra di Petri in strisce e incubare a 37 ° C per 30 min a overnight. </li></ol> 4. Liquid Assay β-gal <ol><li> Crescere lievito in -His/-Leu Dropout mezzo liquido di OD 600 0.7. </li><li> Trasferire 1 ml in mezzo una provetta da 1,5 ml microcentrifuga e centrifugare a 3000 rpm per 2 min. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 1 ml di Z Buffer per risospendere il pellet, centrifugare a 3000 rpm ancora per 2 min. Scartare il surnatante. </li><li> Aggiungere 150 ml di Z Buffer con 2ME per risospendere il pellet cellulare, mescolare poi aggiungere 50 ml di cloroformio e il 20 microlitri 0,1% SDS. Vigorosamente vortice il campione per 15 sec. </li><li> Aggiungere 700 ml di ONPG Soluzione (1 mg / ml in Z buffer). Impostare il timer, incubare a 30 ° C abbastanza a lungo per permettere al colore giallo di sviluppare e notare tempo di reazione totale. </li><li> Aggiungere 500 ml di 1 M di Na 2 CO 3 per bloccare la reazione e determinare l&#39;assorbanza a 420 nm. Il bianco è la soluzione ONPG 700 ml più 500 ml 1 M Na 2 CO 3. </li></ol> Calcola Unità Miller come segue: Miller Unità = (A420 * 1000) / (A600 * min * ml) A420: unità di assorbanza a 420 nanometri; A600: unità di assorbanza a 600 nanometri, min: il tempo di reazione in minuti; ml: il volume di reazione in ml

