Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di preparare un microscopio standard a due fotoni per l'imaging intravitale ad alta risoluzione. Ciò si ottiene allineando prima il microscopio, che include la regolazione dei laser. Successivamente, il multiplexer del fascio viene allineato per ottenere una forma del fascio perfetta e una disposizione del fascio illuminato.

In caso di scansione multiraggio, le immagini grezze vengono acquisite scansionando il campione con il modello di illuminazione a strisce. Infine, viene applicato un algoritmo per calcolare l'immagine finale ad alta risoluzione. In definitiva, la microscopia con illuminazione a strisce viene utilizzata per mostrare i dettagli del comportamento del sistema immunitario all'interno dei centri germinali nei linfonodi dei topi, precedentemente inaccessibili alla microscopia intravitale.

Il vantaggio principale di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come l'illuminazione strutturata o la microscopia di localizzazione, è che può essere applicata a grandi profondità di tessuto in campioni vivi. Non richiede alcuna modifica della forma del raggio laser, mantenendo così il metodo molto semplice e facile da implementare su qualsiasi microscopio multifotone. La configurazione utilizzata per la microscopia con illuminazione a strisce di due fotoni multi-raggio è mostrata qui per ottenere una risoluzione e una qualità del contrasto ottimali con il livello più basso di sbiancamento delle foto e un'acquisizione più rapida.

Prendi in considerazione la possibilità di apportare modifiche alla configurazione come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver effettuato le regolazioni, verificare che il raggio ritorni allo specchio che si trova direttamente sopra lo specchio di ingresso all'estremità del compressore di impulsi basato sul prisma. Dopo aver impostato il percorso della luce da qui, il raggio viene riflesso nel multiplexer del raggio.

Se si esegue l'illuminazione a strisce multiraggio, eseguire la microscopia multifotone con lo scanner spento. Allineare gli specchi nel multiplexer del fascio posizionando un campione a fluorescenza omogenea sul tavolino e focalizzare il raggio laser all'interno del campione, ma vicino alla superficie superiore. Vicino alla lente frontale degli obiettivi.

Impostare il microscopio sulla modalità multiraggio e scegliere il numero di raggi e la polarizzazione. Ad esempio, P per trovare il raggio laser visualizzando la diapositiva fluorescente, impostare l'otturatore P aperto e far funzionare la telecamera CCD continuamente mentre si mette a fuoco il raggio, assicurandosi che sia in posizione centrale. Quando si allinea il raggio P, passare alla modalità 64 raggi e aprire l'otturatore corrispondente.

Controllare la posizione della trave. Regolazione dal primo al quinto specchio multiplexer del raggio, assicurandosi che le luci del raggio siano equidistanti. Poiché gli algoritmi di illuminazione a strisce si basano su questo presupposto, sostituire il campione uniformemente fluorescente con quello strutturato in modo eterogeneo.

Ad esempio, campionare la radice dell'area conval e scansionare un'immagine multiraggio. Verificare che l'immagine appaia nitida, uniforme e diritta. Sostituire il campione eterogeneo con il campione omogeneo.

Avviare lo scanner XY per controllare il processo di scansione. Per generare il modello di eccitazione dell'immagine a strisce per la scansione multiraggio. Spostare lo specchio dello scanner Y perpendicolarmente alla linea del raggio illuminato.

Ripeti il modello generato qui indicato dal numero di blocchi spostando lo specchio dello scanner X qui chiamato spostamento dei blocchi per generare un'immagine a strisce rettangolari. Riposizionare il campione eterogeneo e utilizzare lo scanner come trigger principale. Sincronizza la fotocamera con lo scanner per acquisire e salvare automaticamente un'immagine con strisce per acquisire ripetutamente immagini con strisce.

Sposta lo specchio dello scanner X in diverse posizioni scegliendo qui un numero sufficiente di passaggi di ripetizione, il numero di turni e la lunghezza del passo appropriata. Sposta il passo tra due immagini a strisce successive per coprire la distanza tra due larghezze di raggio consecutive. Impostare lo spostamento X su un valore inferiore al limite di risoluzione laterale alla lunghezza d'onda di eccitazione data.

Ad esempio, l'utilizzo di 10 passi dello specchio dello scanner X per turno e 12 o 13 turni porta alla migliore risoluzione spaziale. Risultati con la diapositiva radice dell'area conval per ottimizzare questi due valori fino a quando l'immagine dell'area conversale diventa più nitida. Utilizzare lo strumento Profilo linea sulle immagini CCD convenzionali e sulle immagini di illuminazione a strisce calcolate.

