Name: Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2014-01-22T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Impara il profiling dei microRNA nel liquido cerebrospinale mediante PCR quantitativa in tempo reale. Questo metodo consente di analizzare 742 sequenze uniche e può essere adattato ad altri fluidi biologici, cellule coltivate o tessuti.

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Il progetto descritto è stato supportato da Award numero R01MH079751 (PI: F. Peruzzi) del National Institute of Mental Health. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiali dell&#39;Istituto Nazionale di Salute Mentale o il National Institute of Health.

Il protocollo che segue descrive la procedura standard per isolare RNA da CSF e di profilo microRNA utilizzando piastre PCR pronti. Si noti che l&#39;estrazione fase organica è facoltativo, e che un RNA carrier viene aggiunta al campione durante l&#39;estrazione garantire massimo recupero di RNA. Di conseguenza, non vi è alcuna necessità di quantificare l&#39;RNA. Nel complesso, una media di 6-8 piastre può essere eseguito in un giorno se il cDNA viene sintetizzato il giorno prima (circa 2 ore). L&#39;analisi dei dati viene eseguita quando tutti i campioni sono stati profilato e caricato nel software. A seconda del numero di campioni / gruppi o loro combinazione per il confronto, l&#39;analisi dei dati può richiedere da una a diverse ore. 1. RNA Estrazione L&#39;estrazione di RNA è stata eseguita da campioni di CSF, congelati a -80 ° C in aliquote fino all&#39;analisi. Per questa procedura è stato utilizzato il kit di isolamento Mirvana Parigi, seguendo strumento del produttoreZIONI per l&#39;isolamento di RNA totale. Si prega di notare che, sebbene l&#39;arricchimento per le piccole specie di RNA è possibile con questo kit, questo passaggio non è stato fatto e la procedura di estrazione RNA è conclusa dopo la fase di totale isolamento di RNA. Inoltre, sebbene il kit di isolamento Mirvana Parigi (come altri kit di isolamento dell&#39;RNA disponibili in commercio) non richiede estrazione organico, un protocollo per questa procedura sono disponibili sotto. Il protocollo per l&#39;estrazione dell&#39;RNA consiste di due fasi: 1.1. Estrazione biologico (non necessario se si utilizza Mirvana Parigi kit di estrazione RNA) 1.2.2. Isolamento RNA totale 1.1. Estrazione Organic 1.1.1. Preparare i reagenti <ol><li> Aggiungere 375 ml di 2-mercaptoetanolo a 2x Denaturing soluzione, e conservarlo a 4 ° C. </li></ol> 1.1.2. Preparare il CSF <ol><li> Scongelare ogni aliquota di CSF sul ghiaccio prima dell&#39;estrazione dell&#39;RNA. Aggiungere 1 mg di carrier RNA MS2 a 0,5 ml di liquor scongelato e delicatamentemescolare. Si noti che se l&#39;estrazione organica viene omesso, il vettore MS2 sarà aggiunto al campione prima dell&#39;isolamento dell&#39;RNA descritto in 1.2.2.1 seguito. </li><li> Mescolare 0,5 ml di 2x denaturazione soluzione a temperatura ambiente al CSF. </li><li> Aggiungere 1 ml di acido-fenolo: cloroformio al CSF più il 2x denaturazione Soluzione: assicurarsi di ritirata la fase inferiore contenente acido-fenolo: cloroformio, non il tampone acquoso che si trova sulla parte superiore della miscela. Inoltre, si noti che l&#39;acido-fenolo: cloroformio contiene fenolo, che è un veleno e un irritante, usare guanti ed altri dispositivi di protezione individuale quando si lavora con questo reagente. </li><li> Vortex per 30-60 secondi per mescolare. Per comodità, i 2 ml di campione / denaturazione soluzione / acido-fenolo: cloroformio mix sono divisi in due provette Eppendorf da 1,5 ml. </li><li> Centrifugare per 5 minuti a velocità massima (10.000 xg) a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione la fase acquosa (superiore) senza disturbare la fase inferiore o interfase e trasferirlo in unprovetta. Annotare il volume recuperato. </li></ol> 1.2. Isolamento dell&#39;RNA Si raccomanda di avere un banco dedicato, set di pipette e rastrelliere per la gestione di campioni di RNA. L&#39;area di lavoro e gli strumenti sono decontaminati mediante RNasi Zap spray e salviette prima di ogni esperimento. 