Liquido cerebrospinale MicroRNA profiling Utilizzando quantitativa Real Time PCR

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di profilare i microRNA nei liquidi cerebrospinali mediante PCR quantitativa e di analizzare i dati utilizzando il software professionale Gen X. Ciò si ottiene isolando prima l'RNA totale da campioni di liquido cerebrospinale. Il secondo passo consiste nell'eseguire la trascrizione inversa per trascrivere gli RNA in CDNA.

Successivamente, i CDNA vengono miscelati con una miscela master cyber green caricata in piastre da 384 pozzetti contenenti primer per 742 sequenze uniche e amplificati utilizzando la PCR in tempo reale. Il passaggio finale consiste nell'analizzare i dati acquisiti dall'amplificazione in tempo reale. In definitiva, i risultati possono essere espressi come cambio di piega, aumento o diminuzione su un controllo e visualizzati in varie rappresentazioni grafiche.

Quindi il vantaggio principale della nostra tecnica rispetto ai metodi esistenti come gli array di chip è che il nostro metodo è altamente sensibile e richiede una quantità minima di RNA. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa dell'elevata quantità di dati generati e dell'uso del software per l'analisi dei dati. Per prima cosa, spruzzare l'area di lavoro e le pipette con RNA Zap.

Per iniziare, la sintesi del CDNA diluisce i campioni di RNA stampo a una concentrazione di cinque nanogrammi per microlitro con acqua priva di nucleasi. Quindi, posizionare delicatamente il tampone di reazione five x sul ghiaccio per scongelare. Quindi aggiungere 40 microlitri di acqua priva di nucleasi al picco di RNA per risospendere il reagente, agitare il tubo e lasciarlo in ghiaccio per 15-20 minuti.

Quindi, togliete gli enzimi dal congelatore, muovete i tubi e metteteli sul ghiaccio. Inoltre, una volta che tutti i reagenti si sono scongelati, girali rapidamente verso il basso. Preparare la soluzione di lavoro della trascrittasi inversa in una provetta eph da 1,5 millilitri aggiungendo l'enzima tampone di reazione five x.

Mescolare l'acqua priva di nucleasi e la spike di RNA nel modello utilizzando le proporzioni indicate nella tabella uno. Quindi, mescolare la soluzione di lavoro facendola vorticare per uno o due secondi alla massima velocità. Far girare brevemente la soluzione per 10 secondi, quindi erogare la soluzione di lavoro in provette PCR prive di nucleasi.

Quindi aggiungere l'RNA stampo direttamente nelle provette PCR. Agitare delicatamente la reazione per uno o due secondi per assicurarsi che tutti i reagenti siano accuratamente miscelati e far girare le provette per 10 secondi. Posizionare il campione nella macchina PCR e inserire le impostazioni mostrate qui.

Quindi avvia il programma dopo la retrotrascrizione. Il CDNA è pronto per l'amplificazione PCR in tempo reale e può essere conservato a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius per un massimo di cinque settimane. Per iniziare l'amplificazione PCR in tempo reale, posizionare prima il CDNA e la miscela master PCR sul ghiaccio.

Per scongelare proteggere le fiale di PCR master mix dalla luce coprendole con un foglio di alluminio durante lo scongelamento. Una volta scongelato il vortice, il master PCR si mescola per uno o due secondi. Quindi, unire 2000 microlitri di due master mix XPCR e 1.980 microlitri di acqua in un tubo conico da 15 millilitri.

Aggiungere 20 microlitri di CDNA alla miscela e agitare delicatamente le soluzioni per uno o due secondi. Quindi centrifugare le soluzioni in una centrifuga refrigerata a 1.500 volte G per un minuto a quattro gradi Celsius. Posizionare quindi la miscela di reazione PCR in un serbatoio per pipette multicanale.