Confronta la larghezza dei profili delle linee, che in questo esempio è il segnale fluorescente dalle pareti delle celle convalidi. Acquisisci ogni immagine a strisce grezze sincronizzata con il movimento dello scanner e salvala separatamente, ad esempio, in file TIFF o binari. Per generare una matrice bidimensionale dell'immagine di illuminazione a strisce ad alta risoluzione, aprire un set completo di immagini a strisce grezze come matrici nella routine di valutazione.

Utilizzare l'algoritmo minimo massimo o un algoritmo basato sulla trasformata di Fourier, come descritto in dettaglio in precedenza, per eseguire l'illuminazione a strisce, multi-raggio, microscopia multi-fotone nei tessuti profondi. Negli organismi vivi acquisire immagini a strisce in diverse profondità di tessuto nel tempo e valutarle come precedentemente descritto, per generare un filmato 3D ad alta risoluzione dell'interazione dinamica tra centro germinale, cellule B e cellule dendritiche follicolari. Le dimensioni della funzione di diffusione effettiva del punto corrispondono alla risoluzione spaziale di un microscopio.

Abbiamo misurato questa funzione tridimensionale acquisendo il segnale di generazione delle seconde armoniche delle fibre di collagene o il segnale fluorescente di perle di polistirene a 100 nanometri che emettono a 515 nanometri nei linfonodi mionici. Utilizzando la nostra illuminazione a strisce multiraggio T-P-L-S-M rispetto alle tecniche di microscopia a scansione laser a due fotoni consolidate, come il rilevamento di campo T-P-L-S-M per mezzo di telecamere CCD e il rilevamento di punti T-P-L-S-M. Da queste misurazioni, diventa evidente che sulla superficie del campione, sia la risoluzione laterale che quella assiale corrispondono ai valori attesi previsti dalla teoria della diffrazione.

Tuttavia, con l'aumentare della profondità di imaging, e quindi con un percorso ottico crescente delle radiazioni di eccitazione e di emissione attraverso un mezzo con indici di rifrazione molto variabili, la risoluzione spaziale si deteriora considerevolmente indipendentemente dalla configurazione utilizzata. Utilizzando M-B-S-I-T-P-L-S-M indipendentemente dalla profondità di imaging, abbiamo raggiunto una risoluzione laterale migliore di circa il 20% e una risoluzione assiale migliore del 220%. Rispetto agli approcci standard T-P-L-S-M.

La selezione clonale delle cellule B durante la risposta immunitaria all'interno degli organi linfoidi secondari di topi adulti è il primo passo nel loro percorso di differenziazione in cellule B di memoria o plasmacellule. In questo processo, si ritiene che l'interazione altamente dinamica tra le cellule dendritiche follicolari e le cellule B a livello delle strutture immunocomplesse all'interno dei centri germinali svolga un ruolo centrale. Solo utilizzando una tecnologia di microscopia intravitale altamente risolutiva è possibile sezionare questa comunicazione cellulare e le sue implicazioni per la risposta immunitaria qui osservata come marcato da anti CD 2135 FAB ATO five 90 su cellule dendritiche follicolari.

M-B-S-I-T-P-L-S-M offre per la prima volta la possibilità di visualizzare e quantificare in modo intervitale le dimensioni dei cluster di depositi di immunocomplessi fino a 120 micron di profondità nei centri germinali dei linfonodi popali. Queste immagini mostrano il confronto diretto tra le immagini 3D a fluorescenza dei depositi di immunocomplessi in un centro germinale acquisite da PMT convenzionale e M-B-S-I-T-P-L-S-M. Inoltre, le interazioni dei depositi di immunocomplessi con le cellule B del centro germinale potrebbero essere altamente risolte e possono ora essere studiate in combinazione con sonde funzionali intravitali per la proliferazione, la differenziazione o l'apoptosi.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante tenere presente che con una tecnica basata sul rilevamento della fotocamera, la velocità di acquisizione è circa otto volte superiore, mentre la profondità massima di imaging è inferiore di circa il 25% rispetto a quella ottenuta con un microscopio multifotone standard basato su fotomoltiplicatore. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare il tuo microscopio multifold per lavorare con il metodo di illuminazione a strisce, inclusa la regolazione del percorso luminoso del microscopio, l'allineamento dei dorsali del raggio, il calcolo dei parametri di scansione e i modi per calcolare l'immagine finale ad alta risoluzione. Per esperimenti intravitali sui tessuti profondi.