1.2.1. Preparare i reagenti: <ol><li> Aggiungere 21 ml di etanolo al 100% miRNA Soluzione di Lavaggio 1 e 40 ml di etanolo al 100% di soluzione di lavaggio 2/3. Si prega di notare che il miRNA soluzione di lavaggio 1 contiene guanidio thiocyanate che è una sostanza potenzialmente pericolosa. </li></ol> 1.2.2. Isolamento RNA totale <ol><li> Aggiungere 1,25 volumi di temperatura ambiente 100% di etanolo alla fase acquosa dall&#39;estrazione organica e mescolare accuratamente. </li><li> Posizionare una cartuccia filtrante in uno dei tubi di raccolta. </li><li> Pipette non più di 700 ml di miscela lisato / etanolo sulla cartuccia del filtro. </li><li> Centrifugare per 30 secondi alla massimavelocità. Applicare la miscela superiore 700 microlitri nelle applicazioni successive allo stesso filtro. Gettare il flow-through dopo ogni centrifugazione e salvare il tubo di raccolta per le fasi di lavaggio. </li><li> Applicare 700 microlitri miRNA Wash Solution 1 alla cartuccia del filtro e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. </li><li> Applicare 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. Applicare un secondo da 500 microlitri soluzione di lavaggio 2/3 e centrifugare per 15 secondi alla massima velocità. Gettare il flusso attraverso dal tubo di raccolta e sostituire la cartuccia del filtro nello stesso tubo di raccolta. Spin il gruppo per 1 min a velocità massima per rimuovere residui di liquido dal filtro. </li><li> Trasferire la cartuccia del filtro in un tubo di raccolta fresca. Applicare 100 &amp; mu; L preriscaldata (a 95 ° C) acqua priva di nucleasi al centro del filtro, e chiudere il tappo. Centrifugare per 30 secondi a velocità massima per recuperare il RNA. </li><li> Raccogliere l&#39;eluato contenente RNA e conservarlo a -80 ° C per le applicazioni successive. </li><li> Quantificare 1 ml di RNA utilizzando lo spettrofotometro NanoDrop 2000C. Si noti che la quantificazione RNA può essere saltata se un vettore RNA viene aggiunta al campione durante l&#39;estrazione di RNA. In tal caso 8 pl di RNA sono sottoposti a sintesi di cDNA come descritto di seguito. </li></ol> 2. miRNA Profilo: qRT-PCR Protocol Il protocollo per miRNA profiling consiste di due fasi: <ol><li> First-strand sintesi del DNA </li><li> Real-time PCR di amplificazione </li></ol> 2.1. First-strand sintesi del DNA 2.1.1. Diluire stampo di RNA <ol><li> Regolare ciascuno dei campioni di RNA template ad una concentrazione di 5 ng / ml con acqua nucleasi gratuito. Se l&#39;RNA non è stato quantificato (vedere fase 1.2.2.9), poi 8 pl di RNA sono utilizzati per la sintesi di cDNA </li></ol> 2.1.2. Preparare i reagenti <ol><li> Scongelare delicatamente il tampone di reazione 5x e nucleasi acqua libera, e mettere immediatamente in ghiaccio. </li><li> Mescolare nel vortex. Risospendere il RNA spike-in con l&#39;aggiunta di acqua priva di 40 microlitri di nucleasi al tubo e mescolare nel vortex, lasciare in ghiaccio per 15-20 min. Immediatamente prima dell&#39;uso, rimuovere il mix enzima dal freezer, mescolare sfogliando le provette e disporli sul ghiaccio. Spin giù tutti i reagenti. </li></ol> 2.1.3. Configurazione inversa reazione di trascrizione <ol><li> Preparare la quantità richiesta di soluzione di lavoro RT in una provetta Eppendorf da 1,5 ml o equivalente (nelle proporzioni indicate nella Tabella 1, tranne per il modello RNA), mescolare nel vortex (1-2 sec max velocità), brevemente centrifugare ( usiamo un mini Eppendorf centrifuga con velocità fissa, 10 sec) e posizionarlo sul ghiaccio. Si noti che l&#39;RNA picco UniSp6-In viene aggiunto al campione prima della reazione RT (vedi Tabella 1). </li><li> Dispensare soluzione di lavoro RT in provette PCR priva di nucleasi. </li><li> Pipettare stampo di RNA in ciascun tubo. Nota: ricordatevi di calcolare il 10% di volume in eccesso / ogni reagente per pipettaggio e / o volume morto robotica. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Reagente </td><td> Panel I Volume (ml) </td><td> Panel I + II Volume (ml) </td></tr><tr><td> Tampone di reazione 5x </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr><tr><td> Acqua nucleasi libero </td><td> 9.9 </td><td> 19.8 </td></tr><tr><td> Mix enzimatico </td><td> 2.2 </td><td> 4.4 </td></tr><tr><td> UniSp6 RNA Spike-in template </td><td> 1.1 </td><td> 2.2 </td></tr><tr><td> Template RNA totale (5 ng / ml) </td><td> 4.4 </td><td> 8.8 </td></tr&gt; <tr><td> Volume totale </td><td> 22 </td><td> 44 </td></tr></tbody></table> Tabella 1. Invertire la configurazione reazione di trascrizione. </li></ol> 2.1.4. Mescolare e far girare i reagenti <ol><li> Mescolare la reazione delicatamente (1-2 sec) vortex per assicurare che tutti i reagenti siano ben amalgamati. Dopo la miscelazione, spin down (mini centrifuga Eppendorf con velocità fissa, 10 sec). </li></ol> 2.1.5. Incubare e