Far girare brevemente le piastre pronte all'uso in una centrifuga refrigerata a 1.500 volte G prima di rimuovere il sigillo della piastra. Quindi erogare 10 microlitri della miscela master PCR contenente CD NA in ciascun pozzetto di una piastra da 384 pozzetti. Utilizzando una pipetta a 16 canali e sigillare la piastra con una pellicola sigillante ottica.

Dopo aver aggiunto la miscela master, centrifugare brevemente la piastra in una centrifuga refrigerata a 1, 500 volte G per tirare la soluzione sul fondo dei pozzetti. Mescola i campioni e rimuovi le bolle d'aria per mettere in pausa l'esperimento. A questo punto, conservare le reazioni in un'area protetta dalla luce a quattro gradi Celsius per un massimo di 24 ore.

Successivamente, eseguire l'amplificazione PCR in tempo reale e l'analisi della curva di fusione seguendo i parametri dettagliati nella tabella due. Per iniziare l'analisi, selezionare il metodo di analisi della derivata seconda nel Light Cycler Roche. Quindi calcolare il ciclo di quantificazione o i valori CQ.

Esporta i dati come tabella e salvali come file di testo. Quindi, importa i dati in Gen X facendo prima clic sul pulsante della procedura guidata di importazione gon e quindi facendo clic su Avvia nella finestra successiva, seleziona il formato dei file di layout dello strumento e della piastra. I file Excel del layout delle lastre possono essere scaricati dal sito web GON.

Quindi importa il pannello uno e fai clic su Avanti. La tabella generata dopo l'importazione del file contiene colonne predefinite, modifica i nomi degli esempi e aggiunge o rimuove colonne di classificazione in questo passaggio. Fai clic su Avanti quando hai finito e salva i dati.

Quindi caricalo nell'editor di dati Innanzitutto, calibra i dati tra le piastre scegliendo INTERPLATE calibration dal menu di pre-elaborazione per assicurarti che tutte le piastre vengano calcolate utilizzando gli stessi parametri. Quindi, definire un valore di cutoff che eliminerà i dati superiori al ciclo di soglia o al ct. Se un micro RNA ha una TC maggiore per una replica su tre, tale lettura verrà sostituita con la media della TC delle altre due sonde.

Definisci i geni di riferimento selezionando un elenco di microRNA che hanno valori CQ simili in tutti i campioni ed eseguono la norma genica. Successivamente, normalizzare i dati utilizzando i geni di riferimento ottenuti. I valori risultanti corrisponderanno al delta ct.

Per rimuovere le colonne vuote e quasi vuote, aprire la finestra di pre-elaborazione e selezionare Convalida foglio, quindi selezionare Applica nella riga Rimuovi colonne vuote nella riga seguente. Scegliere la percentuale desiderata di dati validi e fare clic su Applica. Selezionare 100% se si desidera confrontare solo i microRNA comuni a tutti i campioni.

Carica il file MDF finale in Gen X e apri il data manager per classificare il cluster e visualizzare microRNA e campioni su mappe di calore e dendrogrammi. Quindi seleziona e crea gruppi di campioni e fai clic su Applica quando hai finito. Successivamente, nella finestra del pannello di controllo, fare clic su Esegui.

Salvare la mappa termica nel formato desiderato, ad esempio TIFF o bitmap, quindi copiare e modificare la mappa termica in base alle esigenze. Questa barra grafica è stata ottenuta dall'applicazione della norma G all'interno della Gen X per analizzare 10 possibili geni di riferimento del micro RNA. Questi risultati indicano che MIR 622 e MI 1, 266 sono i microRNA più stabilmente espressi.

Il box plot mostrato qui mostra la distribuzione dei dati per ciascuno degli 11 microRNA statisticamente significativi all'interno dei gruppi HIVE e HIV plus senza encefalite. In ogni colonna, il grafico indica la mediana e il primo e il terzo quartile, insieme ai valori massimo e minimo. Seguendo questa procedura, la profilazione minerale può essere eseguita su qualsiasi fluido corporeo, campioni di tessuto e cellule in coltura.