<ol><li>Kliewer, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orphan+nuclear+receptor+activated+by+pregnanes+defines+a+novel+steroid+signaling+pathway%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">An orphan nuclear receptor activated by pregnanes defines a novel steroid signaling pathway.</a> Cell. 92 (1), 73-82 (1998).</li>
<li>Blumberg, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((a+novel+steroid+and+xenobiotic-sensing+nuclear+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">a novel steroid and xenobiotic-sensing nuclear receptor.</a> Genes Dev. 12 (20), 3195-3205 (1998).</li>
<li>Biswas, A., Mani, S., Redinbo, M. R., Krasowski, M. D., Li, H., Ekins, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elucidating+the+%27Jekyll+and+Hyde%27+Nature+of+PXR%3A+The+Case+for+Discovering+Antagonists%5BTitle%5D)+AND+%22Pharm.+Res%22%5BJournal%5D)">Elucidating the 'Jekyll and Hyde' Nature of PXR: The Case for Discovering Antagonists.</a> Pharm. Res. 26 (8), 1807-1815 (2009).</li>
<li>Pondugula, S. R., Mani, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pregnane+xenobiotic+receptor+in+cancer+pathogenesis+and+therapeutic+response%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Lett%22%5BJournal%5D)">Pregnane xenobiotic receptor in cancer pathogenesis and therapeutic response.</a> Cancer Lett. 328 (1), 1-9 (2013).</li>
<li>Mani, S., Dou, V., Redinbo, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PXR+antagonists+and+implications+for+drug+metabolism%5BTitle%5D)+AND+%22Drug+Metab.+Rev%22%5BJournal%5D)">PXR antagonists and implications for drug metabolism.</a> Drug Metab. Rev. 45 (1), 60-72 (2013).</li>
<li>Li, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+Yeast-Based+Strategy+Unveils+Antagonist+Binding+Regions+on+the+Nuclear+Xenobiotic+Receptor+PXR%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Novel Yeast-Based Strategy Unveils Antagonist Binding Regions on the Nuclear Xenobiotic Receptor PXR.</a> J. Biol. Chem. 288 (19), 13655-13668 (2013).</li>
<li>Hollenberg, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+family+of+tissue-specific+basic+helix-loop-helix+proteins+with+a+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">Identification of a new family of tissue-specific basic helix-loop-helix proteins with a two-hybrid system.</a> Mol. Cell. Biol. 15 (7), 3813-3822 (1995).</li>
<li>Vojtek, A. B., Hollenberg, S. M., Cooper, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mammalian+Ras+interacts+directly+with+the+serine%2Fthreonine+kinase+Raf%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Mammalian Ras interacts directly with the serine/threonine kinase Raf.</a> Cell. 74 (1), 205-214 (1993).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+phytoestrogen+coumestrol+is+a+naturally+occurring+antagonist+of+the+human+pregnane+X+receptor%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">The phytoestrogen coumestrol is a naturally occurring antagonist of the human pregnane X receptor.</a> Mol. Endocrinol. 22 (4), 838-857 (2008).</li>
<li>Kalpana, G. V., Goff, S. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+analysis+of+homomeric+interactions+of+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+using+the+yeast+two-hybrid+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Genetic analysis of homomeric interactions of human immunodeficiency virus type 1 integrase using the yeast two-hybrid system.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90 (22), 10593-10597 (1993).</li>
<li>Hamdi, A., Colas, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+two-hybrid+methods+and+their+applications+in+drug+discovery%5BTitle%5D)+AND+%22TiPS%22%5BJournal%5D)">Yeast two-hybrid methods and their applications in drug discovery.</a> TiPS. 33 (2), 109-118 (2012).</li>
<li>Battesti, A., Bouveret, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+bacterial+two-hybrid+system+based+on+adenylate+cyclase+reconstitution+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">The bacterial two-hybrid system based on adenylate cyclase reconstitution in Escherichia coli.</a> Methods. 58 (4), 325-334 (2012).</li>
<li>Caufield, J. H., Sakhawalkar, N., Uetz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comparison+and+optimization+of+yeast+two-hybrid+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">A comparison and optimization of yeast two-hybrid systems.</a> Methods. 58 (4), 317-324 (2012).</li>
<li>Albers, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+yeast+two-hybrid+screening+for+nuclear+receptor-interacting+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Automated yeast two-hybrid screening for nuclear receptor-interacting proteins.</a> Mol. Cell Proteomics. 4 (2), 205-213 (2005).</li>
<li>Takeshita, A., Taguchi, M., Koibuchi, N., Ozawa, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+role+of+the+orphan+nuclear+receptor+SXR+%28steroid+and+xenobiotic+receptor%29+in+the+mechanism+of+CYP3A4+inhibition+by+xenobiotics%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Biol.+Chem%22%5BJournal%5D)">Putative role of the orphan nuclear receptor SXR (steroid and xenobiotic receptor) in the mechanism of CYP3A4 inhibition by xenobiotics.</a> J. Biol. Chem. 277 (36), 32453-32458 (2002).</li>
<li>Huang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+drug+metabolism+by+blocking+the+activation+of+nuclear+receptors+by+ketoconazole%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Inhibition of drug metabolism by blocking the activation of nuclear receptors by ketoconazole.</a> Oncogene. 26 (2), 258-268 (2007).</li>
<li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activated+pregnenolone+X-+receptor+is+a+target+for+ketoconazole+and+Its+analogs%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Activated pregnenolone X- receptor is a target for ketoconazole and Its analogs.</a> Clin. Cancer Res. 13 (8), 2488-2495 (2007).</li>
<li>Ghannoum, M. A., Rice, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antifungal+agents%3A+mode+of+action%2C+mechanisms+of+resistance%2C+and+correlation+of+these+mechanisms+with+bacterial+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Antifungal agents: mode of action, mechanisms of resistance, and correlation of these mechanisms with bacterial resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 12 (4), 501-517 (1999).</li>
<li>Kaur, R., Bachhawat, A. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+yeast+multidrug+resistance+pump%2C+Pdr5p%2C+confers+reduced+drug+resistance+in+erg+mutants+of+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiology%22%5BJournal%5D)">The yeast multidrug resistance pump, Pdr5p, confers reduced drug resistance in erg mutants of Saccharomyces cerevisiae.</a> Microbiology. 145, 809-818 (1999).</li>
<li>White, T. C., Marr, K. A., Bowden, R. A., cellular, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clinical%2C+cellular%2C+and+molecular+factors+that+contribute+to+antifungal+drug+resistance%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Microbiol.+Rev%22%5BJournal%5D)">Clinical, cellular, and molecular factors that contribute to antifungal drug resistance.</a> Clin. Microbiol. Rev. 11 (2), 382-402 (1998).</li>
<li>Serebriiskii, I. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+peptides%2C+proteins%2C+and+drugs+that+selectively+interact+with+protein+targets%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Detection of peptides, proteins, and drugs that selectively interact with protein targets.</a> Genome Res. 12, 1785-1791 (2002).</li>
<li>Yang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+role+for+PELP1+in+nonandrogenic+activation+of+the+androgen+receptor+in+prostate+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Central role for PELP1 in nonandrogenic activation of the androgen receptor in prostate cancer.</a> Mol Endocrinol. 26 (4), 550-561 (2012).</li>
<li>Zhan, Y. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orphan+nuclear+receptor+Nur77+regulates+LKB1+localization+and+activates+AMPK%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">The orphan nuclear receptor Nur77 regulates LKB1 localization and activates AMPK.</a> Nat Chem Biol. 8 (11), 897-904 (2012).</li>
</ol>