inattivare a caldo <ol><li> Programmare una macchina PCR come segue: </li><li> Incubare per 60 min a 42 ° C </li><li> Calore inattivare la trascrittasi inversa per 5 minuti a 95 ° C </li><li> Immediatamente raffreddare a 4 ° C </li><li> Conservare a 4 ° C o congelare Nota: il protocollo può essere interrotto in questa fase. Il cDNA diluito può essere conservato a -20 ° C per 5 settimane (negozio opzionale a 4 ° C per 4 giorni). </li></ol><pclass = &quot;jove_step&quot;&gt; 2.2. Real-time PCR di amplificazione 2.2.1. Preparare i reagenti per Real-time PCR <ol><li> Posizionare cDNA (dal punto 2.1.5) sul ghiaccio. </li><li> Scongelare acqua libera e PCR Master mix nucleasi sul ghiaccio. Proteggere le fiale master mix per PCR dalla luce coprendoli con un foglio di alluminio. Immediatamente prima dell&#39;uso, mescolare la miscela master PCR vortex 1-2 secondi in una mini centrifuga e centrifugare a 1500 xg per 1 min. </li></ol> 2.2.2. Combina SYBR Green Master Mix, acqua e cDNA e aggiungere piastre PCR La seguente procedura è consigliata per evitare basse concentrazioni di cDNA di aderire alla superficie del tubo: <ol><li> Prima di rimuovere il sigillo piastra, brevemente centrifugare la piastra (s) in una centrifuga refrigerata a 1.500 xg per 1 min. </li><li> In un tubo da 15 ml, unire 2x PCR miscela master e acqua. Panel I: 2,000 microlitri 2x master mix e 1980 microlitri di acqua; Panel I + II: 4,000 microlitri 2x master mix e 3960 μ, L acqua. </li><li> Aggiungere 20 microlitri di cDNA (pannello I) o 40 microlitri di cDNA (pannello di I + II) e mescolare. </li><li> Mescolare delicatamente vortex 1-2 sec e spin down in una centrifuga refrigerata a 1.500 xg per 1 min. </li><li> Posizionare la PCR Master mix / cDNA mix in una pipetta multicanale serbatoio. Potrebbe essere necessario identificare un serbatoio che ha la lunghezza della pipetta multicanale. Ciò mantiene il livello di volume di abbastanza alto consentendo aliquote volume uguale in tutto il multicanale. Questo è critico verso gli ultimi aliquote. </li><li> Pipettare 10 microlitri miscela master PCR / cDNA miscela in ciascun pozzetto della piastra a 384 pozzetti usando una pipetta a 16 canali. </li><li> Sigillare la piastra con guarnizione ottica. </li><li> Spin piastra brevemente in una centrifuga refrigerata (1.500 xg per 1 min), per mescolare le soluzioni e rimuovere le bolle d&#39;aria. Nota: l&#39;esperimento può essere sospeso, a questo punto. Conservare le reazioni al riparo dalla luce a 4 ° C per un massimo di 24 ore. </li></ol> 2.2.3. Real-Time PCR Eseguire real-time PCR amplificazione e analisi della curva di melting secondo i parametri descritti nella tabella 2. <table border="1" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody><tr><td> Fase del processo </td><td> Impostazioni, Roche LC480 </td></tr><tr><td> Polymerase Attivazione / denaturazione </td><td> 95 ° C, 10 min </td></tr><tr><td> Amplificazione </td><td> 45 cicli di amplificazione a 95 ° C, 10 sec 60 ° C, 1 min Ramp-rate 1,6 ° C / sec Lettura ottica </td></tr><tr><td> Melting analisi della curva </td><td> Sì </td></tr></tbody></table> Tabella 2. In tempo reale le condizioni del ciclo di PCR utilizzando la Roche LightCycler 480. 2.3. Analisi in tempo reale dei dati di PCR In tempo reale analisi dei dati PCR è fatto con l&#39;Exiqon GenEx Professional 5.0, a seguito di tha raccomandato istruzioni. Il manuale GenEx step-by-step può essere scaricato all&#39;indirizzo <a href="http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf">http://www.exiqon.com/ls/Documents/Scientific/Exiqon-data-analysis-guide.pdf</a> L&#39;analisi dei dati è costituito da tre fasi: <ol><li> Importazione di dati </li><li> Pre-elaborazione dei dati </li><li> L&#39;analisi statistica </li></ol> 2.3.1. Importazione di dati <ol><li> Nel Roche LightCycler 480 selezionare il metodo di analisi nd derivato 2 e calcolare i valori Cq. I dati vengono esportati come un tavolo e salvati come file di testo. </li><li> Per importare i dati, aprire GenEx e fare clic sul pulsante di importazione guidata Exiqon e fare clic su &quot;Start&quot;. Seguire le istruzioni per selezionare il formato, strumento e file di layout di piastra (s). Si noti che i file di layout piastra (file excel) vengono scaricati dal sito web Exiqon ( <a href="http://www.exiqon.com/plate-layout-files">http://www.exiqon.com/plate-layout-files</a> ). </li><li> Import Pannelli I e II e fare clic su &quot;Avanti&quot;. </li><li> La tabella generata dopo