Altamente Risolto intravitale Striped-illuminazione Microscopia dei Centri Germinal

L'obiettivo generale di questa procedura è preparare un microscopio standard a due fotoni per l'acquisizione intra vitale ad alta risoluzione. Questo risultato si ottiene innanzitutto allineando il microscopio, operazione che comprende la regolazione dei laser. Successivamente, si allinea il moltiplicatore di fascio per ottenere una forma del fascio e un allineamento del fascio ottimali.

Nel caso della scansione multiraggio, le immagini grezze vengono acquisite scansionando il campione con un modello di illuminazione a strisce. Infine, viene applicato un algoritmo per calcolare l'immagine finale ad alta risoluzione. In definitiva, la microscopia con illuminazione a strisce viene utilizzata per mostrare dettagli del comportamento del sistema immunitario all'interno dei centri germinativi nei linfonodi dei topi, precedentemente inaccessibili alla microscopia intravitale.

Il principale vantaggio di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti come la microscopia a illuminazione strutturata o la microscopia di localizzazione è che può essere applicata a grandi profondità nei tessuti di campioni vivi. Non richiede alcuna modifica della forma del fascio laser, mantenendo così il metodo molto semplice e facile da implementare in qualsiasi microscopio a fotoni multipli. L'allestimento utilizzato per la microscopia a illuminazione striata a due fotoni con fasci multipli è qui mostrato per ottenere una risoluzione e una qualità del contrasto ottimali con il livello più basso di fotobiancamento e la velocità di acquisizione più elevata.

Valutare la possibilità di apportare delle modifiche al setup come indicato nel protocollo testuale. Dopo aver effettuato le regolazioni, verificare che il fascio ritorni allo specchio posizionato direttamente sopra lo specchio di ingresso alla fine del compressore di impulsi basato su prisma. Una volta stabilito il percorso della luce, il fascio viene riflesso nel multiplexer del fascio.

Se si esegue un'illuminazione a strisce con fasci multipli, utilizzare la microscopia a fotoni multipli con lo scanner spento. Allineare gli specchi nel moltiplicatore di fascio posizionando un campione uniformemente fluorescente sul palchetto e focalizzando il fascio laser all'interno del campione, ma vicino alla superficie superiore. Vicino alla lente frontale dell'obiettivo.

Impostare il microscopio sulla modalità multi-fascio e selezionare il numero di fasci e la polarizzazione. Ad esempio, utilizzare P per individuare il fascio laser mediante l'immagine dello slide fluorescente, aprire lo scatto di P ed eseguire continuamente la fotocamera CCD mentre si mette a fuoco il fascio, assicurandosi che sia in posizione centrale. Durante l'allineamento del fascio P, passare alla modalità 64 fasci e aprire lo scatto corrispondente.

Verificare la posizione del fascio. Regolare gli specchi del multiplexer dal primo al quinto, assicurandosi che i fasci luminosi siano equidistanti. Poiché gli algoritmi di illuminazione a strisce si basano su questa ipotesi, sostituire il campione fluorescente uniforme con uno strutturato in modo eterogeneo.

Ad esempio, prelevare un campione di radice nell'area Conval ed eseguire la scansione di un'immagine multiraggio. Verificare che l'immagine appaia nitida, uniforme e dritta. Sostituire il campione eterogeneo con un campione omogeneo.

Avviare lo scanner XY per controllare il processo di scansione. Per generare il modello di eccitazione a immagine striata per la scansione multi-raggio. Muovere lo specchio dello scanner Y perpendicolarmente alla linea illuminata dal fascio.

Ripetere il modello generato qui indicato dal numero di blocchi spostando lo specchio del blocco X chiamato spostamento del blocco per generare un'immagine a strisce rettangolari. Riposizionare il campione eterogeneo e utilizzare lo scanner come trigger principale. Sincronizzare la telecamera con lo scanner per acquisire e salvare automaticamente un'immagine a strisce, ripetendo l'acquisizione di immagini a strisce.

Spostare lo specchio dello scanner X in diverse posizioni selezionando un numero sufficiente di passaggi di ripetizione qui, il numero di spostamenti e la lunghezza del passo appropriata qui. Passo di spostamento tra due immagini a strisce successive per coprire la distanza tra due larghezze di fascio consecutive. Impostare lo spostamento X su un valore inferiore al limite di risoluzione laterale alla lunghezza d'onda di eccitazione data.

Ad esempio, utilizzando 10 passaggi dello specchio del scanner X per ogni spostamento e 12 o 13 spostamenti si ottiene la migliore risoluzione spaziale. Modificare questi due valori agendo sull'area conval fino a quando l'immagine dell'area conval non diventa la più nitida possibile. Utilizzare lo strumento profilo lineare sulle immagini CCD convenzionali e sulle immagini calcolate con illuminazione a strisce.