Nessun conflitto di interessi dichiarati.

Nel nostro test Y2H modificata, abbiamo identificato residui importanti per le interazioni ketoconazolo su PXR 6. Dal SRC-1 è un coactivator (ed è stato clonato nel vettore pGADNot), abbiamo provato anche se SRC-1 potrebbe attivare l&#39;espressione lacZ quando clonato nel sistema vettore PSH e se questo cambierebbe il profilo di attivazione e / o influenzare il leakiness di il lievito saggio del doppio ibrido. Utilizzando i nostri plasmidi ridisegnati abbiamo effettuato test di due ibride in ERG3 Δ ...

Il lievito due ibridi (Y2H) saggio è ampiamente utilizzato per rilevare le interazioni proteina-proteina e più recentemente per la scoperta di nuove piccole molecole che interrompono proteina-proteina complessi di interazione 7, 8, 9, 10, 11. Tuttavia, gli approcci convenzionali di questo test, utilizzato per la scoperta di nuovi farmaci o di &quot;hits&quot;, non consentono per il rilevamento di residui di interazione allosterici di prodotti chimici composti all&#39;interno di superfici proteina-proteina, che, quando alterati ancora interagire e consentire l&#39;interrogatorio dei residui alterati 11 . Infatti, tale metodo (s), se possibile sviluppare, consentirebbe un sistema di lievito trattabili per la valutazione ad alta velocità di residui di interazione allosterici critiche per l&#39;interazione proteina-proteina perturbazione. Nel contesto di scoperta di farmaci, il modo più diretto per stabilire l&#39;interazione dei composti con proteine ​​comporterebbe determinazione strutturale (es cristallizzazione del complesso proteina-inibitore). Questi metodi sono cumbersome, utilizzare le risorse elaborate e non è tecnicamente possibile effettuare studi strutturali su tutte le proteine. Sistemi di screening di stupefacenti genetica trattabili sono state stabilite nei batteri 1, 2 e altri sistemi modello, come mammiferi two-hybrid. Tuttavia, questi sistemi devono ottimizzazione e sistemi alternativi come Y2H sono ancora i più testato nella scoperta di farmaci. Esistono limitazioni che includono scarsa sensibilità e affidabilità delle interazioni con metodi singolari 13, tuttavia, un singolo test Y2H può essere modificato per rispondere a domande specifiche relative ai residui di interazione. Nel campo della ricerca recettore nucleare, Y2H è stato usato per definire proteine ​​interagenti 14, tuttavia, queste interazioni proteina sono state raramente utilizzata per definire la natura in cui ligandi / antagonisti interagiscono con complessi recettore-proteine ​​nucleari. Così, il nostro laboratorio concentrato sforzi sulla definizione di un metodo, in particolare per le proteine ​​recettori che non sonofacilmente suscettibili di proteomica metodi basati, che sarebbe dissotterrare romanzo ligando / antagonista interagire residui utilizzando un Y2H basato piattaforma di scoperta inverso. Sulla base della nostra precedente scoperta che il ketoconazolo interrompe PXR e il suo attivatore SRC-1, abbiamo sviluppato un nuovo sistema Y2H che ci permettono di definire e interrogare ketoconazolo interagire residui sulla PXR 6 inversa. Il nostro metodo si basa sulle proprietà della proteina GAL4 lievito che consiste di domini separabili responsabili dell&#39;attivazione di legame al DNA e trascrizionale. La proteina PXR LBD è espressa come una fusione al dominio LexA DNA-binding (DNA-BD), mentre le lunghe co-attivatori SRC-1 (coactivator recettore steroide 1) proteine ​​sono espresse come fusioni al dominio di attivazione GAL4 (AD ). Interazione tra PXR e SRC-1 proteine ​​di fusione porta all&#39;attivazione trascrizionale di GAL4 siti di legame contenenti gene reporter β-Lac Z che viene integrato nel genom lievitoe. Ketoconazolo, un antagonista PXR, interrompe PXR e SRC-1 interazione 15, 16, 17 e si può rilevare l&#39;interazione di PXR e SRC-1 in presenza o assenza di ketoconazolo dopo colorazione colonie su filtri per l&#39;attività X-gal. Il principio di Y2H è illustrato in Figura 1 e la procedura sperimentale è riassunto in Figura 2.