file di importazione contiene colonne predefinite. I nomi dei campioni possono essere modificati e le colonne di classificazione possono essere aggiunti o rimossi in questa fase. Fare clic su &quot;Next&quot; quando avete finito. </li><li> Salvare i dati e caricare Editor dei dati. </li></ol> 2.3.2. Pre-elaborazione dei dati <ol><li> Come raccomandato dal Exiqon e GenEx, quando si confrontano più lastre la prima cosa da fare è quella di calibrare i dati tra le piastre scegliendo calibrazione inter-piastra dal menu pre-elaborazione. </li><li> Si raccomanda di eseguire le matrici miRNA nei funzionamenti triplicato. Se un miRNA non è presente in almeno due delle tre repliche sarà impostato come nonexpressed. </li><li> Nella fase successiva nella pre-elaborazione, impostare un cut-off. Definizione di un valore di cut off indica che i dati con un ciclo soglia (C t) superiore a questo valore vengono scartati. Nel presente esperimenti usando campione di fluido cerebrospinale, la off taglio è stato fissato a 39. Cirima, verranno eliminati tutti i campioni con C t superiore a 39 nelle tre repliche. Se un miRNA ha un C t&gt; 39 per una sonda (una replica su tre), che la lettura verrà sostituito con la media del C t per le altre due sonde, a condizione che siano entrambi sotto 39. </li><li> Definire geni di riferimento. GenEx Professional ha la possibilità di utilizzare geNorm e / o NormFinder per identificare i geni di riferimento. Selezionare una lista di miRNA che hanno valori simili Cq in tutti i campioni e corrono geNorm e / o NormFinder. Secondo questa analisi, nell&#39;esempio fornito qui, miR-622 e miR-1266 avevano valori più uniformi per i vari campioni e sono stati scelti come geni di riferimento (Figura 1). </li><li> Successivamente, i dati vengono normalizzati utilizzando i geni di riferimento ei valori ottenuti corrispondono alla ΔC t </li><li> Se reazioni di sintesi di cDNA sono stati eseguiti in triplicato, a questo punto i valori devono essere mediate. </li><li> Convalida foglio di rispostare le colonne vuote e quasi vuote. Nella finestra di pre-elaborazione selezionare &quot;Convalida patrimoniale&quot; e di applicare sulla Remove colonne vuote linea. Nella riga sotto, ha scelto la percentuale desiderata di dati validi e fare clic su Applica. Ad esempio, selezionare 100%, se si vuole confrontare solo miRNA comuni a tutti i campioni. </li><li> Gestire i dati mancanti. Selezionare &quot;dati mancanti&quot; dal menu Preprocessing e ha scelto una delle opzioni per gestire i dati mancanti. Questo passaggio è necessario. Si noti che GenEx vi darà errore se si tenta di caricare file che contengono dati mancanti non gestite. </li><li> Determinare la quantificazione relativa tra gruppi di campioni (per esempio. Esperimento rispetto al controllo). La quantificazione relativa tra i gruppi è calcolato utilizzando il metodo t ΔΔ C. In GenEx, fare clic sulla scheda di pre-elaborazione e selezionare quantificazione relativa. Nella finestra selezionare il gruppo di riferimento e premi applica. Si noti che per rappresentazioni grafiche e / o per ulteriori analisi statistiche, exprdati essione devono essere convertiti in una scala logaritmica. Nel menu di pre-elaborazione, selezionare log2. </li></ol> 2.3.3. Analisi statistica Software GenEx consente una vasta gamma di analisi statistiche, incluse T-test e ANOVA. <ol><li> Caricare il file mdf finale in GenEx e responsabile dei dati aperti. E &#39;fondamentale per selezionare i campioni o gruppi corretti di campioni per cui è eseguita l&#39;analisi statistica. </li><li> Selezionare &quot;Statistiche&quot; e scegliere l&#39;icona corrispondente alla prova desiderata. </li><li> Fare clic su &quot;Esegui&quot; nella finestra del pannello di controllo. Salvare i risultati come file Excel o mdf. </li></ol> 2.3.4. Profili di espressione I microRNA e campioni possono essere classificati, raggruppati e visualizzati sul calore mappe e dendrogrammi, come segue <ol><li> Caricare il file mdf finale in GenEx e responsabile dei dati aperti. Utilizzare questa finestra per selezionare e creare gruppi di campioni o miRNA. Fare clic su &quot;Applica&quot; quando hai finito. </li> &lt;li&gt; In alto a sinistra, selezionare grappolo superiore e fare clic sull&#39;icona heatmap </li><li> Nella finestra Pannello di controllo cliccare su &quot;Esegui&quot;. Il heatmap può essere salvato in vari formati come tiff o bmp, ma può anche essere copiato e modificato in base alle esigenze. </li></ol>

