Metodologia per la generazione efficiente di proteine del virus vaccinia taggate fluorescentmente

Questo esperimento genera virus EO ricombinanti marcati in fluorescenza attraverso un metodo modulare e rapido basato sulla selezione dominante transitoria. In primo luogo, creare un vettore ricombinante contenente un tag fluorescente circondato da regioni minime di omologia sintetizzate, nonché marcatori per la selezione metabolica e fluorescente. Trasfetta questo vettore di ricombinazione in cellule infette e amplifica per i virus ricombinanti utilizzando la selezione metabolica e la fluorescenza.

Successivamente, rimuovere la selezione metabolica per asportare la cassetta marcatore e isolare le cellule contenenti virus ricombinanti mediante marcatore fluorescente. Selezione. I risultati delle placche virali su monostrati cellulari consentono la visualizzazione delle singole particelle virali che sono caratteristiche del gene marcato in fluorescenza. Abbiamo sviluppato questo metodo perché volevamo generare virus ricombinanti con molteplici modificazioni genetiche utilizzando un metodo di selezione che potesse essere utilizzato ripetutamente e universalmente indipendentemente dal tag.

Sebbene il principio della selezione dominante transitoria sia stato descritto in precedenza, abbiamo voluto applicarlo su scala più ampia e in modo modulare per darci maggiore flessibilità nell'apportare modifiche genomiche. Una dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché lo screening e l'isolamento della placca virale ricombinante possono essere complicati. La loro frequenza può essere bassa e quindi sono necessari alcuni metodi unici per un recupero efficiente del virus.

Così è stato etichettato un gene virale di interesse all'estremità N o C della proteina. Di conseguenza, identificare 150 coppie di basi lunghe regioni fiancheggianti di omologia. Quindi progettare una sequenza oligonucleotidica comprendente le 150 coppie di basi dei bracci sinistro e destro, separati da una coppia di siti di restrizione a scelta.

Affiancare anche questa regione con una seconda coppia di siti di restrizione diversi dalla prima coppia per consentire l'incorporazione nel vettore TDS. Una volta sintetizzato, ora verifica che l'oligonucleotide con i siti di restrizione sia progettato per essere in frame con il sito di inserzione desiderato. Per la sintesi degli oligonucleotidi, assicurarsi che i siti di restrizione siano incorporati tra il braccio sinistro e quello destro.

Abbina quelli che fiancheggiano il riquadro di lettura aperto del tag di fluorescenza preferito. Incorporare questi stessi siti di restrizione su entrambi i lati del tag di fluorescenza mediante PCR. Clona il frammento sintetizzato nel vettore TDS.

Inoltre, clonare il tag di fluorescenza nel vettore di ricombinazione risultante utilizzando i siti di restrizione tra il braccio sinistro e destro. Regioni di omologia. Infettare un monostrato di cellule BSC one con virus vaccinico e terreni privi di siero.

Un'ora dopo l'infezione. Salvare le cellule con il transfetto del terreno eagle modificato ECCO con una miscela di reagenti di ricombinazione, plasmide vettore e trasfezione in un rapporto di tre a uno in terreni privi di siero. Dopo 24 ore, raschiare e recuperare le cellule in DMEM che non contengono siero fetale bovino.

Sottoporre le cellule a tre cicli di scongelamento libero per aprire le cellule e rilasciare le particelle virali per ottenere un'adeguata separazione delle singole placche. Infettare monostrati cellulari confluenti al 100% di cellule BSC one con diluizioni seriali della preparazione di particelle virali. Sovrapporre con liquido 10% FBS e DMEM più la selezione GPT, reagenti e incubare per 24 ore.

Aspirare la sovrapposizione di liquido e utilizzare un microscopio a fluorescenza per cercare le placche. Esibisce una fluorescenza rossa diffusa corrispondente all'incorporazione della ciliegia M dal vettore TDS nel virus. A seconda del gene bersaglio e del tag di fluorescenza scelto, la fluorescenza localizzata del gene tag può essere osservata anche nella stessa placca rossa.

Ora per prelevare più placche per ogni virus ricombinante, raschiare con la punta della pipetta e con 100 microlitri di FBS al 5% contenente DMEM trasferire le cellule in una provetta eorior. Eseguire tre cicli di congelamento e scongelamento delle celle raschiate. Per rilasciare i virus ricombinanti.