<table><tbody><tr><td>Ceppo di lievito CTY10-5d erg3&Delta;/erg11&Delta;</td><td>Il nostro</td><td>lievito CTY10-5d da laboratorio è stato sottoposto a doppio knock out ERG3 e ERG11 (erg3&Delta;/erg11&Delta;) geni6.</td><td></td></tr><tr><td>YPD Growth Medium</td><td>BD Biosciences</td><td>630409</td><td></td></tr><tr><td>Difco Yeast Nitrogen Base (YNB) senza aminoacidi e solfato di ammonio</td><td>BD Biosciences</td><td>233520</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Biosciences</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>CSM-HIS/-Leu Complete Supplement Mixture</td><td>MP Biomedicals</td><td>4250-412</td><td></td></tr><tr><td>ONPG (O-nitrofenil &Beta;-D- galattopiranoside).</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N1127</td><td></td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>Luria Brodo (LB)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3022</td><td></td></tr><tr><td>X-Gal</td><td>Fisher</td><td>BP-1615</td><td></td></tr><tr><td>Salmone sonicato Sperma DNA bollito (10 mg/ml)</td><td>Life Technology</td><td>156-017</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina</td><td>Acros Organics</td><td>61177</td><td></td></tr><tr><td>Ketoconazolo</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K1003</td><td></td></tr><tr><td>N,N-Dimetilformammide</td><td>Acros Organics</td><td>326871000</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di litio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4158</td><td></td></tr><tr><td>50% PEG-3350 soluzione, sterilizzato con filtro</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-3640</td><td></td></tr><tr><td>Membrana in nitrocellulosa Whatman</td><td></td><td>10402091</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Piastra di Petri</td><td>Fisher</td><td>875712</td><td></td></tr><tr><td>5'-ACCGGATCCCGATGAAGA AGGAGATGATCATGTCC-3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD primer forward per pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-AGAGTCGACTCAGCTA CCTGTGATGCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>PXR LBD reverse primer for pSH2-1</td></tr><tr><td>5'-TATAGC GGCCGCATGAGTG GCCTCGGGGACAGTTCATCC -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 primer forward per pGADNOT</td></tr><tr><td>5'-GCGGTCGACTTATTCAGTCA GTAGCTG -3'our</td> <td>lab</td><td></td><td>SRC-1 primer inverso per pGADNOT</td></tr><tr><td>Platinum PCR Supermix</td><td>Invitrogen</td><td>11306-016</td><td></td></tr><tr><td>BamHI</td><td>il nostro laboratorio</td><td>R0136</td><td></td></tr><tr><td>SalI</td><td>il nostro laboratorio</td><td>R0138</td><td></td></tr><tr><td>NotI</td><td>il nostro laboratorio</td><td>R0189</td><td></td></tr></tbody></table>

reverse lievito sistema two-ibrida per identificare mammiferi nuclear receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

Reverse Yeast Two-hybrid System to Identify Mammalian Nuclear Receptor Residues that Interact with Ligands and/or Antagonists