<ol><li>Pacifici, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebrospinal+fluid+miRNA+profile+in+HIV-encephalitis%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Physiol%22%5BJournal%5D)">Cerebrospinal fluid miRNA profile in HIV-encephalitis.</a> J. Cell. Physiol. 10, (2012).</li>
<li>Krol, J., Loedige, I., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+widespread+regulation+of+microRNA+biogenesis%2C+function+and+decay%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Genet.%22%5BJournal%5D)">The widespread regulation of microRNA biogenesis, function and decay.</a> Nat. Rev. Genet.. 11, 597-610 (2010).</li>
<li>Calin, G. A., Croce, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+signatures+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Rev.+Cancer%22%5BJournal%5D)">MicroRNA signatures in human cancers.</a> Nat. Rev. Cancer. 6, 857-866 (2006).</li>
<li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+microRNAs+in+serum%3A+a+novel+class+of+biomarkers+for+diagnosis+of+cancer+and+other+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Characterization of microRNAs in serum: a novel class of biomarkers for diagnosis of cancer and other diseases.</a> Cell Res. 18, 997-1006 (2008).</li>
<li>De Smaele, E., Ferretti, E., Gulino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNAs+as+biomarkers+for+CNS+cancer+and+other+disorders%5BTitle%5D)+AND+%22Brain+Res%22%5BJournal%5D)">MicroRNAs as biomarkers for CNS cancer and other disorders.</a> Brain Res. 1338, 100-111 (2010).</li>
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<li>Kosaka, N., Iguchi, H., Ochiya, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Circulating+microRNA+in+body+fluid%3A+a+new+potential+biomarker+for+cancer+diagnosis+and+prognosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Sci%22%5BJournal%5D)">Circulating microRNA in body fluid: a new potential biomarker for cancer diagnosis and prognosis.</a> Cancer Sci. 101, 2087-2092 (2010).</li>
<li>Lu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((MicroRNA+expression+profiles+classify+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">MicroRNA expression profiles classify human cancers.</a> Nature. 435, 834-838 (2005).</li>
<li>Shah, A. A., Leidinger, P., Blin, N., Meese, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((miRNA%3A+small+molecules+as+potential+novel+biomarkers+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Med.+Chem%22%5BJournal%5D)">miRNA: small molecules as potential novel biomarkers in cancer.</a> Curr. Med. Chem. 17, 4427-4432 (2010).</li>
<li>Blondal, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assessing+sample+and+miRNA+profile+quality+in+serum+and+plasma+or+other+biofluids%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Assessing sample and miRNA profile quality in serum and plasma or other biofluids.</a> Methods. 59, 1-6 (2013).</li>
<li>Jensen, S. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+two+commercial+global+miRNA+expression+profiling+platforms+for+detection+of+less+abundant+miRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Genomics%22%5BJournal%5D)">Evaluation of two commercial global miRNA expression profiling platforms for detection of less abundant miRNAs.</a> BMC Genomics. 12, 435 (2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

