Ultrasound Imaging guidata intracardiaca iniezione di sviluppare un modello murino di Breast Cancer metastasi cerebrali Seguito da longitudinale MRI

L'obiettivo generale di questa procedura è utilizzare la guida ecografica per sviluppare un modello murino di metastasi cerebrale del carcinoma mammario, che potrà successivamente essere monitorato mediante risonanza magnetica. Questo risultato si ottiene raccogliendo cellule tumorali della mammella con tropismo cerebrale e iniettandole nel ventricolo sinistro. Con l'aiuto della guida ecografica, lo sviluppo del tumore intracranico viene quindi monitorato.

Utilizzando la risonanza magnetica, le metastasi vengono confermate mediante colorazione ematossilina ed eosina. In definitiva, un'iniezione precisa guidata dall'imaging può aumentare significativamente il successo nel monitoraggio, nella formazione e nello sviluppo delle metastasi cerebrali del carcinoma mammario. La risonanza magnetica longitudinale consente un monitoraggio non invasivo della formazione e dello sviluppo del carcinoma mammario.

Tutte le procedure sugli animali sono state approvate dal Comitato Istituzionale per la Cura e l'Uso degli Animali dell'Università del Texas Southwestern Medical Center. Per questo protocollo, avere pronte cellule M-D-A-M-B 2 31 B-R-G-F-P coltivate in mezzo DMEM contenente 10% FBS, 1% glutammina e 1% penicillina. Streptomycin monitorare sempre lo stato delle cellule e sostituire il mezzo ogni due o tre giorni. Quando si raggiunge una confluenza dell'80%, trattare con tripsina e raccogliere le cellule.

Prima di tutto, rimuovere completamente il vecchio mezzo mediante pipetta a vuoto. Quindi aggiungere cinque millilitri di PBS per lavare delicatamente le cellule finché tutte le cellule non sono ricoperte dal PBS. Successivamente, rimuovere il lavaggio.

Successivamente, aggiungere 1,5 millilitri di tripsina nella piastra. Inclinare delicatamente la piastra per assicurarsi che tutte le cellule siano ricoperte di tripsina. Rimettere la piastra nell'incubatore cellulare a 37 gradi Celsius.

Attendere un minuto e osservare le cellule al microscopio. Se sono arrotondate e galleggianti, si sono staccate. Aggiungere tre millilitri di mezzo per arrestare la digestione e trasferire la sospensione cellulare in un tubo da centrifuga mediante pipetta.

Centrifugare la miscela a 1.600 ×g per cinque minuti. Quindi rimuovere con attenzione il mezzo utilizzando una pipetta a vuoto. Successivamente, risospendere delicatamente le cellule in cinque millilitri di mezzo privo di siero utilizzando una pipetta, fino a quando non sarà visibile alcun pellet cellulare evidente e la soluzione apparirà omogenea a 50 microlitri della miscela cellulare.

Aggiungere 50 microlitri di trian blue una volta ben miscelato. Aggiungere aliquote da 10 microlitri su diverse lamelle per il conteggio cellulare. Quindi contare le cellule in base ai valori ottenuti dal contatore cellulare.

Calcolare e utilizzare la media di tutti i conteggi per oncia. Preparare ora una sospensione cellulare più accurata. Centrifugare nuovamente e risospendere a 175.000 cellule per 100 microlitri di mezzo privo di siero.

Quindi conservare le cellule sul ghiaccio per l'iniezione intracardiaca. Per questo protocollo, utilizzare topi BC nude femmine, di età compresa tra sei e otto settimane. Accedere al sistema di imaging e inizializzare la sonda.

7 0 4 a 40 megahertz. Avviare un nuovo studio e compilare i messaggi informativi di conseguenza. Successivamente, anestetizzare il topo e somministrare l'anestetico tramite un cono nasale.

Durante l'iniezione guidata, impostare la temperatura del tavolo di imaging a 37 gradi Celsius e fissare il topo al tavolo in posizione supina. Mantenere il gel ecografico a 37 gradi Celsius prima dell'imaging ed applicarne una quantità sul torace del topo. Posizionare ora il trasduttore nel supporto e abbassarlo alla profondità di imaging desiderata.

Successivamente, spostare la piastra finché non si identifica il ventricolo sinistro utilizzando l'aorta ascendente come punto di riferimento, quindi bloccare la piastra nella posizione in cui l'immagine è più nitida. Ora aspirare 100 microlitri della miscela cellulare fredda in una siringa da un millilitro dotata di ago da 22 gauge. Fissare la siringa caricata al supporto per siringa.

Quindi spostare la siringa verso il torace. E prima di entrare nel topo, spostarla con attenzione da un lato all'altro finché la punta dell'ago non si trova nel campo visivo dell'immagine. Regolare l'altezza e l'angolo dell'ago per mirare al ventricolo sinistro e, quando si è nella posizione corretta, penetrare rapidamente attraverso gli strati cutaneo e muscolare fino al ventricolo sinistro.

Sotto il controllo dell'immagine ecografica, un'indicazione di un inserimento corretto nel ventricolo sinistro è il reflusso di sangue arterioso di colore rosa chiaro nella siringa. Successivamente, iniettare lentamente la miscela cellulare al termine della procedura, rimuovere l'ago, sollevare la sonda e rimuovere il gel ecografico con una garza inumidita. Quindi liberare l'animale dal nastro e trasferirlo in una gabbia pulita con un tappetino preriscaldato.

Osservare il topo fino a quando non si è completamente ripreso, quindi controllarlo quotidianamente per alcuni giorni. Utilizzando una risoluzione normale di 78 micron quadrati, lesioni iperintense in risonanza magnetica possono essere identificate con un diametro di 310 micron. Poiché le metastasi in questo studio erano molto piccole e la necrosi e l'edema erano minimi, la lesione iperintensa nelle immagini pesate in T2 rappresentava effettivamente il tumore.

Gli studi longitudinali di risonanza magnetica su larga scala permettono una valutazione non invasiva in vivo della crescita tumorale. La risonanza magnetica ad alta risoluzione è stata in grado di rilevare diverse piccole lesioni tre settimane dopo l'iniezione intracardiaca; alla quarta settimana, tutte le lesioni osservate nella scansione precedente erano aumentate di dimensione. Sono apparse ulteriori nuove lesioni nelle immagini pesate in T2.

La colorazione ematossilina ed eosina ha rivelato lesioni metastatiche diffuse oppure la colorazione ematossilina ed eosina ha mostrato lesioni metastatiche di tipo a grappolo. VasI dilatati erano spesso visibili intorno al tumore, indicando che stava avvenendo un'angiogenesi non per gemmazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un'iniezione guidata da imaging ecografico nella cavità del ventricolo sinistro del cuore di un topo.