Come regolatore critico del metabolismo dei farmaci e infiammazione, Pregnane X Receptor (PXR), svolge un ruolo importante nella patofisiologia collegamento metabolismo e infiammazione (es. steatosi epatica) 1,2. C&#39;è stato molto progresso per l&#39;identificazione di ligandi agonisti a PXR, tuttavia, ci sono le descrizioni limitate di antagonisti drug-like e dei loro siti di legame su PXR 3,4,5. Una barriera critica è l&#39;incapacità di purificare efficientemente proteina intera per studi strutturali con antagonisti nonostante PXR è stato clonato e caratterizzato nel 1998. Il nostro laboratorio ha sviluppato un romanzo di lievito ad alta velocità basata saggio del doppio ibrido per definire un antagonista, ketoconazolo di residui vincolante per PXR 6. Il nostro metodo prevede la creazione di librerie mutazionali che salvare l&#39;effetto delle singole mutazioni sulla superficie AF-2 di PXR previsto per interagire con ketoconazolo. Rescue o seco &quot;guadagno di funzione&quot;nd mutazioni possono essere fatte in modo tale che le conclusioni riguardanti l&#39;interazione genetica di ketoconazolo e il residuo di superficie (s) on PXR sono fattibili. Così, abbiamo sviluppato un elevato throughput two-hybrid schermo lievito di mutanti PXR che interagiscono con il suo coactivator, SRC-1. Usando questo approccio, in cui il lievito è stato modificato per accogliere lo studio del farmaco antifungino, ketoconazolo, potremmo dimostrare mutazioni specifiche su PXR arricchiti in cloni incapaci di legarsi al ketoconazolo. Con logica inversa, possiamo concludere che i residui originali siano residui interazione diretta con ketoconazolo. Questo test rappresenta un romanzo, test genetico trattabili allo schermo per antagonista siti di legame sulle superfici del recettore nucleare. Questa analisi può essere applicata a qualsiasi farmaco indipendentemente dal suo potenziale citotossico di lievito e di proteina cellulare (s) che non può essere studiata utilizzando biologia strutturale standard o metodi basati proteomica. Potenziali insidie ​​comprendono l&#39;interpretazione dei dati (metodi complementari utile), relizione sul metodo unico Y2H, esperienza nella gestione di lievito o l&#39;esecuzione di lievito saggi di due ibridi, e l&#39;ottimizzazione del dosaggio.

Noi eseguito un test per vedere se potevamo rilevare una lettura colorimetrica dell&#39;associazione di PXR e del recettore steroide coactivator-1 (SRC-1). Dato che il lievito ha una significativa produzione di sterolo, è stato precedentemente dimostrato che l&#39;espressione lacZ nel lievito può essere indotta senza la necessità di ulteriori ligando esogeno. Abbiamo trovato che l&#39;espressione lacZ (colonie blu) è anche indotto nel ceppo di lievito trasformato con PXR e SRC-1, tuttavia, non vi è alcuna induzione dell...

Ketoconazolo lega e antagonizza Pregnane X Receptor (PXR) attivazione. Di lievito di alta schermi di throughput di mutanti PXR definiscono una regione unica per l&#39;associazione ketoconazolo. Questo metodo genetico a base di lievito scopre interazioni recettore nucleare nuovi con leganti che associano con siti di legame di superficie.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

As a critical regulator of drug metabolism and inflammation, Pregnane X Receptor (PXR), plays an important role in disease pathophysiology linking ...