MicroRNA sono piccoli RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica inibendo la traduzione e / o la promozione di degradazione dell&#39;mRNA 2. Grazie alla loro elevata stabilità in condizioni cell-free, microRNA sono stati rilevati in molti fluidi corporei. Inoltre, il profilo di espressione dei microRNA distinta è stata correlata con la fase e / o la progressione in una varietà di tumori umani 3-9. Ci sono diversi strumenti a disposizione al profilo microR...

MicroRNAs appartengono alla famiglia di piccole dimensioni (21-23 nt in lunghezza) RNA non codificanti che regolano l&#39;espressione genica post-trascrizionale. microRNA possono essere secreti nello spazio extracellulare dove sembrano essere relativamente stabile. Mentre determinare cambiamenti nell&#39;espressione miRNA può essere un passo importante verso l&#39;identificazione di biomarcatori, eseguire profili miRNA e gestire una grande quantità di dati può essere intimidatorio. Qui, descriviamo un protocollo per determinare cambiamenti nell&#39;espressione miRNA nel liquido cerebrospinale (applicabile ad altri fluidi corporei) da un tempo reale sensibili PCR. Noi descriviamo anche l&#39;uso di software per l&#39;analisi dei dati, compresa l&#39;analisi statistica e rappresentazione grafica dei risultati. L&#39;intera procedura è relativamente semplice e lineare e, a seconda del numero di campioni da analizzare e il numero di macchine di PCR in tempo reale disponibili, anche relativamente veloce. La parte sperimentale richiede precisione nella movimentazioneRNA e pipettaggio in piastre da 384 pozzetti, mentre la sezione di analisi dei dati utilizzando GenEx richiede alcune conoscenze di base in informatica e statistica.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Tabella 3. Elenco delle apparecchiature.</td></tr><tr><td> Finnpipette Novus Multichannel Pipetter </td><td>Thermo Scientific</td><td>HH05279</td><td></td></tr><tr><td> Finntip Pipette Tips </td><td>Thermo Scientific</td><td>9400613</td><td></td></tr><tr><td> Thermal Cycler C1000 </td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 0,2 ml a basso profilo, Provette per PCR trasparenti </td><td>Biorad</td><td>TLS0801</td><td></td></tr><tr><td> Flat Cap Strips </td><td>Biorad</td><td>TLS0803</td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Real-Time PCR System</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480 Sealing Foil</td><td>Roche</td><td>04 729 757 001</td><td></td></tr><tr><td> Centrifuga refrigerata 5804R </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Rotore a secchio oscillante, 4 posti </td><td>Eppendorf</td><td>A-4-44</td><td></td></tr><tr><td> Mini centrifuga da banco </td><td>Fisher</td><td>05-090-100</td><td></td></tr><tr><td> Vortice da banco </td><td>Fisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td> 1,5 ml Provette per microcentrifuga, sterilizzate </td><td>Fisher</td><td>02-681-5</td><td></td></tr><tr><td> Serbatoio reagenti Matrix, 25 ml </td><td>Thermo Scientific</td><td>8093</td><td></td></tr><tr><td> Thermomixer Confort </td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bench-Top Mini Centrifuge Sigma 1-15</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td> Vortice da banco </td><td>Velp Scientifica</td><td>F202A0173</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Tabella 4. Elenco dei reagenti.</td></tr><tr><td> Kit universale di sintesi del c-DNA, 16-32 rxns </td><td>Exiqon</td><td>203300</td><td></td></tr><tr><td> SYBR Miscela master verde, Universal RT, 25 ml </td><td>Exiqon</td><td>203400</td><td></td></tr><tr><td> Acqua distillata ultrapura Dnase, Senza RNA </td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td> MicroRNA Pronto all'uso PCR Pannelli umani (I+II) V2.R </td><td>Exiqon</td><td>203608<</td><td></td></tr><tr><td>p>mirKit di isolamento miRNA Vana, 40 isolamenti</td><td>Ambion</td><td>AM1556</td><td></td></tr><tr><td> MS2 RNA carrier </td><td>Roche Applied Science</td><td> 10165948001</td><td></td></tr><tr><td>2-mercaptoetanolo 98%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3148-25ml</td><td></td></tr><tr><td> Etanolo 100% </td><td>Carlo Erba</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td>Qiagen</td><td>1039480</td><td></td></tr><tr><td>RNAsi Zap</td><td>Ambion</td><td>AM9780</td><td></td></tr></tbody></table>