Confrontare la larghezza dei profili di linea, che in questo esempio corrisponde al segnale fluorescente delle pareti cellulari. Acquisire ogni immagine grezza a strisce sincronizzata con il movimento dello scanner e salvarla separatamente, ad esempio in file TIFF o binari. Per generare una matrice bidimensionale dell'immagine di illuminazione a strisce ad alta risoluzione, aprire un insieme completo di immagini grezze a strisce come matrici nella procedura di valutazione.

Utilizzare l'algoritmo del massimo minimo oppure un algoritmo basato sulla trasformata di Fourier, come descritto in dettaglio in precedenza, per eseguire l'illuminazione a strisce, la microscopia multifascio e a fotoni multipli in tessuti profondi. Negli organismi vivi acquisire immagini a strisce a diverse profondità tissutali nel tempo e valutarle come descritto in precedenza, al fine di generare un filmato tridimensionale ad alta risoluzione delle interazioni dinamiche tra centro germinale, cellule B e cellule dendritiche follicolari. Le dimensioni della funzione di diffusione del punto efficace corrispondono alla risoluzione spaziale del microscopio.

Abbiamo misurato questa funzione tridimensionale acquisendo o il segnale di generazione di armoniche di secondo ordine delle fibre di collagene o il segnale fluorescente di microsfere di polistirene di 100 nanometri che emettono a 515 nanometri nei linfonodi mion. Utilizzando il nostro microscopio a scansione laser T-P-L-S-M con illuminazione a strisce multi-raggio, in confronto con le tecniche consolidate di microscopia a scansione laser a due fotoni, come la T-P-L-S-M con rilevazione di campo mediante telecamere CCD e la T-P-L-S-M con rilevazione puntuale. Da queste misurazioni, risulta evidente che sulla superficie del campione, sia la risoluzione laterale che quella assiale corrispondono ai valori previsti dalla teoria della diffrazione.

Tuttavia, con l'aumento della profondità di imaging, e quindi con un aumento del percorso ottico delle radiazioni di eccitazione ed emissione attraverso un mezzo con indici di rifrazione fortemente variabili, la risoluzione spaziale peggiora notevolmente indipendentemente dalla configurazione utilizzata. Utilizzando la M-B-S-I-T-P-L-S-M indipendentemente dalla profondità di imaging, abbiamo ottenuto una risoluzione laterale migliore di circa il 20% e una risoluzione assiale migliore del 220% rispetto agli approcci standard di T-P-L-S-M.

La selezione clonale delle cellule B durante la risposta immunitaria negli organi linfoidi secondari di topi adulti rappresenta il primo passo verso la loro differenziazione in cellule B della memoria o in plasmacellule. In questo processo, si ritiene che l'interazione altamente dinamica tra cellule dendritiche follicolari e cellule B a livello delle strutture di complessi immunitari all'interno dei centri germinativi svolga un ruolo centrale. Solo grazie a una tecnologia di microscopia intra vitale ad alta risoluzione è possibile analizzare questa comunicazione cellulare e le sue implicazioni per la risposta immunitaria, osservata qui mediante marcatura con anti CD 2135 FAB ATO five 90 sulle cellule dendritiche follicolari.

M-B-S-I-T-P-L-S-M offre per la prima volta la possibilità di visualizzare e quantificare in vivo le dimensioni degli aggregati di depositi di complessi immunitari fino a una profondità di 120 micron nei centri germinativi dei linfonodi poplitei. Queste immagini mostrano il confronto diretto tra le immagini di fluorescenza 3D dei depositi di complessi immunitari in un centro germinativo ottenute mediante tecnologia basata su PMT convenzionale e mediante M-B-S-I-T-P-L-S-M. Inoltre, le interazioni tra i depositi di complessi immunitari e le cellule B del centro germinativo possono ora essere risolte con elevata precisione e possono essere studiate in combinazione con sonde funzionali in vivo per la proliferazione, la differenziazione o l'apoptosi.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante tenere presente che, con una tecnica basata sul rilevamento mediante telecamera, la velocità di acquisizione è approssimativamente otto volte maggiore, mentre la profondità massima di imaging è circa il 25% inferiore rispetto a quella ottenuta con un microscopio multifotone standard basato su fotomoltiplicatore. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come configurare il proprio microscopio multifotone per utilizzarlo con il metodo di illuminazione a strisce, inclusa la regolazione del percorso ottico del microscopio, l'allineamento dei fasci laser, il calcolo dei parametri di scansione e i metodi per ottenere l'immagine finale ad alta risoluzione. Per esperimenti su tessuti profondi in vivo.