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere un saggio in lievito ad alto rendimento basato sul sistema two-hybrid, che evidenzia le interazioni tra il recettore Pregnan X (PXR) e l'inibitore molecolare di piccole dimensioni chiamato ketoconazolo. Questo risultato si ottiene innanzitutto costruendo i plasmidi per il sistema two-hybrid in lievito: uno esprime il dominio di legame per il ligando umano del PXR, mentre l'altro esprime il coattivatore del recettore steroideo, SRC-1 (COACTIVATOR one). La presenza di ketoconazolo interrompe l'interazione tra il PXR umano e SRC-1, come dimostrato da saggi colorimetrici in fase liquida per la β-galattosidasi.Insieme alla selezione colorimetrica delle colonie su un filtro, la selezione di mutanti del PXR in presenza di chetocanazolo permette di identificare le mutazioni che rendono il recettore immune all'azione del farmaco, consentendo infine di rilevare in modo semplice l'espressione mediante ispezione visiva e ai risultati dei saggi liquidi di beta-galatto. I saggi SASE vengono utilizzati per evidenziare variazioni nell'attivazione del PXR in presenza di chetocanazolo, il che consente di identificare i residui originali coinvolti nell'interazione. Abbiamo avuto per la prima volta l'idea di questo metodo nel laboratorio del dottor Manny, dove sono associato.Quando ci siamo trovati di fronte a dati strutturati incompleti sul PXR, le tecniche biochimiche non ci hanno permesso di procedere con l'identificazione, specialmente per interazioni di dimensioni molto ridotte e non facilmente modificabili. Per la caratterizzazione strutturale, basandoci sul principio della rilevazione di mutanti del PXR resistenti alla kitonina, abbiamo sviluppato un metodo che risulta gestibile, fattibile e può essere eseguito in pochi giorni con un'elevata capacità di analisi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle forze farmacologiche di legame di piccole molecole con proteine recettrici, può essere applicato anche ad altri sistemi, come qualsiasi proteina che svolga un ruolo patogenetico in una malattia, in particolare quando esistono limitazioni negli approcci di biologia strutturale che impediscono l'identificazione preliminare dei residui di legame, al fine di comprendere e progettare meglio interagenti a bersaglio molecolare ridotto. Per iniziare, amplificare il dominio di legame del ligando PXR umano e la proteina SRC umana completa come descritto nel protocollo testuale. Verificare i prodotti della PCR eseguendoli su un gel di agarosio all'1%.Successivamente, purificare i prodotti PCR dal gel AROS. Digestire i prodotti PCR in due vettori ibridi come descritto nel protocollo testuale e posizionare i campioni di digestione in un bagno termostatato a 37 gradi Celsius per un'ora. Purificare i campioni digeriti da un gel di agarosio all'1%, quindi legare i prodotti PCR digeriti e purificati con i due vettori ibridi prima di trasformarli in cellule competenti DH cinque alfa, seguiti da un'incubazione notturna a 37 gradi Celsius.Scegliere le colonie e isolare il DNA plasmidico; utilizzare la digestione con enzimi di restrizione per confermare la presenza del vettore e dell'inserzione, quindi verificare tutti i plasmidi positivi mediante sequenziamento. Inoculare il ceppo di lievito in cinque millilitri di YAPD e incubare per tutta la notte con agitazione costante a 220 giri al minuto e 30 gradi Celsius. La mattina seguente, inoculare il lievito in rapporto 1 a 20 in cinque millilitri di YAPD e incubare fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri pari a 0,2 mediante agitazione costante.Centrifugare le cellule a 2000 RPM in una microcentrifuga per due minuti e rimuovere il soprannatante. Quindi lavare il pellet due volte con acqua autoclavata e una volta con acetato di litio 0,1 molare. Dopo aver rimosso il soprannatante dell'ultimo lavaggio, aggiungere al pellet cellulare i reagenti per la trasformazione elencati nel protocollo del testo e vortexare per omogeneizzare.Quindi aggiungere i vettori contenenti PXR e contenenti SRC preparati prima di mescolare. Nuovamente, trasferire con pipetta la miscela di trasformazione in un tubo in polistirene con fondo rotondo e agitare per 30 minuti. Spostare il tubo in un bagno termico a 42 gradi Celsius e incubare per ulteriori 30 minuti.Successivamente, centrifugare il tubo a 2000 giri/min per due minuti dopo la rimozione del sopranatante. Lavare il pellet una volta con acqua per autoclave, pipettando 100 microlitri di acqua sterile nel tubo e risospendendo le cellule mediante leggeri colpetti con le dita e pipettaggio. Quindi piastrare