liquido cerebrospinale microrna profiling utilizzando quantitativa real time pcr

Cerebrospinal Fluid MicroRNA Profiling Using Quantitative Real Time PCR

<html> MicroRNA (miRNA) costituiscono uno strato potente di regolazione genica guidando RISC a bersaglio siti posizionati su mRNA e, di conseguenza, modulando la loro repressione traduzionale. Cambiamenti nell&#39;espressione miRNA hanno dimostrato di essere coinvolti nello sviluppo di tutte le principali malattie complesse. Inoltre, recenti scoperte hanno mostrato che i miRNAs possono essere secrete nell&#39;ambiente extracellulare ed entrano nel flusso sanguigno e altri fluidi corporei dove possono circolare con elevata stabilità. La funzione di tale microRNA circolanti rimane in gran parte sfuggente, ma approcci sistematici ad alto rendimento, come miRNA array profiling, hanno portato all&#39;identificazione di firme miRNA in diverse condizioni patologiche, tra cui le malattie neurodegenerative e alcuni tipi di tumori. In questo contesto, l&#39;identificazione di miRNA profilo di espressione nel fluido cerebrospinale, come riportato nel nostro studio recente, rende miRNA candidati interessanti per analisi biomarker. _content &quot;&gt; Ci sono diversi strumenti disponibili per il profiling microRNA, come microarrays, quantitativa real-time PCR (qPCR), e sequenziamento profondo. Qui, descriviamo un metodo sensibile al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale dal quantitativa real-time PCR. noi utilizzato i pannelli umani Exiqon microRNA pronti per l&#39;uso PCR I e II V2.R, che consente il rilevamento di 742 unici microRNA umani. Abbiamo eseguito gli array in un parchetto in triplicato e abbiamo elaborato e analizzato i dati utilizzando il software GenEx Professional 5. Usando questo protocollo, abbiamo profilato successo microRNA in vari tipi di linee cellulari e cellule primarie, CSF, plasma e tessuti inclusi in paraffina fissati in formalina.

I risultati di questo studio sono stati pubblicati in precedenza 1. Figura 1 mostra i risultati dell&#39;analisi dei microRNA riferimento candidati usando l&#39;applicazione di geNorm. Di conseguenza, due microRNA, miR-622 e miR-1266, sono stati identificati i geni di riferimento e sono stati usati per normalizzare i valori di miRNA. Per lo studio QCS avevamo tre gruppi di campioni: da HIV (n = 10), HIVE (n = 4), e l&#39;HIV +, senza encefalite (...

Descriviamo un protocollo di PCR in tempo reale al profilo microRNA nel fluido cerebrospinale (CSF). Con l&#39;eccezione di protocolli di estrazione di RNA, la procedura può essere estesa a RNA estratto da altri fluidi corporei, cellule coltivate, ei campioni di tessuto.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

MicroRNAs (miRNAs) constitute a potent layer of gene regulation by guiding RISC to target sites located on mRNAs and, consequently, by modulating their ...

L'obiettivo generale di questa procedura è profilare i microRNA nei liquidi cerebrospinali mediante PCR quantitativa e analizzare i dati utilizzando il software professionale Gen X. Questo viene realizzato isolando innanzitutto l'RNA totale da campioni di liquido cerebrospinale. Il secondo passaggio consiste nell'eseguire la trascrizione inversa al fine di trascrivere gli RNA in cDNA.Successivamente, i cDNA vengono mescolati con una miscela master contenente cyber green e caricati in piastre da 384 pozzetti contenenti primer per 742 sequenze uniche, quindi amplificati mediante PCR in tempo reale. L'ultimo passaggio consiste nell'analizzare i dati ottenuti dall'amplificazione in tempo reale. Infine, i risultati possono essere espressi come variazione di fold, aumento o diminuzione rispetto a un controllo, e visualizzati in diverse rappresentazioni grafiche.Il principale vantaggio della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti, come gli array su chip, è che il nostro metodo è altamente sensibile e richiede una quantità minima di RNA. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo potranno incontrare difficoltà a causa dell'elevata quantità di dati generati e dell'utilizzo

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Dimostreremo la configurazione e l'analisi di pre-microRNA 96-array e per QPCR usando un robot così come a mano con una pipetta multicanale Thermo Scientific Matrix.