Aggiungere il DMEM contenente il virus congelato a un monostrato di cellule. In una piastra a 12 pozzetti per amplificare i virus ricombinanti con reagenti di selezione GPT nei terreni di crescita. Quindi raschiare le amplificazioni riuscite a 24 ore dopo l'infezione per un test di placca di placche amplificate con successo, che mostrano fluorescenza rossa C due sei, ben suonate con un monostrato di cellule BSC uno.

Eseguire una diluizione seriale dei virus ricombinanti e infettare i pozzetti con una diluizione crescente dei virus in DME M1 libero da FBS un'ora dopo l'infezione. Rimuovere il terreno liquido e sovrapporre ogni pozzetto con lo 0,5% di agros in un terreno essenziale minimo completo tre giorni dopo l'infezione. Scegli le placche che mostrano una fluorescenza che è sia rossa che del colore del tag di fluorescenza scelto.

Amplificali di nuovo senza la selezione GPT. Scegli le placche che hanno perso la loro fluorescenza rossa diffusa, ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al tag scelto. Continuare la purificazione della placca senza selezione per ottenere uno stock puro di virus ricombinanti che hanno perso i geni di selezione M cherry e GPT, ma mantengono la fluorescenza localizzata corrispondente al tag scelto.

Valutare la purezza dei ceppi con un test della placca mirato a tutte le placche di un fenotipo di placca simile. Amplificare le scorte virali di prova in un monostrato di cellule BSC one. Dopo 24 ore dall'infezione, raschiare le cellule infette in 250 microlitri di DMEM centrifugare le cellule infette.

Rimuovere il supernat e risospendere il pellet di cella in 500 microlitri di SDS allo 0,1% in vortice tampone TE per liare le cellule. Quindi aggiungere 500 microlitri di fenolo, cloroformio, alcol isoamilico e invertire per mescolare la centrifuga. Raccogli la fase superiore e ripeti l'estrazione.

Quindi, per far precipitare il DNA dallo strato acquoso, aggiungere un millilitro di etanolo raffreddato al 100% e 50 microlitri di acetato di sodio. Mescolare per inversione e posizionare il campione a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per una notte. Dopo aver pellettato il DNA mediante centrifugazione, rimuovere tutto il liquido e asciugare all'aria il pellet di DNA e risus.

Sospenderlo in 50 microlitri di tampone TE. Usa questo modello di DNA genomico per lo screening PCR per l'inserimento virale. Genera virus ricombinanti con più tag come descritto nel protocollo di testo.

Questi virus vaccinici ricombinanti esprimono proteine marcate con marcatori fluorescenti mirati alle proteine strutturali virali, A tre e F 13, che fanno parte rispettivamente del nucleo interno del virus e dell'involucro esterno. I geni corrispondenti alle proteine localizzate del virione sono stati selezionati per visualizzare le particelle virali. A tre è una proteina centrale del virione vaccinico e F 13 è una proteina dell'involucro virale.

Viene anche mostrato che un virus a doppia marcatura con A 3 e F 13 marcati in fluorescenza in tempo reale può essere eseguita con un virus a doppia marcatura. In questo caso, la proteina del nucleo interno del virus vaccinia. Un tre è etichettato in rosso e la proteina F 13 dell'involucro esterno è etichettata in verde.

Le particelle virali non avvolte dalla fabbrica del virus sono visualizzate in rosso e il virione avvolto è rappresentato dalla colocalizzazione dei canali rosso e verde. L'analisi quantitativa è stata utilizzata per determinare l'efficienza della ricombinazione tra vettori ricombinanti e il genoma del virus vaccinia. L'efficienza della ricombinazione omologa dei vettori con il genoma del virus vaccinico può essere rilevata con un minimo di 70 regioni di omologia di coppie di basi.

Questo metodo è stato utilizzato per creare virus con più tag fluorescenti e/o più delezioni geniche. Questi sono stati impiegati nello studio del ciclo di vita infettivo del virus, del ruolo delle proteine virali nel sovvertire i sistemi di difesa dell'ospite, nonché delle interazioni con i processi di segnalazione dell'ospite. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come generare virus vaccinici ricombinanti utilizzando un metodo modulare nei tag utilizzati, meticoloso nella risoluzione dei ricombinanti desiderati e applicabile in una varietà di contesti di ricerca.