le cellule su mezzo dropout privo di istidina e leucina e incubare a 30 gradi Celsius per tre-quattro giorni per isolare i trasformanti.Per iniziare il saggio del filtro Xga, ritagliare un triangolo da una membrana di nitrocellulosa in modo che si adatti a una porzione di 10 millimetri di una piastra di Petri. Etichettare la membrana di nitrocellulosa per indicarne l'orientamento. Posizionare la membrana di nitrocellulosa precedentemente contrassegnata sulle colonie di lievito, assicurandosi che la membrana sia a contatto con la superficie del terreno di coltura della piastra.Rimuovere la membrana. Posizionarla con il lato delle colonie verso l'alto su un filtro di carta da tre millimetri e mettere la membrana insieme al filtro di carta a meno 80 gradi Celsius per 15 minuti. Successivamente, posizionare due dischetti di carta da filtro da tre millimetri in una piastra di Petri e inzupparli con cinque millilitri di soluzione xal.Svuotare il tampone in eccesso dalla piastra di Petri e posizionare la membrana in nitrocellulosa nella piastra con il lato delle colonie rivolto verso l'alto. Chiudere il coperchio assicurandosi che la membrana sia a contatto completo con la carta filtro e sia completamente bagnata. Avvolgere la piastra di Petri con carta stagnola e incubare a 37 gradi Celsius per 30 minuti fino alla notte successiva per far crescere i lieviti e aggiungere il mezzo liquido senza istidina e leucina fino a raggiungere una densità ottica a 600 nanometri di 0,7.Trasferire un millilitro di mezzo in una provetta microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare a 3000 RPM per due minuti. Dopo aver eliminato il soprannatante, aggiungere un millilitro di tampone Z al pellet e centrifugare. Come in precedenza, aggiungere 150 microlitri di tampone Z con mercaptoetanolo per risospendere il pellet cellulare.Quindi aggiungere 50 microlitri di cloroformio e 20 microlitri di SDS 0,1% in modo vigoroso. Vortexare il campione per 15 secondi. Successivamente, aggiungere 700 microlitri di soluzione ONPG, impostare il timer e incubare a 30 gradi Celsius per il tempo necessario allo sviluppo del colore giallo.Dopo lo sviluppo del colore, annotare il tempo totale di reazione. Aggiungere 500 microlitri di carbonato di sodio uno molare per arrestare la reazione. Quindi determinare l'assorbanza a 420 nanometri.Come passaggio finale, calcolare le unità di Miller come descritto nel protocollo del testo. Poiché il lievito presenta una produzione significativa di steroli, l'espressione di laxy nel lievito può essere indotta senza la necessità di un ligando esogeno aggiuntivo. Il saggio xal lift ha rivelato che l'espressione di laxy, visibile attraverso le colonie blu, è indotta nel ceppo di lievito trasformato con PXR e SRC uno.Questo è mostrato anche nel saggio liquido con beta-galattosidasi. Tuttavia, non si osserva alcuna induzione dell'espressione di laxy nei lieviti trasformati con i vettori vuoti PXR da solo o SRC uno da solo. Il chetoconazolo interrompe le interazioni tra P XR e SRC uno nel lievito, poiché tutte le colonie provenienti dal filtro di replica erano bianche, risultato confermato anche dall'attività beta-galattosidasi significativamente ridotta nei saggi enzimatici in soluzione.Quando le trasformazioni di lievito sono state eseguite con S rrc uno sul doppio mutante P XR, è emerso che le colonie esposte al chetoconazolo mantengono comunque l'espressione di laxy. Questo risultato è simile a studi precedenti condotti in questo laboratorio, che hanno mostrato come lo stesso PXR possa essere attivato da un ligando forte, ma sia immune agli effetti antagonisti del chetoconazolo nei saggi su modelli mammiferi. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire con attenzione un ibrido AC e delle modifiche necessarie richieste per lo studio di residui di legame di piccole molecole sulle proteine.Quando si tenta questa procedura, è importante ricordare di ottenere una libreria altamente diversificata di mutanti del proprio recettore, raggiungere un'ottima efficienza di trasformazione per ciascuno dei 200 plus, sviluppare repliche quasi identiche del filtro in situ con o senza farmaci, e infine eseguire un'accurata ispezione visiva e chimica per la rilevazione della nase. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come Ian 200 a Acids protein pro as acids e i modelli omologhi di docking iCal possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio se almeno bend uc è applicabile alla proteina in cellule umane. E in caso affermativo, se sia possibile creare un modello che difenda questi residui come un farmaco.