Profilatura di pre-micro-RNA e microRNA con Quantitative Real-time PCR (qPCR) Array

Qui descrivere un ottimizzato trascrittasi inversa multiplex PCR quantitativa (QRT-PCR) protocollo in combinazione con una piattaforma microfluidica come un efficace costi e tempi high-throughput screening per microRNA (miRNA) livelli di espressione, soprattutto quando si lavora con quantità limitate di campione.

Alta MicroRNA profiling Throughput: Multiplex Ottimizzato qRT-PCR a scala nanoliter sul Fluidigm dinamica IFCS ArrayTM

Quantitativa reale tempo di reazione a catena della polimerasi (qPCR) è un metodo rapido e sensibile per indagare i livelli di espressione di microRNA (miRNA vari) molecole in campioni tumorali. Usando questo metodo di espressione di centinaia di molecole diverse miRNA possono essere amplificati, quantificati e analizzati utilizzando lo stesso modello cDNA.

Rilevamento MicroRNA in tumori della prostata dal Quantitative Real-time PCR (qPCR)

Microglia risiedono macrofagi che forniscono la prima linea di difesa e sorveglianza immunitaria del sistema nervoso centrale. I microRNA sono molecole regolatrici che svolgono un ruolo importante in molti processi fisiologici tra cui l'attivazione e la differenziazione dei macrofagi. In questo articolo, si descrive il metodo per la misurazione dei microRNA in cellule microgliali.

Rilevamento dei microRNA nella microglia da Real-time PCR in CNS normale e durante neuroinfiammazione

Molecular segnalazione sia attraverso gli estrogeni e microRNA sono fondamentali nello sviluppo del cancro al seno e la crescita. Estrogeni attiva i recettori degli estrogeni, che sono fattori di trascrizione. Molti fattori di trascrizione in grado di regolare l'espressione dei microRNA, e microRNA regolati dagli estrogeni possono essere profilato utilizzando diverse tecniche su larga scala.

Profiling di microRNA regolati dagli estrogeni in cellule di carcinoma mammario

Con l'intento di caratterizzare i cambiamenti nei miRNA su cellule staminali neurali umane differenziate (hNSC), descriviamo la differenziazione delle hNSC su un sistema tridimensionale, la valutazione dei cambiamenti nell'espressione dei microRNA mediante array PCR di miRNA e l'analisi computazionale per la previsione del bersaglio dei miRNA e la sua convalida mediante doppio saggio della luciferasi.

Differenziazione di una linea di cellule staminali neurali umane in Tre Culture dimensionali, Geni Analisi di MicroRNA e putativo di destinazione

MicroRNA circolanti sono recentemente emersi come biomarcatori promettenti e innovativi per vari tipi di cancro e di altre malattie. L'obiettivo di questo articolo è quello di discutere di tre diverse piattaforme di PCR real-time sonda-based e metodi che sono disponibili per quantificare e determinare l'abbondanza dei microRNA circolanti.

Base-Probe Real-time PCR Approcci per la misurazione quantitativa dei microRNA

Viene descritto un metodo sensibile e accurato per la quantificazione di microRNA privi di cellule utilizzando una chimica basata su coloranti e una tecnologia PCR digitale a goccioline.

Di circolazione MicroRNA Quantificazione Utilizzando DNA-binding Dye Chimica e di gocce Digital PCR

Qui presentiamo un protocollo per la rilevazione dell'espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto utilizzando la reazione a catena di polimerasi reattiva-trasversale in tempo reale. Questo metodo è adatto allo studio del profilo di espressione di microRNA nella membrana peritoneale del ratto in diverse condizioni patologiche.

Rilevamento dell&#39;espressione di microRNA nella membrana peritoneale dei ratti usando il quantitativo PCR in tempo reale

Questo rapporto descrive un protocollo per misurare i livelli assoluti di miRNA al plasma, usando trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR, con o senza pre-amplificazione. Questo protocollo offre una migliore comprensione della quantità di plasma Mirna e permette la valutazione qualitativa dei dati corrispondenti da diversi studi o laboratori.

Quantificazione assoluta dei livelli di MicroRNA del Plasma nella scimmia cynomolgus, mediante trascrizione d'inversione quantitativa Real-Time PCR

Impara il profiling dei microRNA nel liquido cerebrospinale mediante PCR quantitativa in tempo reale. Questo metodo consente di analizzare 742 sequenze uniche e può essere adattato ad altri fluidi biologici, cellule coltivate o tessuti.

Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

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