reverse-yeast-two-hybrid-system-to-identify-mammalian-nuclear

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

MITO permette di rilevare sensibile delle interazioni transienti e stabili tra proteine ​​che sono espresse nel modello organismo Saccharomyces cerevisiae. E 'stato applicato con successo allo studio esogeni e lievito proteine ​​integrali di membrana allo scopo di individuare i propri partner che interagiscono in modo elevato throughput.

Split-Ubiquitina membrana a base di lievito Due-Hybrid (MITO) Sistema: un potente strumento per identificare interazioni proteina-proteina

Abbiamo modificato il lievito tradizionale doppio ibrido di screening, un efficace strumento genetico per identificare interazioni proteiche. Questa modifica riduce notevolmente il processo, riduce il carico di lavoro e, soprattutto, riduce il numero di falsi positivi. Inoltre, questo approccio è riproducibile ed affidabile.

Modificato lievito-sistema del doppio ibrido per identificare proteine ​​che interagiscono con il fattore di crescita progranulina

In questo video, dimostriamo il test del lievito modificato one-hybrid, che rileva più proteine che interagiscono con il DNA bersaglio. Le cellule di lievito trasformate contengono la sequenza di DNA bersaglio a monte del gene reporter. Inoltre, esprimono proteine del fattore di trascrizione. Quando le proteine formano complessi e si legano al DNA bersaglio, il gene reporter viene espresso e può essere rilevato enzimaticamente.

Saggio ibrido lievito-uno modificato per rilevare le interazioni eteromeriche tra complesso proteico e DNA

L'oligomerizzazione del recettore della rianodina, un canale ionico omo-tetramerico che media il rilascio di Ca2+ dai depositi intracellulari, è fondamentale per la contrazione del muscolo scheletrico e cardiaco. Qui, presentiamo metodi complementari in vivo e in vitro per rilevare l'autoassociazione proteica e determinare la stechiometria omo-oligomera.

Approcci genetici e biochimici per<em&gt; In Vivo</em&gt; e<em&gt; In Vitro</em&gt; La valutazione di proteine ​​Oligomerizzazione: Il rianodina Receptor Case Study

proteine ​​effettrici batteriche sono importanti per stabilire le infezioni di successo. Questo protocollo descrive l'identificazione sperimentale di partner di legame proteici di una proteina batterica effettrici nel suo ospite vegetali naturali. Identificare queste interazioni effettrici via lievito schermi doppio ibrido è diventato uno strumento importante per svelare le strategie di patogenicità molecolari.

Svelare la funzione di un batterica Effector da un non-coltivabili fitopatogeni Utilizzando un lievito schermo doppio ibrido

Il saggio di un ibrido di lievito modificato qui descritto è un'estensione del saggio classico del lievito un ibrido (Y1H) per studiare e convalidare l'interazione heteromera della proteina-complesso del DNA in un sistema eterologo per qualsiasi studio genomico funzionale.

Un lievito modificato - un sistema ibrido per studi di interazione tra DNA e proteine ​​eteromeriche

Questo protocollo viene descritto come stabilire un sistema di reporter che può essere utilizzato per identificare e quantificare le interazioni recettore-ligando.

Un sistema di BW Reporter per lo studio di interazioni recettore-ligando

Presentiamo un metodo per analizzare la 4-idrossi-tamoxifen-dipendente dell'estrogeno recettore alfa ligand-legantesi dominio dimerizzazione attività usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi.

Rilevazione dell'attività di dimerizzazione del dominio Ligand-legantesi del recettore degli estrogeni usando l'analisi di due-ibrido dei mammiferi

Le interazioni delle biomolecole, come le interazioni proteina-proteina, sono la base molecolare delle funzioni biologiche. Se i mutanti con interazione nulla/alterata che mancano specificamente dell'interazione rilevante possono essere isolati, saranno di grande aiuto per comprendere le funzioni di questa interazione. Questo articolo presenta un modo efficiente per isolare i mutanti con interazione, null/impromesse.

Isolamento di mutanti nulli/alterati di interazione utilizzando il saggio a due ibridi di lievito

La progettazione delle proteine comporta la costruzione di sequenze di amminoacidi e l'incorporazione di motivi specifici per creare varianti funzionali. Questo approccio è fondamentale per lo sviluppo di peptidi antimicrobici (AMP) per combattere i patogeni resistenti agli antibiotici. Questo articolo presenta una procedura per la costruzione di proteine utilizzando vari strumenti bioinformatici.

Applicazione di I TASSER, trRosetta, UCSF Chimera, HADDOCK server e HEX loria per la progettazione De Novo e In Silico di proteine

Scopri il sistema di screening two-hybrid nel lievito per identificare interazioni tra il recettore nucleare PXR e il farmaco ketoconazolo. Questo metodo ad alto rendimento rivela mutazioni che conferiscono resistenza al farmaco.

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti (Video) | JoVE Journal

Reverse lievito sistema Two-ibrida per identificare mammiferi Nuclear Receptor residui che interagiscono con leganti e / o antagonisti

Esplora altri video